Terapia Genica Correggere geni difettosi responsabili di malattie

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1 Terapia Genica Correggere geni difettosi responsabili di malattie Ma per adesso resta una procedura sperimentale, e un enorme mole di ricerca è ancora necessaria affinché possa esplicare a pieno il proprio potenziale terapeutico

2 Terapia cellulare Germ-line; somatica in vivo; ex-vivo Allotrapianto: cellule provenienti da un donatore della stessa specie Autotrapianto: cellule provenienti dallo stesso paziente Xenotrapianto: cellule provenienti da animali di specie diverse

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4 Strategie terapeutiche genetico-molecolari Produzione di proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri, lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati). Produzione di anticorpi geneticamente modificati. Produzione di vaccini geneticamente modificati. Terapia genica.

5 Terapia genica Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere in vivo o ex vivo

6 Obiettivi della Terapia Genica Ø Correzione di fenotipi patologici risultanti da mutazioni genetiche: sostituire e/o correggere un gene mancante o difettoso Ø Espressione di proteina corretta e correzione permanente Ø Trasferimento veloce ed efficiente del farmaco rispettando il contesto genico e cellulare Ø Introdurre nella cellula geni diretti all eliminazione delle cellule cancerose Ø Trasferire geni virali o batterici a scopo di vaccinazione Ø Trasferire geni che stimolano la crescita o la rigenerazione di tessuti danneggiati

7 Quali malattie possono essere trattate con la terapia genica? Malattie Ereditarie: Distrofia muscolare Atrofia muscolare Fibrosi cistica Emofilia Immuno deficienze (ADA X-linked) Fenilchetonuria (malattie metaboliche) Anomalie fisiologiche (mucopolisaccaridosi, sindrome di Gaucher etc.)

8 Quali malattie possono essere trattate con la terapia genica? Malattie non Ereditarie: Cancro Malattie cardiovascolari Malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson etc.) Infine la terapia genica può trattare anche malattie acquisite quali: Traumi di vario tipo (fratture ossee, ferite, ustioni) Ischemie (necrosi dei tessuti causate da un'interruzione dell'apporto sanguigno) Infezioni

9 Vantaggi teorici della terapia genica Correzione radicale dei difetti Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici Vantaggi economici (se permanente evita la necessità di trattamenti ripetuti)

10 Possibili limitazioni della terapia genica Mancanza di necessità per disponibilità di terapie alternative Mancanza di efficacia Grandi problemi tecnici Costi Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

11 Attuali problemi tecnici della terapia genica Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) Selettività del sistema di trasferimento Espressione instabile nel tempo Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Problemi etici

12 Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica? Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili. Gene clonato. Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo. Non richiesta regolazione precisa del gene in questione.

13 Strategie terapeutiche Incremento della dose genica Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

14 Strategie terapeutiche Correzione mirata della mutazione genica Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo.

15 Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell espressione genica Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

16 Strategie terapeutiche Uccisione diretta di cellule patologiche

17 Terapia genica del cancro:! potenziamento della risposta immune!

18 Strategie terapeutiche Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario

19 Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando è entrato? Vettori non virali Vettori virali Integrazione casuale Integrazione sito-secifica

20 Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

21 Caratteristiche del Vettore ideale Efficiente: -infettare un numero di cellule elevato- In grado di raggiungere specificatamente le cellule bersaglio. Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica a livelli adeguati. Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o posttraduzionale) dell espressione del gene terapeutico. Non deve essere patogeno e ben tollerato. Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. Sebbene il vettore ideale non esista, tutte queste caratteristiche sono presenti, individualmente, nei vari vettori oggi disponibili

22 Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Bassi costi di produzione Possibilità di produzione in grandi quantità Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza Se si usano molecole di DNA a doppio filamento anche questi vettori possono dare mutagenesi inserzionale

23 Vettori non virali Liposomi

24 Vettori non virali Endocitosi mediata da recettore

25 Vettori non virali Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun)

26 Cosa si può far entrare nelle cellule con vettori non virali Plasmidi Molecole di DNA a doppio filamento lineari Oligonucleotidi DNA Oligonucleotidi Ribozimi Polipeptidi

27 Vettori virali In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: 1. Costruzione del genoma ricombinante 2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali 3. Raccolta e analisi del virus 4. Trattamento del paziente

28 Vettori virali: caratteristiche principali Retrovirus : possono infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. Lentivirus : derivati del virus dell'hiv, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale (malattie neuro-degenerative). Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie (cell. quiescenti). Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

29 Retrovirus Enveloped virus RNA genome (2 copies) dsdna enters into the nucleus and integrates upon mitosis Enters the cell by fusion LTR: viral transcription, polyad., replication, integration

30 Vettori retrovirali LTR! amphotropic! Gag! Pol! Env! Psi -! encapsidation cell line! Gag! Pol! Env! LTR! Psi -! ecotropic-momulv! LTR! ADA! Psi +! plasmid transfection!

31 Vettori retrovirali: evitare la ricombinazione Virus difettivo integrato! LTR! Gag! Pol! Env! Psi -! encapsidation cell line! Plasmide! Gene! LTR! Psi +! LTR! LTR! Gag! Pol! Env! Psi -! Gene! Psi +! Particelle virali! ricombinanti!

32 Trial clinico per deficit ADA

33 Retrovirus Trial on 2 ADA patients. Started years treatment. Results published in 1995 Science, Blaese et al!

34 Retrovirus Possono infettare solo cellule proliferanti Integrazione casuale nel genoma. Difficile produrli in grandi quantità (titolo elevato). Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle stem cells. Poco immunogeni. L espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. In assoluto sono vettori più utilizzati per la terapia genica.

35 Come infettare le cellule post-mitotiche? Lentivirus (HIV-1) Nuclear transport dependent Int (MA, Vpr) cppt-dna flap Oncoretrovirus X Mitosisdependent?

36 Lentivirus (HIV) Genoma complesso: geni strutturali gag pol env geni regolatori tat rev geni accessori nef vpr vpu vif Tropismo per linfociti e macrofagi Infezione persistente / malattia cronica progressiva

37 Lentivirus Particelle virali ibride difettive per la replicazione costituite da: Un set minimo di proteine del core derivate da HIV-1 Il pericapside di un virus non correlato (VSV or MLV) Un genoma contenente: una cassetta di espressione per il transgene affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1 non sono presenti geni virali

38 Vettore lentivirale di ultima generazione CMV GAG PRO POL RRE polya RSV REV polya SD SA Costrutti d incapsidazione CMV CMV SD SA VSV-G polya Costrutto codificante il pericapside RSV GA Ψ RRE GA cppt RRE hpgk PROMOTER GFP egfp Wpre Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) SD SA

39 Produzione del vettore CMV VSV-G polya CMV Ψ SD SA GAG PRO POL RRE TAT REV Costrutto di incapsidazione polya SD SA Envelope RSV SD GA Ψ RRE cppt GA SA RRE hpgk egfp Wpre PROMOTER Costrutto di trasferimento Trasfezione transiente Cellule 293T Raccolta a 24 e 48 ore Cellule HeLa Titolazione per diluizioni seriali Concentrazione per ultracentrifugazione

40 Lentivirus GFP expression 3 months after injection

41 Lentivirus Genoma ad RNA. A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e postmitotiche. Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) Scarsissime reazioni immunologiche. Elevata efficienza di trasduzione. Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

42 Adenovirus

43 Vettori adenovirali Δ E1 Transgene MLP VA Late genes (L1-L5) Δ E3 ITR ITR E4 E1 E2 3.6 kb 293 cells ITR

44 Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di riudrre immunogenicità e aumentare le dimensioni degli inserti.

45 Adenovirus Genoma di DNA doppio filamento. Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato). Forti reazioni immunologiche.

46 Ciclo vitale degli AAV! Fase latente! Fase litica! Ad! Integrazione sito-specifica! Ad!! Replicazione!

47 Adeno-Associated Virus (~4.7 kb) Struttura genomica dei Virus Adeno Associati Replicazione del DNA Integrazione e Rescue Proteine del capside: VP1, VP2, VP3 AAV Struttura e Produzione: + 1) Plasmide esprimente i geni rep e cap 2) Adenovirus helper

48 AAV, infezione di neuroni!

49 Vettori adeno-associati (AAV) Genoma di DNA singolo filamento. Virus difettivo che richiede per la produzione la contemporanea presenza di un adenovirus. Possono infettare cellule proliferanti e postmitotiche. Facile produrli in grandi quantità Integrazione sito specifica in un unico locus innocuo (Cr.19), quindi assenza di mutagenesi inserzionale. Espressione stabile nel tempo. Inserti di dimensioni limitate. Efficienza di trasduzione variabile. Poco efficace se purificato bene.

50 Adeno-Associated Virus (~4.7 kb) Situazione attuale e prospettive future Pro efficiente trasduzione in vivo di cellule sia quiescenti che in attiva replicazione espressione prolungata del transgene (descritte sia forme episomali che integrate) bassa immunogenicità Contro la massima capacità di impaccamento è 4,5 kb con il sistema di produzione attuale si ottengono preparazioni a titolo relativamente basso e contaminate da virus Sviluppi futuri: miglioramento dei sistemi di produzione aumento dell efficienza di integrazione sito-specifica

51 Herpes Simplex Virus (HSV)! (ds DNA 152Kb, >70 genes) genome Latency transcripts Latency promoter

52 Herpes Simplex Virus (HSV)! Genoma di DNA doppio filamento molto grande (152 kb) e complesso (>70 geni). Spiccato neurotropismo. Nelle cellule infettate è in forma episomica in uno stato latente. Possibile inserire geni molto grandi. Forti reazioni immunologiche. Presenza di anticorpi contro il virus in un elevata percentuale di casi.

53 Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana?! Il problema principale della terapia cellulare è l istocompatibilità>rigetto La clonazione permetterebbe di ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto dopo la correzione del difetto.

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56 Potenzialità di combinazione tra terapia genica e purificazione cellule staminali!

57 Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana?! Cellula somatica normale Ovocita Cellule somatiche paziente Cellule totipotenti sane istocompatibili

58 Terapia genica del cancro:! sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci! TK

59 Vectors for gene therapy according to (june 1999) Adeno Lipo Retro r!e!t!r!o!v!i!r!u!s! l!i!p!o!s!o!m!e! a!d!e!n!o!v!i!r!u!s! r!e!t!r!o!!p!r!d!!c!l! v!a!c!c!i!n!i!a! n!a!k!e!d!!d!n!a! o!t!h!e!r!s!!

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