Cristina Legnani, Nicola Ciavarella

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1 La trombofilia e i suoi percorsi diagnostici Cristina Legnani, Nicola Ciavarella Milano, 9 Giugno 2011

2 Quali alterazioni trombofiliche ricercare Quali test eseguire Quando eseguire i testt Quali soggetti esaminare Quali soggetti esaminare Caratteristiche dei Centri

3 Quali alterazioni trombofiliche ricercare

4 Quali alterazioni trombofiliche ricercare Difetto di Antitrombina Difetto di Proteina C Difetto di Proteina S Mutazione Fattore V Leiden Mutazione G20210A della protrombina Lupus Anticoagulant e anticorpi antifosfolipidi

5 Altre alterazioni trombofiliche/ fattori di rischio Disfibrinogenemia Aumento Fattore VIII Iperomocisteina (opzionale per tromboembolia venosa e complicanze gravidanza, da eseguire per patologia arteriosa)

6 Test da non eseguire Polimorfismi della MTHFR PAI-1 (dosaggio e polimorfismi) Fattore XIII (dosaggio e polimorfismi) Plasminogeno e t-pa TAFI TFPI Cofattore eparinico II Fattore VII, IX, XI, XII e altri Polimorfismi della Trombomodulina Aplotipo HR2

7 Raccomandato l uso di un profilo Comprende TUTTI i test t per l identificazione delle alterazioni trombofiliche accertate - migliore interpretazione dei risultati di lab - migliore valutazione del rischio Può essere e aggiornato ato in base ai dati della letteratura Evita la richiesta di test non appropriati o test non necessari

8 Livelli di Proteina S in soggetti portatori della mutazione Fattore V Leiden % A B C D E F Metodi

9 Alterazioni combinate: incidenza di TEV PC F.V PC + F.V TEV (%) Incidenza AT F. V AT + F.V (Koeleman et al., Blood 1994) 100 TEV (%) Incidenza (Van Boven et al, Thromb Haemost 1996)

10 Richiesta test non appropriati/non necessari Dosaggi funzionali Proteina C e Proteina S Dosaggi immunologici Proteina C e Proteina S totale Ricerca mutazione Fattore V Leiden e G20210A Protrombina Dosaggi coagulativi Fattore V e II Ricerca LAC ma non degli anticorpi ACA e anti GPI Dosaggio omocisteina Ricerca mutazione C677T della MTHFR

11 Omocisteina plasmatica: variante termolabile della MTHFR µmo ol/l Ala/Ala Val/Ala Val/Val Ala/Ala Val/Ala Val/Val Folati < 15.4 nmol/l Folati 15.4 nmol/l La mutazione in forma omozigote: La mutazione in forma omozigote: Può essere causa di iperomocisteinemia moderata (se folati bassi) Non è stata inequivocabilmente identificata come fattore di rischio indipendente per trombosi

12 Conferma di una alterazione Ripetere dosaggio AT, PC e PS in caso di valori alterati su un campione indipendente Diagnosi di eredofamiliarità solo se difetto presente in almeno un altro consanguineo Ripetere i test per LAC, ACA e anti ß2 GPI dopo almeno 12 settimane Riconfermare la positività per la mutazione Riconfermare la positività per la mutazione su un secondo campione

13 Test genetici Errore diagnostico Mutazione R506Q Fattore V Leiden Mutazione G20210A della Protrombina 3-6% (15-17% 17% per omozigosi) Preston et al, 1999; Hertzberg et al, 2005; Tripodi et al, 2002 e 2005 Risultati migliorati negli ultimi anni ma errore diagnostico rimane elevato ( 1-4%)

14 Quali test eseguire

15 Quali test eseguire (1) Antitrombina (dosaggio funzionale cromogenico) Proteina C (dosaggio funzionale cromogenico) Proteina S (immunologico della frazione libera) Resistenza PC attivata o mutaz. Fattore V Leiden Mutaz. G20210A della protrombina Ricerca LAC (Pengo et al, JTH 2009) Dosaggio anticorpi i anticardiolipina i e anti ß2 Glicoproteina I (IgG ed IgM) Raccomandati anche PT, aptt ed emocromo, completo

16 Quali test eseguire (2) Proteina C (dosaggio funzionale coagulativo) Proteina S (dosaggio funzionale coagulativo, se usato come test di 1 livello necessaria una conferma con test t immunologico della frazione libera) Dosaggio immunologico di Antitrombina, Proteina C e Proteina S totale (per tipizzazione difetti)

17 Quando eseguire i test

18 Alterazioni acquisite che possono determinare false positività Erronea diagnosi di presenza di una alterazione trombofilica Epatopatia, malnutrizione, estese ustioni, malattie infiammatorie intestinali, terapia anticoagulante, ridotto assorbimento/assunzione n ione vitamina K, gravidanza a e trattamento ormonale, fase acuta di un processo trombotico, CID, reazione emolitica da trasfusione, tumori, terapia con L-asparaginasi, sindrome nefrosica e insufficienza renale, terapia eparinica, periodo post- operatorio, ARDS, plasma exchange, emorragia massiva, aumento FVIII, FX, Fattore II e XII

19 Modificazioni aspecifiche dovute a: Evento acuto Terapia eparinica Anticoagulanti orali Gravidanza Estroprogestinici Riduzione AT, PC, PS, Omocys; Aumento FVIII Riduzione AT; Interferenza su dosaggio PC, PS, test APCR e ricerca LAC Riduzione PC e PS; Interferenza su test APCR Riduzione PS, Omocys; Aumento PC e FVIII; Alterazione test APCR Riduzione PS, Omocys; Aumento FVIII; Alterazione test APCR

20 Proteina S e gravidanza Proteina S ridotta in 80/139 (57.6%) donne esaminate durante la gravidanza 62 donne riesaminate dopo il puerperio => tutte con Proteina S normale 1 trim. 2 trim. 3 trim. Ridotta Proteina S 57.9% 59.4% 58.1%

21 Proteina S e estroprogestinici Proteina S ridotta 113/753 donne esaminate durante un trattamento estroprogestinico (15.0%) 76 donne riesaminate dopo la sospensione => tutte con Proteina S normale

22 Tchaikovsky, Women s Tchaikovsky, Women s Health 2006

23 Alterazioni acquisite che possono determinare false negatività Mancata diagnosi di carenza di Proteina C Gravidanza e trattamento ormonale, sindrome nefrosica, diabete e cardiopatia ischemica

24 Proteina C e gravidanza (1) Donna di 36 anni esaminata alla 25 settimana di gravidanza Il padre in trattamento anticoagulante per 2 pregressi episodi di TEV (1 TVP prossimale a 30 anni dopo gesso e recidiva idiopatica di TVP a 62 anni) Livello della Proteina C durante la gravidanza Livello della Proteina C durante la gravidanza = 66% (n.v. > 68%)

25 Proteina C e gravidanza (2) 2 anni dopo il parto: Proteina C attività = 47% Proteina C antigene = 51% Conferma del difetto di Proteina C nello Conferma del difetto di Proteina C nello zio paterno

26 Quando NON eseguire i test Trombosi acuta (eseguire la diagnostica per la HIT, se presente sospetto) Durante le terapie anticoagulanti Gravidanza o terapia ormonale In tutte le condizioni associate ad aumento delle proteine della fase acuta (post-chirurgia, mal. infiammatorie) Se indispensabile, test genetici i sempre eseguibili, ma in genere non sono consigliabili screening parziali

27 Quando eseguire i test Dopo 3 mesi dall evento trombotico venoso/arterioso Dopo almeno 48 ore dalla sospensione di eparina e derivati Dopo 30 giorni dalla sospensione della terapia anticoagulante orale Dopo almeno 2 mesi dal parto Dopo almeno 1 mese dalla sospensione della terapia ormonale

28 Quali soggetti esaminare

29 Quali soggetti esaminare (1) Soggetti sintomatici per: Uno o più precedenti episodi di TEV -idiopatica - dopo stimoli di modesta entità - con storia familiare positiva per TEV Trombosi venose superficiali recidivanti su vena sana Trombosi venose in sedi non usuali (escluse le occlusioni venose retiniche) occlusioni venose retiniche) Necrosi cutanea indotta da anticoagulanti orali Porpora fulminante neonatale

30 Quali soggetti esaminare (2) Soggetti sintomatici per: Patologia arteriosa in età giovanile (< 55 anni) Limitatamente a: - LAC - Anticorpi anticardiolipina, anti ß2 Glicoproteina I (IgG ed IgM) - Omocisteina Le alterazioni trombofiliche eredofamiliari possono essere ricercate solo in casi selezionati (es. pazienti con pregresso ictus o TIA secondario a FOP)

31 Quali soggetti esaminare (3) Soggetti sintomatici per: Pregressa patologia della gravidanza - aborti ricorrenti ( 3, o 2 con almeno un cariotipo fetale normale) - morte endouterina fetale - pre-eclampsia - HELP syndrome -ritardo di accrescimento intrauterino t i - abruptio placentae Linee guida SISET, 2009 (raccomandazioni con diversi livelli di evidenza)

32 Quali soggetti esaminare (4) Soggetti asintomatici Non indicato in soggetti non selezionati per prevenire episodi tromboembolici e/o complicanze della gravidanza Indicato prima dell esposizione a situazioni a rischio trombotico ti particolare (terapia ormonale, gravidanza, ecc) in soggetti: con storia familiare chiaramente positiva per tromboembolia venosa (ma non per complicanze della gravidanza) familiari di 1 grado di portatori di trombofilia eredofamiliare

33 Familiari di portatori di trombofilia eredofamiliare Screening trombofilico completo Eseguire la ricerca della alterazione dimostrata nel proposito e almeno anche la ricerca delle due mutazioni i (Fattore V Leiden e G2021A della protrombina)

34 Caratteristiche dei Centri

35 Complessità del problema Problemi di standardizzazione fase preanalitica (raccolta, manipolazione e conservazione del prelievo) Problemi di scelta dei metodi, relativa scarsa riproducibilità e probabilità di elevati errori diagnostici Possibili rilevanti interferenze di parecchi fattori sui risultati ti dei test t (patologie concomitanti, farmaci, ecc)

36 Test funzionali e immunologici: coefficienti di variazione inter-labs CV % Antitrombina 5-10% Proteina C < 10% Proteina S 20-25% (test coagulativi) APCR < 15% (frazione libera) < 20% (test 1 generazione) < 15% (test 2 generazione) LAC 40-50% ACA/anti ß2 GPI 40-50% Omocisteina < 20% In generale la riproducibilità è peggiore per valori alterati o borderline

37 Test funzionali e immunologici: errore diagnostico Errore diagnostico (% falsi positivi) Antitrombina < 5% Proteina C < 10% Proteina S < 20% APCR <5% LAC < 20% ACA/anti ß2 GPI? Omocisteina < 15%

38 Cosa i centri devono garantire (1) La presenza di personale ben addestrato, formato e con esperienza nel campo dell emostasi La determinazione i locale l i range di riferimento i ed la calibrazione del plasma usato per le curve contro uno standard d internazionale i (se disponibile) ibil L esecuzione di un controllo di qualità interno per almeno due livelli (normale e patologico) La costante partecipazione a specifici programmi di p p p p g valutazione esterna di qualità

39 Cosa i centri devono garantire (2) L esecuzione dei test solo previa raccolta dell anamnesi del paziente (farmaci, patologie associate, storia personale/familiare di trombosi) Il fornire a conclusione dell iter diagnostico una relazione/commento con esplicita interpretazione dei risultati e/o eventuali approfondimenti da eseguire per raggiungere una diagnosi conclusiva Il fornire un adeguato counseling per informazione equilibrata, evitare allarmismi, i misure profilattiche da adottare in situazioni a rischio, ecc

40

41 Coordinamento dei Centri per la Trombofilia della regione Emilia-Romagna Bologna Ferrara Modena Reggio Emilia Parma Piacenza Area Vasta Romagna Palareti Gualtiero (coordinatore) Legnani Cristina Mari Rosella Moratelli Stefano Serino Maria Luisa Marietta Marco Simoni Luisa Pilia Annalisa Silingardi Mauro Quintavalla Roberto Ippolito Luigi Giorgi Pierfranceschi Matteo Croci Ezio Argento Antonio Biasoli Chiara Poletti Giovanni Tiraferri Eros

42 La coagulazione come la disfida di Barletta Fattore XI Fattore XII Fattore VII protrombina Fattore IX Fattore V Fattore von Willebrand Fattore VIII fibrinogeno Fattore X Ca++ fosfolipidi Fattore XIII Ciavarella Petronelli 2011

43 I Unità Didattica Test di screening e loro interpretazione

44 C i t i tt i t t di Come orientarsi attraverso i test di screening dell emostasi

45 Caso n.2 PT aptt PLT 1.8 Ratio 2.5 Ratio /uL ipotesi diagnostica Deficit X,V,II e FBG (via comune) Paziente in TAO (VII,X,IX,II) XIXII) Deficit congeniti combinati (V + VIII) oppure (VII,X,IX,II) Ciavarella Petronelli 2011

46 Algoritmo storia emorragica /emorragia in atto Test di screening (PT,aPTT,PLT) normali alterati Normale TE/CT allungato Test specifici Malattia di von Willebrand (vw:ricof,vw:ag, FVIII:C) Piastrinopatia (aggr. piastrinica,nucleotidi,serotonina) Ciavarella Petronelli 2011

47 II Unità Didattica Malattia di von Willebrand e Trombocitopatie

48 VON WILLEBRAND FACTOR (VWF): Proteolisi da parte dell ADAMTS-13 Peptide Segnale H 2 N Propeptide D1 22 D2 D 763 FVIII Sito di azione dell ADAMTS-13 (Y1605- S-S M1606) Multimeri D3 S-SS Dimero A1 A2 A3 D4 B1 B2 B3 C1 C2 CK GP Ibα Collagene I & III Collagene VI Eparina GP IIb/IIIa COOH 2813

49 La carenza congenita o anticorpi contro l ADAMTS-13 causano la Porpora Trombotica Trombocitopenica

50 Lo Score emorragico Tosetto et al JTH 2006 Validato in 300 controlli normali e 753 pazienti e familiari con tipo 1 (MCMDM-1VWD):): BS nei normali = - BS nei normali 1/ 0

51 VWF:RCo (ELISA) anti-gpibα MoAb rgpibα Diluted Plasma + Ristocetin Anti-VWF-HRP Conjugated Polyclonal Antibody Add substrate Read OD 492 nm anti VWF VWF AI anti VWF VWF AI VWF AI A B C D E

52 III Unità Didattica Rischio tromboembolico e terapie anticoagulanti

53 Il significato del D-Dimero Livelli dei D-Dimeri nei pazienti con sospetta TVP ed EP 1000 D-dimer (ng/ml) pazienti senza trombosi hanno livelli D-Dimeri normali o 250 Dm elevati L assenza di elevati livelli di D-Dimeri indica che non vi è trombosi Al contrario Cut-off tutti i pazienti con trombosi hanno elevati livelli D- Dimeri 0 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,5 Assenza trombosi Con trombosi M.Colucci1999

54 In 283 patients with suspected DVT, low- moderate pre-test DVT score and negative d- dimer only 1 (NPV 99.6%) had DVT over next 3 months DVT D-Dimer Sensitive d-dimer testing can rule out DVT in lowmoderate risk patients Bates SM, Kearon C, Crowther M, et al. Ann Intern Med. 2003;138:787-94

55 eparine: struttura, proprietà generali Titolo diagramma eparine non frazionate p.m dalton (polisaccaridi) sale sodico e calcico maggiore attività anti-iia frazionate p.m dalton (oligosaccaridi) sale calcico maggiore attività anti-xa

56 eparine frazionate: caratteristiche ti meccanismi: i vantaggi: inferiore legame alle proteine plasmatiche risposta anticoagulante predicibile minore legame endoteliale migliore biodisponibilità minore legame ai macrofagi clearance dose- indipendente maggiore emivita

57 eparina: farmacocinetica (infusione continua e.v. con pompa elettronica) % c. P l a s m a t i c a ' 30' 1h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h tempo

58 Eparina: farmacocinetica (somministrazione sottocutanea) % c. P l a s m a t i c a C (%) o n c ' 2h 4h 6h 8h 12h 14h 18h 22h 24h tempo

59 terapia con ENF controllo di laboratorio aptt R= volte il valore basale

60 Indicazione profilassi TVP somministrazione trattamento TVP posologia monitoraggio UFH nessuno 2-3 volte al dì aptt aggiustata su aptt LMWH nessuno una volta al ldì nessuno 2 volte/dì aggiustata su peso corporeo

61 ENF: monitoraggio Infusione continua e.v. sottocute ogni 6 ore (induzione) ogni ore (mantenimento) ogni i24 ore

62 consensus: raccomandazioni eparine a basso peso molecolare (EBPM) La profilassi del tromboembolismo non richiede alcun controllo di laboratorio (livello 1) pazienti non complicati, trattati con dose fissa di EBPM aggiustata al peso corporeo non richiedono controllo di laboratorio (livello 1) il controllo di laboratorio (anti-xa) può essere indicato in alcune situazioni a rischio (insufficienza renale, gravidanza, ecc.)

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