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1 P come Piastrine come prezzemolo. I TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA: QUESTI SCONOSCIUTI Dr. Roberto Facchinetti, Laboratorio Analisi OCM VR Sabato 18 febbraio 2006

2 La piastrina: cellula multifunzionale Emostasi: adesione, attivazione, aggregazione, attività procoagulante, retrazione coagulo, riparazione tissutale. Regolazione tono vascolare: rilascio di serotonina, trombossano, prostaglandine. Flogosi: aterosclerosi, chemiotassi, interazioni PLTS-Leucociti. Difesa: fagocitosi, attività battericida, produzione di superossido. Biologia dei tumori: crescita dei tumori, metastasi.

3 Piastrine ed Emostasi TROMBO ATEROSCLERO A riposo attiva NORMALE EMOSTA EMORRAGIA

4 Normale emostasi Animazione

5 Formazione trombo piastrinico Fase Agonista Recettore ADEONE VWF GPIb-IX-V Collagene GPIa-IIa, GPVI FBG αιιβ β3 Fibronectina α5 β1 Laminina α6 β1 ATTIVAZIONE Trombina PAR1-PAR4, GPIb-IX-V ADP P2Y Trombossano A2 TP Epinefrina αιιa AGGREGAZIONE FBG,vWF,fibronectina αιιβ β3 STABILIZZAZIONE P-selectina GPIb-IX-V CD 40 Ligando αιιβ β3 INIBIZIONE PGI2 IP

6 Piastrine ed emorragia A riposo attiva NORMALE EMOSTA EMORRAGIA

7 Difetti emostasi 1) Fase vascolare 2) Fase piastrinica 3) Fase coagulativa

8 Difetti della fase vascolare bforme primitive - ereditarie: telengectasia di Rendu-Osler malattie ereditarie del connettivo - porpore idiopatiche Forme acquisite - Sindrome di Schonleich-Henoch - Forme secondarie (infezioni, farmaci, nefropatie, diabete, ipertensione, scorbuto, porpora ortostatica)

9 DIFETTI PIASTRINICI: Piastrinopenie Da ridotta produzione: Aplasia midollare (idiopatica, farmaci, tossici, rx) Sostituzione midollare (leucemie, altre neoplasie) Piastrinopoiesi inefficace: deficit B12 o Folati, emoglobinuria parossistica notturna, s. di Wiskott-Aldrich, Ridotta sopravvivenza piastrinica: Distruzione immunomediata: Werlhof, HIT, autoab Consumo: CID, porpora trombotica trombocitopenica (s. di Moschowitz) Sindrome emolitico-uremica (s. di Gasser) Alterata distribuzione: splenomegalie

10 Difetti piastrinici: piastrinopatie Acido Arachidonico- GP Ia: recettore per Trombina Trombossano recettore per VWF A2 GP IIb-IIIa: rec per FBG, VWF Aspirina e Aspirin-like syndrome Bernard Soulier Glanzmann Calcio CONTRAZIONE RILASCIO P2Y Recettore ADP Recettore adrenalina Via del PAF Mal. Di Von Willebrand Piastrine grigie Storage pool disease α granuli VWF, fattori, P-selectina Granuli densi: storage pool ADP, serotonina

11 DIFETTI PIASTRINICI: Piastrinopatie Acquisite - FANS, Uremia, Malattie mieloproliferative - Storage pool disease acquisito (durante DIC, in trombosi estese). - Malattia di Von Willebrand acquisita Congenite ereditarie - Malattia di Von Willebrand: nella forma lieve prevalenza 1/100 - Sindrome di Bernard-Soulier - Aspirin-like disease - Storage pool disease (isolato o nelli sindromi di Hermansky-Pudlak, Chediak-Higashi, Wiskott-Aldrich, sindromi congenite con piastrinopenia ed assenza del radio) - Tromboastenia di Glanzmann

12 TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA TEST Semplicità Tradizione Interesse emorragia Interesse atero Trombosi Disponibilità Azienda VR 1) Anamnesi ed esame obbiettivo 2) Conta, MPV 3) Test in vivo 4) Test in vitro 5) Studi su recettori e metaboliti Si, no routine

13 TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA TEST Semplicità Tradizione Interesse emorragia Interesse atero trombosi Disponibilità Azienda VR 1) Anamnesi ed esame obbiettivo 2) Conta, MPV 3) Test in vivo 4) Test in vitro 5) Studi su recettori e metaboliti Si, no routine

14 1) ANAMNE FAMILIARE E PERSONALE Chirurgia maggiore o traumi. The finding that a patient has recently withstood surgery without bleeding complications in many ways constitutes a better test of systemic hemostasis than any laboratory test could possibly provide. A.I. Shafer Chirurgia minore: odontoiatria, tonsille, circoncisione. Flusso mestruale, parto, secondamento. Piccoli traumi, iniezioni e vaccinazioni. Uso di farmaci, anche da banco. Malattie sistemiche concomitanti (rene, fegato, connettivo, linfo e mieloproliferative, sepsi, cancro).

15 1) ESAME OBBIETTIVO. Caratteristiche del sanguinamento PROBABILE DIFETTO VASCULO-PIASTRINICO - Spontaneo o immediato dopo trauma. - Superficiale. Petecchie, ecchimosi, mucose (naso, bocca, tratto gastrointestinale e genitourinario). PROBABILE DIFETTO COAGULATIVO - Provocato, ritardato. - Profondo. Ematomi, articolazioni, retroperitoneo.

16 TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA TEST Semplicità Tradizione Interesse emorragia Interesse atero trombosi Disponibilità Azienda VR 1) Anamnesi ed esame obbiettivo 2) Conta, MPV 3) Test in vivo 4) Test in vitro 5) Studi su recettori e metaboliti Si, no routine

17 Indagini di laboratorio: la corretta fase preanalitica CORRETTA PREPARAZIONE PAZIENTE: riposo, digiuno, orario, farmaci. CORRETTO PRELIEVO: stasi venosa, materiali, provetta, livelli di riempimento. CORRETTO TRASPORTO: tempo, temperatura. CORRETTO TRATTAMENTO DEL CAMPIONE: centrifugazione, preparazione reagenti e strumenti, vetreria. Fasi fuori dal controllo diretto del Laboratorio

18 2) Conta piastrinica, I Sistema di Rilevazione Resistivo. DC Transducer Chamber External Electrode Blood Cell Suspension DC Supply R e s i s t a n c e Al passaggio in un foro le cellule interrompono un campo elettrico, generando un impulso. Aperture Internal Electrode

19 2) Conta piastrinica, II Citometria a Flusso in fluorescenza. Un Laser colpisce il campione. Vengono rilevati i seguenti segnali: Scatter frontale: Volume della Cellula Scatter laterale: Contenuto cellulare (nucleo, granuli) Fluorescenza laterale: quantità di RNA e DNA presenti nella cellula La combinazione di questi 3 segnali consente il riconoscimento e la conta di di ogni singola cellula

20 TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA TEST Semplicità Tradizione Interesse emorragia Interesse atero Disponibilità in Azienda trombosi 1) Anamnesi ed esame obbiettivo 2) Conta, MPV 3) Test in vivo 4) Test in vitro 5) Studi su recettori e metaboliti Si, no routine

21 3) Test in vivo: il tempo di emorragia Test globale. Valuta le fasi: Vascolare, Piastrinica, Coagulativa Va eseguito in modo standardizzato: metodo Ivy mod. Mielke 1) Bracciale sfigmomanometro a 40 mmhg, 2) Taglio standardizzato orizzontale, lunghezza 5 mm, profondità 1 mm (Surgicutt*), 3) Asciugare ogni 30 secondi, 4) Vn < 7 minuti. LIMITI: Test aspecifico. Sensibilità e riproducibilità non ottimali. Richiede personale esperto. Richiede tempo. *Esiste Surgicutt dedicato per bambino e neonato.

22 TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA TEST Semplicità Tradizione Interesse emorragia Interesse atero Disponibilità in Azienda trombosi 1) Anamnesi ed esame obbiettivo 2) Conta, MPV 3) Test in vivo 4) Test in vitro 5) Studi su recettori e metaboliti Si, no routine

23 4) Test funzionali in vitro. Adesività piastrinica su sangue intero. SUPERFICIE ADEVA Test di Hellem: palline di vetro IMPACT Diamed: polistirene CONTA PIASTRINE DIFFERENZA CONTA PIASTRINE

24 4) Test funzionali in vitro. Aggregometria classica (Born). Agente aggregante AGONISTA LUCE

25 Born: vantaggi e svantaggi Vantaggi: uso di svariati agonisti, diagnostica approfondita. Svantaggi: campione plasma, indaginosa, richiede tempo, operatori esperti.

26 Sviluppi della aggregometria Aggregometria su sangue intero ad impedenza. Più sensibile della turbidimetrica ai farmaci anti GPIIb-IIIa (es. abciximab). Combinato con misura di luminescenza può studiare il rilascio di ADP. Aggregometria con light-scattering. E in grado di rilevare microaggregati. Rapid Platelet Function Analyzer (RPFA), Ultegra: aggregometro turbidimetrico. Proposto per rivelare resistenza al clopidogrel e aspirina. Hemostasis Analysis System (HAS), Hemodine: misura la forza contrattile delle PLTS e la generazione di trombina (accorciato in stati trombofilici, in malattia coronarica e diabete). IMPACT Diamed: su piatto di polistirene. Sangue intero. Misura la superficie di aggregazione ed i volumi piastrinici. Microscopio per l osservazione diretta dell aggregazione.

27 4) Test funzionali in vitro. Capacità emostatica piastrinica. Platelet Function Analyzer (PFA-100)- Dade Behring Agente Agonista 1. Col/EPI 2. Col/ADP Chiusura completa Misura: tempo di chiusura

28 PFA-100

29 PFA: vantaggi e limiti Vantaggi: Campione sangue intero. Sensibilità per vwd superiore a Tempo di emorragia. Facilità di uso routinario. Operatore non esperto. Meno invasivo di Tempo di emorragia. Limiti: Agonisti limitati. Non praticabile se HT < 0.3 L/L o PLTS < 80 x 10 9 /L.

30 PFA: prestazioni CV: < 10 %. Variabilità biologica day to day: circa 10 % Variabilità biologica circadiana: allungamento di circa il 30 % al pomeriggio. Sensibilità: 94 % (aggregometria 95%, Tempo di emorragia 80%) Correla con i livelli di VWF. Rileva Glanzmann, Bernard Soulier,, Aspirin like disease, storage pool disease.

31 Il PFA: algoritmo diagnostico Anamnesi positiva per diatesi emorragica PFA: collagene/epinefrina normale anormale PFA: collagene/adp normale anormale FANS Aggregazione piastrinica

32 Indicazioni cliniche ai test di funzionalità piastrinica per diatesi emorragica. Linee generali Screening popolazione generale? NO Screening preoperatorio in popolazione generale? NO Screening di Pz con anamnesi familiare positiva? Screening preoperatorio di Pz con anamnesi positiva e/o sintomi? Diagnosi di Pazienti con anamnesi personale positiva? Diagnosi di Pazienti sintomatici?

33 TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA TEST Semplicità Tradizione Interesse emorragia Interesse atero Disponibilità in Azienda trombosi 1) Anamnesi ed esame obbiettivo 2) Conta, MPV 3) Test in vivo 4) Test in vitro 5) Studi su recettori e metaboliti Si, no routine

34 Piastrine ed aterotrombosi TROMBO ATEROSCLERO A riposo attiva NORMALE EMOSTA

35 Piastrine e aterotrombosi, I PRINCIPALI OBBIETTIVI DEGLI STUDI Fisiopatologia aterotrombosi- malattia cardiovascolare Fisiopatologia ipertensione arteriosa Resistenze a farmaci antipiastrinici Valore predittivo per malattia cardiovascolare PRINCIPALI METODI UTILIZZATI Aggregometria classica Aggregometria ad impedenza o con light-scattering Capacità emostatica piastrinica: PFA Citofluorimetria Dosaggi immunometrici (ELISA)

36 Piastrine ed aterotrombosi, II PRINCIPALI PARAMETRI INDAGATI Curve di aggregazione. Tempi di chiusura. Aggregometria, PFA. Recettori piastrinici. CD41 (GP II b), CD 42a, CD 61 (GP III a), CD 63, P2Y, ecc Citofluorimetria. Ligandi solubili. Es. CD40Ls. ELISA. Markers di attivazione PLTS: es. P-selectina, TxA2, cataboliti urinari. ELISA.

37 La citoflurimetria: alcune applicazioni Diagnosi di disordini delle PLTS: Glanzmann, Bernard Soulier, Storage pool disease, HIT, ecc Quantificazione dei recettori piastrinici. Rilevazione di attivazione piastrinica: misura di CD40L, CD62p, CD 63, coniugati leucociti-plts, microparticelle piastriniche, P-selectina. Aterotrombosi, valutazione di pappe piastriniche. Valore predittivo? Monitoraggio di risposta delle PLTS ad agonisti: mediante i markers di attivazione, dopo stimolo. Monitoraggio dei farmaci antipiastrinici: antagonisti GPIIb-IIIa, clopidogrel, aspirina. Produzione piastrinica: dosaggio piastrine reticolate (dd fra diminuita produzione ed aumentata distruzione). Conta accurata delle PLTS. Ig associate a PLTS: piastrinopenie su base immunologica. Sopravvivenza delle PLTS: studi con marcatura.

38 Piastrine e malattia cardiovascolare, I dosaggi immunometrici Blann, P-selectina e BTG più alte negli ipertesi. Blann VWF elevato è predittivo di evento cardiovascolare in dislipidemici. Minamino, P-selectina fattore di rischio per stroke in FA. Schonbeck, Alto CD40L e rischio cardiovascolare. Johansen, PDGF e BTG correlano con restenosi dopo angioplastica.

39 Piastrine e malattia cardiovascolare, II citofluorimetria Michelson, Dopo stent coronarico, la citometria di flusso dei markers di attivazione piastrinica predice l infarto. Furman, Aggregati circolanti monociti-piastrine marker precoce di IMA. Strike, Lo stress mentale acuto fa aumentare gli aggregati PLTS-leucociti.

40 Piastrine e malattia cardiovascolare, III aggregazione e PFA Lanza,2003. Nell angina da sforzo i tempi di chiusura al PFA dopo esercizio fisico sono correlati ai reperti angiografici. Frossard, Tempi di chiusura accorciati al PFA sono correlati a gravità dell infarto (CK-MB e TnI). Gianetti, Tempi di chiusura al PFA accorciati dopo angioplastica coronarica sono predittivi di eventi ischemici. Kalvergren, Chlamydia p. stimola aggregazione PLTS e ossidazione LDL.

41 Piastrine e malattia cardiovascolare, IV conta ed indici piastrinici Greisenegger, MPV elevato è indice prognostico negativo nello stroke. Coban, MPV è più alto nell obesità.

42 P come Piastrine come prezzemolo. I TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA: QUESTI SCONOSCIUTI Dr. Roberto Facchinetti, Laboratorio Analisi OCM VR Sabato 18 febbraio 2006

43 CD40 Recettore espresso su endotelio, cellule muscolari liscie, monociti, piastrine. Il legame con il suo ligando, CD40L, provoca l espressione di mediatori di flogosi, molecole di adesione, Fattore Tissutale (TF). Il CD40L si lega a GP III b-ii a e provoca attivazione piastrinica. Quindi: CD40L è implicato nelle varie fasi della aterogenesi, acuta e cronica. CD40L: più alto in Pz. con angina instabile. valore predittivo per rischio cardiovascolare in donne sane. più attivo nei fumatori di sigarette. non predice riperfusione dopo trombolisi in IMA

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