Dott.ssa Silvia Pagliaretta. Prof. Stefano Cascinu

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1 UNIVERSITÁ POLITECNICA DELLE MARCHE FACOLTÁ DI MEDICINA E CHIRURGIA Dottttorratto dii Riicerrca XII ciicllo Currrriicullum Oncollogiia TUMORI EREDO-FAMILIARI DI MAMMELLA ED OVAIO: ANALISI MUTAZIONALE DEI GENI BRCA1 E BRCA2 Tesi di Dottorato di: Dott.ssa Silvia Pagliaretta Relatore: Chiar. mo Prof. Stefano Cascinu Anno Accademiico 2011/2012

2 INDICE RIASSUNTO 1 CAPITOLO 1: INTRODUZIONE 1.1 EPIDEMIOLOGIA DELLE NEOPLASIE ALLA MAMMELLA ED OVAIO BASI MOLECOLARI DELLA CARCINOGENESI LE PROTEINE BRCA1 E BRCA Struttura della proteina BRCA Struttura della proteina BRCA FUNZIONE DELLE PROTEINE BRCA1 E BRCA Riparazione del danno al DNA 10 a) Ruolo di BRCA1 10 b) Ruolo di BRCA Regolazione della trascrizione Controllo del ciclo cellulare I TUMORI EREDITARI La sindrome HBOC e rischio cancro Incidenza delle mutazioni germinali nei geni BRCA1 e BRCA IL TEST GENETICO Selezione dei pazienti 21 CAPITOLO 2: SCOPO DELLO STUDIO 24 CAPITOLO 3: PAZIENTI E METODI 3.1 CRITERI DI SELEZIONE Criteri clinici Criteri Informatici 25 a) BRCAPRO 25 b) Manchester Scoring System STUDIO DELLA SEQUENZA DEI GENI BRCA1 E BRCA2 26 II

3 3.2.1 Estrazione del DNA genomico Reazione a catena della polimerasi Purificazione dell amplificato Reazione di sequenza lettura della sequenza STUDIO DEI GRANDI RIARRANGIAMENTI GENICI IN BRCA1 E BRCA2: MLPA (Multiplex Ligation Probe amplification) 39 CAPITOLO 4: RISULTATI 4.1 SOGGETTI ESAMINATI BRCAPRO ANALISI DELLA SEQUENZA DEI GENI BRCA1 E BRCA Studio del gene BRCA Studio del gene BRCA Studio dei parenti sani 64 CAPITOLO 5: DISCUSSIONE 66 BIBLIOGRAFIA III

4 ABSTRACT Approximately up to 5 %-10% of all cases of breast and ovarian cancers exhibit a familial pattern of incidence. During the 90s, reserchers discovered that this familial predisposition was caused by germline mutations in two tumor suppressor genes called BReast CAncer susceptibility gene 1 and 2, or BRCA1 and BRCA2. Mutations in these genes are associated with a dominant autosomic genetic predisposition at high penetrance. It is now widely accepted that individuals, that inherit a germline mutation in BRCA1 or BRCA2, have a significantly increased lifetime risk of developing breast or/and ovarian cancer. Our study aims to evaluate the presence of germline mutations in BRCA1 and BRCA2 both in patients with breast and / or ovarian cancer both in their relatives. In the study, candidates identification was based on familial history and on the results provided by computer programs such as BRCAPRO and Manchester Scoring System. The approach used was based on BRCA1 and BRCA2 sequence screening by direct sequencing methods, while the study of large gene rearrangements was carried out by MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification). To date, 741 patients were selected, 692 were women and 49 were men, with a mean age of onset disease of 44 years (range 16-84). BRCA1 and BRCA2 mutational analysis was completed on 725 patients. 191 mutations have been totally identified, 52 of which in BRCA1: - 19 frameshift, 17 missense, 3 nonsense, 2 splice site mutations, 7 intronic variants and 4 gene rearrangements; IV

5 and 57 in BRCA2: - 21 frameshift, 4 nonsense, 20 missense, 5 silent, intronic variants 5 and 2 in the splice site. Then the study was extended to 256 healthy subjects, relatives of analyzed patients. The analysis was completed on 181 subjects. A total of 77 mutations have been found: 22 in BRCA1 and 17 in BRCA2. The collected data confirm the possibility of detect predisposing mutations in high risk patients. Individuals carrying the mutation, will benefit from a prevention program. V

6 RIASSUNTO Sulla base delle informazioni ad oggi disponibili, si stima che circa il 5-10% dei carcinomi mammari ed ovarici insorga su base eredo-familiare. Nel corso degli anni 90, sono stati identificati due geni oncosoppressori che, se mutati, sono responsabili della comparsa sia di tumori mammari che ovarici. Questi geni sono stati chiamati BReast CAncer susceptibility gene 1 e 2 ovvero BRCA1 e BRCA2. Le mutazioni di questi geni si trasmettono con modalità di tipo autosomico dominante. Da un punto di vista clinico, l importanza nel rilevare mutazioni in questi geni, risiede nel fatto che i soggetti, portatori di mutazioni predisponenti, hanno un elevato rischio di ammalarsi di tumore. Il nostro studio si è proposto di valutare l incidenza delle mutazioni germinali di BRCA1 e BRCA2 sia nei pazienti con neoplasia della mammella e/o dell ovaio sia nei parenti dei pazienti portatori. L identificazione dei soggetti candidati allo studio, si è basata sulle caratteristiche dell anamnesi familiare e sui risultati forniti da programmi informatici quali BRCAPRO e Manchester Scoring System. Lo studio della sequenza nucleotidica di tutti gli esoni dei geni BRCA1 e BRCA2 è stato effettuato tramite sequenziamento diretto; mentre lo studio di grandi riarrangiamenti genici è stato effettuato grazie alla tecnica MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification). Ad oggi, sono stati selezionati 741 pazienti, di cui 692 donne e 49 uomini, con un età mediana d insorgenza della malattia di 44 anni (range 16-84). L analisi mutazionale di BRCA1 e BRCA2 è stata completata su 725 pazienti. In totale sono state identificate 191 mutazioni, di cui 52 in BRCA1: 1

7 - 19 frameshift, 17 missenso 3 nonsenso, 2 mutazioni nel sito di splicing, 7 varianti introniche e 4 riarrangiamenti genici; e 57 in BRCA2: - 21 frameshift, 4 nonsenso, 20 missenso, 5 silenti, 5 varianti introniche e 2 mutazioni nel sito di splicing. Lo studio è stato esteso poi a 256 soggetti sani, parenti dei pazienti analizzati, dei quali 188 donne e 68 uomini. L analisi è stata completata su 181 soggetti. Sono state trovate, in totale 77 mutazioni, di cui 22 in BRCA1 e 17 in BRCA2. I dati raccolti finora confermano la possibilità di rilevare mutazioni predisponenti allo sviluppo di carcinomi mammari ed ovarici in soggetti ad alto rischio. I soggetti identificati potranno quindi sottoporsi a strategie preventive. 2

8 Capitolo 1 INTRODUZIONE 1.1 EPIDEMIOLOGIA DELLE NEOPLASIE ALLA MAMMELLA ED OVAIO Il tumore della mammella è il tumore di gran lunga più frequente nel sesso femminile. Nonostante la copertura dei programmi di screening mammografico ed il progresso delle tecniche terapeutiche abbia notevolmente contribuito alla sopravvivenza di pazienti affetti da cancro al seno, questo tipo di neoplasia è ancora oggi una delle principali cause di morte nelle donne 1. La malattia presenta inoltre un ampia variabilità geografica, con tassi più alti, fino a 10 volte, nei Paesi economicamente avanzati. In Italia, si contano circa nuovi casi l anno e circa decessi; dati che andranno, purtroppo, ad aumentare a causa dell allungamento della vita media 2, 3. In particolare, nella regione Marche, nell anno 2010, sono stati diagnosticati 3257 nuovi casi 4. I fattori di rischio principali per questa neoplasia sono stati identificati nella storia riproduttiva (nulliparità o prima gravidanza a termine dopo i 30 anni, mancato allattamento al seno), nel profilo ormonale, nelle abitudini di vita in aggiunta alla presenza di pregressa patologia displastica o neoplastica della mammella e un anamnesi familiare positiva per tali tumori. Il cancro ovarico rappresenta circa il 30% di tutti i tumori maligni dell apparato genitale femminile, occupa il decimo posto tra tutti i tumori nelle donne per quanto riguarda l incidenza ed il quinto per mortalità solo tra le donne in età (7% del totale dei decessi) 2,3. 3

9 Questo tumore presenta un gradiente Nord-Sud: rispettivamente sono diagnosticati al Nord 12,1, al Centro 10,1 e nel Meridione 9,7 casi ogni donne/anno BASI MOLECOLARI DELLA CARCINOGENESI Il processo ci carcinogenesi, ossia la trasformazione multi-steps da tessuto sano a neoplastico, deriva da eventi genici, somatici e/o ereditari, cumulativi che garantiscono un vantaggio selettivo del clone in cui tali alterazioni si accumulano. Tali alterazioni possono causare l attivazione persistente di vie di trasduzione del segnale innescate da fattori di crescita e la soppressione di altrettante vie che portano alla morte cellulare programmata (apoptosi) 5. Il risultato di tale trasformazione è sia il mancato equilibrio fra sopravvivenza e morte cellulare con successiva crescita cellulare incontrollata, sia la disregolazione della comunicazione cellula/cellula e cellula/matrice extracellulare con conseguente potenziale invasivo della cellula neoplastica. I geni che, se mutati, conferiscono suscettibilità al cancro, appartengono a tre classi: - proto-oncogeni - oncosoppressori - geni deputati alla riparazione del DNA I proto-oncogeni svolgono un ruolo importante nella regolazione del ciclo e del differenziamento cellulare. I proto-oncogeni ed i loro prodotti possono essere classificati in: - fattori di crescita (sis, int-2) - tirosin-chinasi, serin/treonin chinasi e recettori tirosin-chinasi ( src, fgr, fps/fes, kit, pim-1,mos) 4

10 - proteine G associate alla membrana (H-ras, K-ras, gsp) - regolatori citoplasmatici (crk) - fattori trascrizionali nucleari (myc, fos, jun, erba, ski) Nelle cellule sane l espressione dei proto-oncogeni è strettamente controllata, in modo che la crescita e la divisione cellulare avvengano solo in momenti appropriati della vita della cellula 6. Per attivare un proto-oncogene, in oncogene, è sufficiente una sola mutazione nella sequenza del gene. Nel caso in cui la mutazione avvenga in un gene che codifica per un recettore, questo recettore viene attivato in maniera costitutiva, ossia anche in assenza del ligando. Se invece, ad essere mutate sono le proteine tirosin-chinasi, si ha l attivazione costitutiva (ligando indipendente) della cascata a valle della trasduzione del segnale, che porta ad una divisione incontrollata. I geni oncosoppressori, scoperti alla fine degli anni 60, sono geni i in grado d inibire la crescita e la divisione cellulare; sono capaci quindi, di sopprimere la proliferazione incontrollata tipica delle cellule cancerose. A differenza delle mutazioni negli oncogeni, le alterazioni a carico dei geni oncosoppressori seguono l ipotesi dei due colpi ovvero, è necessario che entrambi gli alleli di un determinato gene siano mutati affinché si manifesti l effetto. Di fatto, qualora un solo allele sia danneggiato (primo colpo), il secondo resterebbe in ogni caso in grado di generare una proteina corretta. Se la prima lesione genica è a carico delle cellule germinali, viene ereditata ed è presente in tutte le cellule dell organismo. La seconda mutazione (secondo colpo), che porta alla loss of function del gene oncosoppressore, avviene nelle cellule somatiche già portatrici della prima lesione. 5

11 In altre parole, gli alleli di geni oncosoppressori sono solitamente recessivi, mentre quelli degli oncogeni sono comunemente dominanti, I soppressori tumorali possono essere distinti in due categorie: gatekeepers e caretakers. I primi sono chiamati anche guardiani o oncosoppressori in senso stretto e controllano direttamente la crescita cellulare, promovendo l apoptosi o inibendo la proliferazione; gli altri, denominati anche custodi, agiscono indirettamente, controllando l integrità del DNA. L inattivazione di un gene caretakers porta ad una condizione di instabilità genomica diffusa 7. Fanno parte di questa categoria i geni APC, BRCA1 & 2, DCC, NF1 e 2, p16, p53, RB, VHL e WT1. Ultima classe di geni è quella deputata alla riparazione dei danni al DNA. Questo gruppo comprende geni che riparano gli errori che avvengono durante la duplicazione del DNA. A seconda del tipo di danno che il DNA subisce, vengono coinvolti differenti meccanismi di riparo. NER (Nucleotide Excision Repair), BES (Base excision repair) e MMR (MisMatch Repair) sono deputati al riparo delle lesioni a singolo filamento del DNA; HR (Homologous Recombination Repair) e NHEJ (Non-Homologous End Joining) riparano i danni a doppio filamento dell elica di DNA. 6

12 1.3 LE PROTEINE BRCA1 E BRCA2 BRCA1 e BRCA2 (BReast CAncer susceptibility gene 1 e 2) codificano per proteine ad elevato peso molecolare con simili modelli di espressione e di localizzazione subcellulare. Sono entrambe espresse in molti tessuti, principalmente durante la fase G1/S del ciclo cellulare, indicando un loro ruolo durante la replicazione del DNA. Inoltre le proteine BRCA sono localizzate nel nucleo delle cellule somatiche, dove coesistono in caratteristici foci subnucleari che si ridistribuiscono a seconda della localizzazione del danno al DNA Struttura della proteina BRCA1 Il gene BRCA1, mappato sul braccio lungo del cromosoma 17 (17q21), fu scoperto da Mary-Claire king nel Questo gene è composto da 24 esoni, per una lunghezza complessiva di 5693bp. Di questi esoni, 22 codificano per una proteina di 1863 aminoacidi (220kDa), mentre gli esoni 1 e 4 vengono processati durante la trascrizione. La proteina codificata da BRCA1 presenta numerosi domini funzionali. All estremità N-terminale si trova il dominio RING-finger che comprende all incirca i primi 109 aminoacidi della proteina. All'interno di questo dominio vi è una regione, di circa 50aa, caratterizzata da un pattern conservato con struttura del tipo cys 3 -his-cys 4, responsabile del legame di due ioni zinco (Zn 2+ ) 11. Tale dominio è coinvolto nell attività ubiquitino ligasi infatti consente a BRCA1 di mono o poli ubiquitinare le proteine che devono essere degradate 12. Questa attività è possibile grazie al legame del dominio RING-finger con due proteine: BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1) e BAP1 (BRCA1-associated protein 1) 13. 7

13 La regione compresa fra gli aminoacidi contiene due segnali di localizzazione nucleare NLS ed i siti di legame per le proteine p53, cmyc, RB e ZBRK1. Adiacente a questa regione si trova il dominio di legame per le proteine SW1 e SNF implicato nel rimodellamento della cromatina. La porzione centrale della proteina BRCA1 (aa ) contiene il sito di legame con il DNA ed è coinvolta nel meccanismo di riparo della doppia elica mediato dal complesso mutiproteico BASC (BRCA1-Associated Surveillance Complex). Comprese tra gli aminoacidi 1280 e 1524 si trovano poi numerose sequenze SCD (SQ Cluster Domains) che costituiscono i siti preferenziali per la fosforilazione di BRCA1 da parte delle chinasi ATM, CHK2 e CDK2. La porzione C-terminale presenta due sequenze, di circa 110 aminoacidi ognuna, ripetute in tandem ed evolutivamente conservate chiamate BRTC (BRCA C-Terminale). La struttura di ogni dominio BRTC presenta un core centrale, formato da quattro foglietti β paralleli, circondato da tre α-eliche. Le due ripetizioni BRTC si ripiegano in maniera testa-coda, dando luogo alla formazione di una tasca costituita per la maggior parte da amminoacidi idrofobici. Questi domini costituiscono il sito di legame per molte proteine fra le quali l RNA polimerasi II, p300, BACH1, i complessi istone-diacetilasi HDAC1 e HDAC2, p53, CtIP (carboxy-terminal-binding-interacting-protein) e con RB. Figura 1: Domini funzionali della proteina BRCA1 e relative interazioni con le proteine. 8

14 1.3.2 Struttura della proteina BRCA2 Il gene BRCA2 scoperto nel 1995 e mappato sul braccio lungo del cromosoma 13 (13q12), è costituito da 27 esoni (11385 nucleotidi) e codifica per una proteina nucleare di 3418 aminoacidi (384 kda). La proteina BRCA2 contiene solamente due domini funzionali. Il primo, situato nella regione centrale del gene, codificato interamente dall esone 11, è il motivo ripetuto BRC (che contiene 8 ripetizioni di una sequenza di aminoacidi), essenziale nel ruolo di riparazione del DNA e nel legame con RAD51. L altro, a livello dell estremità C-terminale, è il sito di legame con la proteina DSS1, adiacente ai siti NLS. La regione carbossi terminale presenta anche un sito di interazione con BRCA1. DSS1 è una piccola proteina che regola l attività di riparazione del DNA, funzionando come cofattore di BRCA2. Le proteine BRCA sono coinvolte in numerosi processi cruciali per la vita cellulare. Figura 2: Domini funzionali della proteina BRCA2 e relative interazioni con le proteine. 9

15 1.4 FUNZIONE DELLE PROTEINE BRCA1 E BRCA2 BRCA1 e BRCA2 sono considerati geni oncosoppressore caretaker, poiché sono coinvolti nella riparazione del DNA tramite ricombinazione omologa (homolog recombination - HR), nella regolazione della trascrizione e nel controllo del ciclo cellulare. Essi effettuano un controllo definito a monte, che comprende il coinvolgimento nei sistemi di riparazione del DNA ed una regolazione a valle, che si esplica nel controllo del ciclo cellulare attraverso i vari checkpoints Riparazione del danno al DNA Per quanto riguarda la ricombinazione omologa, la letteratura suggerisce che BRCA1 e BRCA2 abbiano ruoli diversi, nonostante si localizzino all interno di un unico complesso macromolecolare. Infatti è stato dimostrato che, mentre BRCA1 svolge un ruolo più generale, fungendo da tramite tra i segnali di rottura del DNA e gli effettori della riparazione, BRCA2 lega e controlla l attività della proteina RAD51. a) Ruolo di BRCA1 Come conseguenza di una lesione alla doppia elica di DNA, si ha l immediata marcatura del sito danneggiato grazie alla fosforilazione dell istone H2A-X. BRCA1 viene fosforilata e di conseguenza attivata. Nella forma attiva migra a livello delle forche di replicazione del DNA, dove si associa coi i complessi proteici specifici per la riparazione 15. La fosforilazione avviene a livello di diversi residui di serina (Ser1387, Ser1457, Ser988, Ser1423, Ser1524) 16;17 da parte delle chinasi ATM, ATR (ATM-related kinase) e CHK2 16,17. Ognuna di queste chinasi, viene attivata da uno stimolo chimico diverso ed ha come bersaglio uno specifico gruppo di residui di serina. In particolare ATM e CHK vengono 10

16 attivate in caso di danno da parte di radiazioni ionizzanti, mentre ATR è attivata come conseguenza all esposizione a raggi UV o all arresto della replicazione. BRCA1 fa parte di molti complessi macromolecolari. Il primo di questi è MRE11/RAD50/NSB1. Il primo passo per la riparazione del DNA è la formazione di un DNA a singola elica sporgente al 3. La nucleasi MRE11 genera tratti di ssdna, che verranno poi legati da RAD51. Inibendo l attività nucleasica di MRE11, BRCA1 può regolare la lunghezza e la quantità dei tratti a ssdna che si vanno a formare, fungendo così da coordinatore della risposta al danno genetico 17. BRCA1 interagisce inoltre con il complesso SWI/SWF. Tale complesso è responsabile del rimodellamento della cromatina che permette un più libero accesso al DNA danneggiato da parte dei fattori coinvolti nella riparazione. b) Ruolo di BRCA2 La funzione di riparazione del DNA da parte di BRCA2 viene svolta in modo più diretto, in quanto lega direttamente RAD51 a livello dei domini BRCT e della coda carbossi-terminale. RAD51 è l omologo eucariotico della proteina batterica RecA, che ha un attività catalitica fondamentale per il funzionamento della ricombinazione omologa. Questa proteina, infatti, è in grado di legarsi al DNA a singolo filamento (ssdna), formando un filamento nucleo proteico che va ad appaiarsi con la sua regione omologa nel DNA a doppio filamento del cromatidio fratello e promuove lo scambio dei filamenti giustapposti 18,19. Un modello proposto per il funzionamento in vivo del complesso BRCA2-RAD51 prevede la presenza di uno stato inattivo in cui RAD51 non può legare il DNA e di uno stato attivo nel quale RAD51 effettua la ricombinazione. 11

17 Il dominio BRC di BRCA2 è infatti in grado di bloccare la formazione dei filamenti nucleo proteici, nonché di scindere quelli già formati. Il mantenimento dello stato inattivo è necessario per prevenire un attivazione non richiesta della ricombinazione durante la replicazione del DNA; contrariamente la scissione fra BRCA2 e RAD51 è fondamentale per il compimento del processo di riparazione. Il passaggio fra lo stato inattivo a quello attivo (e viveversa) non è dato dalla scissione del legame fra BRCA2 e RAD51, bensì da modificazioni post-traduzionali quali la fosforilazione/defosforilazione di una o entrambe le proteine, in risposta alle lesioni del al DNA Regolazione della trascrizione BRCA1 regola la trascrizione di numerosi geni coinvolti nei meccanismi di riparazione del DNA. BRCA1, in associazione con ZBRK1 e KRAB, forma un complesso in grado di inibire la trascrizione del gene oncosoppressore GADD45 che è un bersaglio a valle della via di p53 20,21. Quello che è evidente è che BRCA1 è in grado d interagire con l apparato trascrizionale della cellula, complessandosi con l RNA polimerasi II attraverso l interazione con l elicasi. E stato dimostrato che le cellule in cui BRCA1 viene inattivato, sono deficitarie nella riparazione del DNA associata alla trascrizione 22,23, un processo secondo cui le basi danneggiate a causa di un danno ossidativo, sono rimosse dal filamento di DNA trascritto. 12

18 In accordo con questa teoria, è l associazione di BRCA1 con le proteine del Mismatch repair MSH2 e MSH6. Inoltre BRCA1 sembra essere coinvolto nel controllo del processamento dell RNA in seguito al danno al DNA, grazie alla formazione de complesso BRCA1/BARD ed il fattore di poliadenilazione CstF50. Gli mrna nascenti, prima di venire poliadenilati, devono essere tagliati al 3 da un endonucleasi. Questa reazione può essere inibita dal complesso BRCA1/BARD in caso il DNA abbia subito un danno. Il meccanismo dell inibizione non è per ora conosciuto, anche se si pensa che possa coinvolgere l attività ubiquitino ligasica dell eterodimero BRCA1/BARD, che esplica la sua attività sulle proteine coinvolte nel processamento dell RNA. Inoltre BRCA1 controlla in maniera indiretta la trascrizione attraverso l interazione con l istone deacetilasi. Infatti rende la cromatina più o meno accessibile ai fattori di trascrizione Controllo del ciclo cellulare Se il controllo a monte è fondamentale per prevenire la formazione di copie di DNA errate, la regolazione a valle è altrettanto importante. Il ciclo cellulare, ovvero l insieme degli eventi molecolari che portano una cellula a dividersi in due cellule geneticamente identiche, è un processo altamente controllato. Il ciclo cellulare è costituito da una serie di eventi coordinati e correlati tra loro, dai quali dipende la corretta crescita e proliferazione delle cellule eucariotiche. Gli eventi molecolari che controllano il ciclo cellulare sono ordinati e direzionali: ogni processo è la diretta conseguenza dell'evento precedente ed è la causa di quello successivo. 13

19 Vi sono due momenti chiave nel controllo del ciclo: il passaggio dalla fase G1 alla fase S (checkpoint G1/S o start) e il passaggio dalla fase G2 alla mitosi (checkpoint G2/M) 24. I checkpoint sono essenziali per la sopravvivenza della cellula, poiché impediscono la propagazione del DNA danneggiato. BRCA1 svolge la sua funzione di controllo a livello dei checkpoint come parte del complesso BASC. Di questo complesso fanno parte il complesso di riparazione MRE11/RAD50/NSB1, la chinasi ATM, i complessi MLH1-PMS2, MSH2-MSH6, l elicasi BML e il fattore C di replicazione del DNA. L espressione di BRCA1, durante il ciclo cellulare, non è costante ma varia; in particolare incrementa nel passaggio tra fase G1 e S e nella mitosi. Studi hanno dimostrato che sia BRCA1 sia la chinasi ATM sono richieste nella fase S e nel checkpoint G2/M; ciò suggerisce che la fosforilazione da parte della proteina ATM sia indispensabile per la risposta ai danni del DNA che avvengono solitamente in questa fase 16. Altri lavori hanno indicato come questa risposta avvenga grazie l attivazione, da parte di BRCA1, della chinasi Chk1, inducendo quindi la cascata dei segnali a valle della Chk1 25. Si è scoperto, inoltre, che BRCA1, in presenza di DSBs (Double Strand Breaks), funge da coattivatore di p Attivando, infatti, i cofattori p21 (inibitore del ciclo cellulare) e BAX (attivatore apoptotico), BRCA1 e p53 arrestano il ciclo cellulare nella fase S, impedendo l inizio della duplicazione del DNA. Non è ancora chiaro, contrariamente a BRCA1, il ruolo di BRCA2, nel processo di regolazione del ciclo cellulare. 14

20 Un modello proposto è quello in cui la sua interazione con BRAF35 (BRCA2-Associated Factor 35) controlli il checkpoint G2/M. Il ruolo di BRCA2 e BRAF35 di controllare il passaggio dalla fase G2 alla metafase, dipenderebbe dalla capacità del complesso di legarsi alla cromatina fortemente condensata, ovvero ai cromosomi in via di formazione I TUMORI EREDITARI Il tumore è una malattia dovuta ad una crescita incontrollata ed invasiva di un clone cellulare, che ha accumulato un certo numero di alterazioni genetiche. Nella maggior parte dei casi le mutazioni geniche avvengono casualmente durante la vita e colpiscono le cellule somatiche. Le mutazioni somatiche non sono ereditabili e possono dare origine a tumori definiti sporadici. In una piccola percentuale di casi (5-10%) la mutazione avviene nelle cellule germinali e può essere trasmessa da una generazione alla successiva, secondo i criteri mendeliani dell ereditarietà. E importante sottolineare che, le persone che ereditano la mutazione germinale non ereditano il tumore, ma solamente la predisposizione a sviluppare più facilmente quella neoplasia rispetto alla popolazione generale. Il fatto che la malattia si sviluppi oppure no, è infatti condizionato, il più delle volte, da altri fattori sia ereditari che esterni, primo tra tutti lo stile di vita 8. 15

21 1.5.1 La sindrome HBOC e rischio cancro Quando in più famiglie si hanno molteplici casi di tumore al seno e all ovaio, insorti in giovane età ed in più generazioni, si parla di sindrome HBOC (Hereditary breast-ovariancancer ). L alterazione può essere trasmessa da una generazione alle successive, sia da parte materna sia da parte paterna. Questa sindrome è identificata in famiglie il cui pedigree presenta componenti sia con tumore al seno sia all ovaio ed è caratterizzata da: - presenza di più casi all interno di una stessa famiglia - insorgenza precoce del tumore al seno, - sviluppo di cancro ovarico in qualsiasi età, - cancro al seno bilaterale, - cancro al seno e alle ovaie nello stesso individuo - cancro al seno maschile 9 Mutazioni nella linea germinale di uno dei due geni BRCA sono state associate alla sindrome HBOC. Nei soggetti portatori di una mutazione germinale nei geni BRCA1 e BRCA2 il rischio di sviluppare una neoplasia mammaria ed ovarica aumenta notevolmente. In particolare possedere un gene BRCA mutato significa avere dal 40% all 80% di rischio di sviluppare un tumore alla mammella. Il rischio è aumentato da 3 a 7 volte rispetto a quello della popolazione generale, che si aggira intorno al 12% 28. Per quanto riguarda i carcinomi ovarici, il rischio passa dal 1-2% della popolazione generale al 30%-70% per mutazioni BRCA1 e al 15%-20% per mutazioni BRCA

22 Inoltre il rischio di cancro ovarico non è lo stesso per tutti i tipi di mutazione BRCA2, ma differisce a seconda della posizione in cui questa si trova. Precisamente, mutazioni nella parte centrale del gene BRCA2, denominata OOCR (Ovarian Cancer Cluster Region of exon 11), sono associate ad un più elevato rischio di cancro ovarico piuttosto che mammario, rendendo i soggetti che ne sono portatori maggiormente predisposti alla malattia, rispetto a quelli che hanno una mutazione in altre regioni del gene 29. BRCA2 è coinvolto, inoltre, nello sviluppo di neoplasie mammarie maschili: nella popolazione generale, il tumore alla mammella maschile è raro e costituisce solamente l 1% dei tumori maschili 30. Per i portatori di mutazioni in BRCA2, il rischio nell arco della vita di sviluppare tale neoplasia è approssimativamente volte maggiore 29. Mutazioni nei geni BRCA predispongono, anche se in percentuale minore, ad un aumentato rischio di tumore al colon nel caso in cui l alterazione sia in BRCA1; e ad un aumentato rischio di neoplasie alla prostata, linfoma, melanoma, cancro al pancreas e stomaco nel caso di mutazioni in BRCA2 28. A) B) Figura 3: Rischio cumulativo di sviluppare neoplasie mammarie (A) ed ovariche (B) relativo ai portatori di mutazione in BRCA1 17

23 1.5.2 Incidenza delle mutazioni germinali nei geni BRCA Il numero ed il tipo di mutazioni germinali di BRCA1 e BRCA2 sono catalogate dal 1995 nel BIC (Breast Cancer Information Core), un database disponibile su Internet ( nel quale sono state fino ad oggi riportate e raccolte più di 800 mutazioni. Le mutazioni sono distribuite lungo l intera sequenza del gene e non presentano una topografia definita, infatti non esiste alcuna correlazione fra sito della mutazione e fenotipo tumorale; per cui i dati clinici non sono in grado di fornire alcuna indicazione circa la regione da indagare. La maggior parte delle alterazioni della sequenza nucleotidica sono di tipo frameshift e non-senso, che portano alla formazione di una proteina tronca. Sono frequenti anche mutazioni missenso di cui, però, non sempre si è in grado di stabilire se siano semplici polimorfismi o se invece siano deleterie per la funzionalità della proteina. L incidenza delle mutazioni, nella popolazione generale, è stimata tra 1/150 e 1/800 31,32. Questa aumenta nei casi di famiglie in cui si siano presentati più di due casi di neoplasia mammaria sviluppata in giovane età e almeno due casi di tumore ovarico. Vari studi hanno inoltre messo in evidenza, in alcuni gruppi etnici, la presenza di un effetto fondatore, cioè il ricorrere di una mutazione ereditata da un antenato comune. Nella popolazione ebrea Askenazita, ad esempio, l effetto fondatore è rappresentato dalle mutazioni 185delAG e 5382insC di BRCA1 e dalla mutazione 6174delT di BRCA2 33,34. Il Consorzio italiano per i tumori ereditari della mammella ed ovaio ha esaminato famiglie italiane. Di queste, il 23% sono portatrici di mutazioni patogenetiche negli oncosoppressori BRCA1 o BRCA2. 18