MUTATION DETECTION DIRECT SEQUENCING OF DNA FRAGMENTS

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1 MUTATION DETECTION DIRECT SEQUENCING OF DNA FRAGMENTS

2 DIRECT SEQUENCING TTCACTGAGAGTCGC TCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCGAGC TTCACTGAGAGTCGG TCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCCAGC wt mut wt wt/mut mut

3 The Sanger method 07_01.jpg

4 Sequenza del DNA con il metodo Sanger

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8 Sequenziamento automatico con il metodo di Sanger

9 Whole genome sequencing of single individuals

10 Next Generation Sequencing Based on technologies different from Sanger allowing simultaneous sequencing of millions of base pairs: 1-template preparation and immobilization 2-sequencing 3-imaging

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14 Pyrosequencing: sequenza il DNA mentre la sintesi di una nuova molecola avviene. I dntps sono aggiunti sequenzialmente e non tutti insieme come nel metodo Sanger. Quando un dntp viene incorporato nel frammento neo-sintetizzato si libera un segnale luminoso che viene registrato. Sulla base dell aggiunta sequenziale di ciascuna dntp sappiamo quale base viene incorporata in corrispondeza di ciascun segnale luminoso che viene liberato.

15 Next Generation sequencing basato su pyrosequencing (tipo 454 Life Sciences o Solexa di Illumina) -Il DNA genomico viene frammentato e denaturato in singoli filamenti. -I SS vengono immobilizzati su biglie (1 SS/biglia). - Da un SS si fanno mediante PCR 10e6 copie/biglia. -1 biglia viene depositata in un pico pozzetto (ogni piastra contiene 1.6x10e6 pozzetti). -in ciascun well avviene una reazione di pyrosequencing.

16 Next Generation Sequencing Il pyrosequencing iterativo permette di sequenziare miliardi di basi allo stesso tempo, circa volte piu di quanto si riusce a fare con il dideoxy sequencing automatizzato. Questo permette di sequenziare interi genomi individuali in poco tempo a bassi costi

17 Arricchimento di sequenze target per successive sequenze: sequenza dell intero esoma o sequenza di esomi specifici per un gruppo di malattie

18 Nomenclatura delle varianti di sequenza

19 Interpretazione delle varianti di sequenza Mutazioni con perdita di funzione: grosse delezioni, frameshifts, nonsenso, mutazioni di splicing sono probabilmente cuasative

20 Interpretazione delle varianti di sequenza Sostituzioni nucleotidiche: malattia dominante con genitori sani: sostituzione de novo ha piu probabilita di essere causativa di una ereditata da uno dei genitori che sono sani se la malattia e familiare: segregazione della mutazione con la malattia: se segrega e possibile (ma non dimostrato che e causativa), se non segrega non e causativa (assumendo un alta penetranza)

21 Interpretazione delle varianti di sequenza Sostituzioni nucleotidiche: Testing di individui sani della stessa etnia: se la variante si trova in maschi e femmine sani esclude malattie gravi, a esordio precoce dominanti e legate all X. Se la condizione e recessiva o dominante a bassa penetranza non si puo escludere la patogenicita della variante. Varianti molto rare (frequenza <0.01) non possono essere escluse utilizzando l analisi di individui sani perche l assenza virtuale di fenotipo significa che ci possono essere individui pre-sintomatici con varianti patogeniche)

22 Interpretazione delle varianti di sequenza Sostituzioni nucleotidiche: Testing di individui sani della stessa etnia: Varianti molto rare (frequenza <0.01) non possono essere escluse utilizzando l analisi di individui sani perche l assenza virtuale di fenotipo significa che ci possono essere individui pre-sintomatici con varianti patogeniche)

23 Interpretazione delle varianti di sequenza Sostituzioni nucleotidiche: Database di mutazioni: NHLBI exome sequencing project; human gene mutation database; dbsnp Mutazioni missenso che cambiano un aa in uno di una classe differente. Uso di software (interactive-biosoftware.com o PolyPhen-2 o SIFT) per predire il cambio conformazionale

24 Interpretazione delle varianti di sequenza Sostituzioni nucleotidiche: Evoluzione conservativa di un residuo

25 Interpretazione delle varianti di sequenza Sostituzioni nucleotidiche: Studi funzionali in vitro: trasfezione del cdna muante e caratterizzazione della attivita biologica (facile per un enzima. Piu difficile per una proteina di membrana o un fattore trascrizionale) Studi funzionali in vivo: generazione di un modello animale (complesso e costoso)

26 Interpretazione delle varianti di sequenza Varianti di incerto significato clinico: in regioni non-codificanti (a parte le giunzioni esone-introne sono di difficile interpretazione funzionale) In regioni codificanti: delezioni o inserzioni in frame, alcune variazioni sinonime e mutazioni missenso

27 Interpretazione delle varianti di sequenza Varianti di incerto significato clinico: possono essere migliaia a livello di intero esoma e milioni a livello di intero genoma: difficolta interpretazione nel contesto della consulenza genetica progetti su larga scala tipo ENIGMA cercano di catalogare queste varianti e testarne in laboratorio il significato funzionale

28 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Paura di discriminazione genetica, per esempio sul posto di lavoro o con le compagnie di assicurazione: risolto da leggi che proteggono la privacy dell informazione genetica. Sviluppo di databases online (ClinVar) che offrono gratis la correlazione tra molte varianti e dei fenotipi.

29 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Il progetto 100K genomi che mira al sequenziamento dell intero genoma di 100K individui entro il 2017 in UK, apre problemi etici relativi a ritrovamenti accidentali e la comunicazione di informazioni genetiche Ritrovamenti accidentali sono scoperte fatte nel contesto di esami genetici che non sono correlate alla condizione medica per la quale era stato richiesto il test genetico. Devono essere communicate e come?

30 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Scoperte accidentali sono sempre avvenute nella pratica medica: si fa un test del sangue e si scopre di essere ipercolesterolemici, oppure una risonanza e si scopre di avere un aneurisma cerebrale. Gia l avvento dell array CGH ha aumentato di molto scoperte accidentali rispetto al cariotipo standard. Ma il sequenziamento di nuova generazione ha portato le scoperte accidentali ad un livello completamento diverso.

31 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Scoperte accidentali di varianti confermate e associate a malattie per le quali e possibile intervenire devono essere communicate La pubblicazione Green et al ACMG, 2013 riporta varianti patologiche in 57 geni associati a condizioni mediche per le quali esiste un intervento e che dovrebbero pertanto essere communicate.

32 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Per tutte le varianti non chiaramente associate a condizioni del genere la comunicazione dell informazione genetica e molto meno codificata e piu controversa. A breve la sequenza dell intero genoma potra essere applicata su larga scala come screening nei neonati. Alcuni sono a favore di questo, altri ritengono che questo violerebbe il diritto all autonomia di un individuo

33 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Lo screening neonatale con sequenziamento dell intero genoma rivelerebbe molte varianti che non sono rilevanti nell immediato per la salute del bambino, ed altre che potrebbero avere delle serie conseguenze piu avanti nella vita.

34 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Comunicarle subito priverebbe il bambino del diritto di NON conoscere il proprio profilo genetico o di ritardare la comunicazione della informazione genetica ad un eta piu avanzata. Senza cosiderare il danno psicosociale che la conoscenza di un informazione di questo tipo porterebbe

35 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Il costo del sequenziamento di un genoma di meno di $1000 permette una sua applicazione massiva con conseguenze enormi sulla salute degli individui. Per esempio il sequenziamento applicto ai tumori permette di stratificarli per identificarne le terapie piu adatte La possibilita di avere in un giorno o due la sequenza del genoma di un individuo potrebbe salvare la vita di neonati affeti da malattie acute

36 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Sulla base della sequenza di un individuo si potra scegliere il tipo di farmaco piu adatto o la dose Nel caso di malattie infettive il sequenziamento del ceppo infettante nell arco di ore potrebbe aiutare a debellare epidemie

37 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Ma tutte queste informazioni (vedi progetto 100K genomi) pongono anche dei problemi: i medici (inclusi genetisti esperti) avranno difficolta a leggerle e comprenderle L interpretazione di varianti non chiare e difficile La conservazione di queste informazioni diventa complessa: se consideriamo che 3.2 miliardi di nucleotidi occupano 800Mb di memoria ma che nell deep sequencing ciascun nucoletide e letto molte volte un singolo genoma occupa 100 Giga

38 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Nel 2013 il cloud del Baylor College of Medicine in collborazione con DNAnexus e Amazon Web services ha conservato le sequenze di 3700 genomi interi e esomi interi in migliaia di terabytes di memoria.

39 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Ma come fare per evitare che questo causi ingorghi del sistema tipo quello del traffico di New Delhi?

40 Aspetti etici e pratici sollevati dallo sviluppo di next generation sequencing Una possibilita sara un volta stabilita la sequenza di un genoma di riferimento di annotare solo le differenze nucleotidiche di ciascun individuo rispetto a questo

41 Medici Genetisti Test genetici Consultorio Genetico

42 Sommario 1. Introduzione ai concetti di base di test genetico applicato alle malattie ereditarie 2. Breve descrizione della situazione internazionale ed italiana 3. Alcuni suggerimenti operativi 4. Prospettive future

43 Il test genetico: i concetti di base Un fantasma si aggira per l Europa

44 Definizione Il test genetico è l analisi di DNA, RNA, cromosomi, proteine o metaboliti umani al fine di identificare alterazioni correlate a malattie ereditarie.

45 Modi per effettuare un test genetico Un test genetico può essere effettuato: 1) Attraverso l analisi diretta del DNA o RNA (Test Diretto) 2) Attraverso l analisi di marcatori genetici coereditati con il gene che causa la malattia (Test Indiretto o per Linkage) 3) Attraverso l analisi di metaboliti (Test Biochimico) 4) Attraverso l esame dei cromosomi (Test Citogenetico)

46 Modi per effettuare un test genetico Un test genetico può essere effettuato: 1) Attraverso l analisi diretta del DNA o RNA (Test Diretto) 2) Attraverso l analisi di marcatori genetici coereditati con il gene che causa la malattia (Test Indiretto o per Linkage) 3) Attraverso l analisi di metaboliti (Test Biochimico) 4) Attraverso l esame dei cromosomi (Test Citogenetico)

47 Punti da considerare 1) I test genetici possono essere usati per il management medico di un paziente ma anche per prese di decisione personali 2) In generale i risultati di un test genetico hanno impatto non solo sul paziente ma anche su i suoi familiari. Questo pone la necessità che l attività di test genetico SIA SEMPRE ACCOMPAGNATA DAL CONSULTORIO GENETICO 3) Poiché la maggioranza delle malattie ereditarie sono rare, i test genetici in genere sono offerti solo da laboratori specializzati 4) Gli intensi sforzi della scienza in questo campo esitano in uno sviluppo rutilante di nuove scoperte e nella possibilità continua di nuovi test. Questo deve trovare riscontro in un continuo aggiornamento da parte di chi, i medici, questi test deve richiedere e di chi, in laboratorio, questi test deve eseguire.

48 Tipi di test genetico Test diagnostico Test predittivo Test di carrier Test prematrimoniale Test prenatale Test genetici ausiliari

49 Test Diagnostico E usato per confermare o escludere un disordine conosciuto o sospetto in un individuo sintomatico.? Malato

50 Punti da considerare 1) Il test genetico può condurre ad informazioni a piu basso costo e a minore rischio che altre procedure 2) Il test diagnostico è appropriato per individui sintomatici di ogni età 3) La conferma diagnostica puo alterare il management medico dell individuo 4) Il test diagnostico può avere effetti sull atteggiamento riproduttivo e sociale degli altri componenti della famiglia 5) Il test genetico NON è sempre la migliore via per diagnosticare una malattia

51 Test predittivo E offerto ad individui asintomatici con storia familiare di una malattia genetica. I test predittivi sono di due tipi: a) presintomatici (l eventuale sviluppo di sintomi è certo se la mutazione viene riscontrata; es Corea di Huntington) b)predisposizionali (l eventuale sviluppo dei sintomi è probabile ma non certo se la mutazione viene identificata; es. carcinoma della mammella) Portatore Sano Malato Portatore Sano?

52 Punti da considerare 1) Il test predittivo è INDICATO DAL PUNTO DI VISTA MEDICO solo se la diagnosi precoce permette interventi che riducano morbilità e mortalità 2) Anche in assenza di indicazioni mediche, il test predittivo può influenzare le decisioni di pianificazione familiare 3) Per gli importanti impatti psicologici, estrema cura va posta nell attività di informazione del paziente, nel consultorio genetico e nel follow-up 4) E necessaria la documentazione di un consenso informato e di una attività consultoriale 5) Prima del test predittivo è necessario identificare con certezza la mutazione nel parente affetto 6) Il test predittivo in bambini asintomatici quando non sia possibile un intervento medico è fortemente scoraggiato

53 Percorso del Test predittivo Richiesta Drop out Il paziente rifiuta il test Consultorio genetico Il paziente accetta il test Esecuzione dell analisi Follow up lungo Mutazione presente Mutazione assente Esposizione dei risultati Follow up corto

54 Test di carrier E praticato al fine di identificare individui che hanno una mutazione genetica causa di malattie ereditarie recessive (autosomiche o X linked). I carrier non hanno i sintomi della malattia. Il test è offerto a individui che hanno membri della famiglia affetti, membri della famiglia carrier o appartengono a comunità genetiche con una alta presenza di quella mutazione. Portatore Sano Portatore Sano Malato?

55 Punti da considerare 1) Identificazione dei carrier indirizza scelte riproduttive 2) Il test nei carrier dovrebbe essere accompagnato da consultorio genetico per il potenziale impatto personale e sociale 3) Può essere necessario tipizzare il soggetto affetto in una determinata famiglia per determinare con certezza la presenza di un carrier

56 Diagnosi prematrimoniale Portatore Sano Portatore Sano?

57 Test prenatale Viene eseguito durante la Portatore Sano gravidanza per determinare lo Portatore Sano stato di salute di un feto. Il test genetico prenatale viene offerto quando c è un aumentato rischio? di avere un bambino affetto a causa di storia familiare, età materna, analisi ecografica, analisi biochimiche. I test si effettuano di routine attraverso amniocentesi e analisi dei villi coriali (CVS). Procedure più specializzate includono la biopsia placentale, il prelievo di sangue fetale e la biopsia cutanea fetale. Malato

58 Punti da considerare 1) Tutte le procedure di diagnosi prenatale presentano un rischio per il feto e per la gravidanza. E necessario quindi richiedere un consenso informato e provvedere ad un opera di consultorio genetico. 2) Prima di procedere all analisi la mutazione deve essere caratterizzata nel familiare affetto 3) Il test prenatale per malattie dell adulto ad esordio tardivo è controverso. Gli individui che vogliono sottoporsi a tali esami dovrebbero in ogni caso essere indirizzati ad un consultorio genetico

59 Test genetico preimpianto Il test preimpianto è effettuato su embrioni precoci dopo fertilizzazione in vitro al fine di diminuire la possibilità che il feto soffra di una malattia genetica. Esso è generalmente offerto a coppie con una alta possibilità di avere un figlio con una malattia grave. Questo tipo di test si pone come alternativa alla diagnosi prenatale e al conseguente (a volte) aborto terapeutico.

60 Punti da considerare 1) Questo test è disponibile solo per un limitato numero di malattie 2) E un test tecnicamente difficile e qualche volta si possono avere problemi nell ottenere DNA in quantità sufficiente 3) E molto costoso

61 Screening neonatale Esso identifica individui che hanno un aumentata possibilità di avere una specifica malattia genetica il cui trattamento può essere cominciato il prima possibile

62 Punti da considerare 1) gli screening neonatali sono di solito regolati da leggi nazionali e regionali, eseguiti alla nascita di routine a meno che ci sia uno specifico rifiuto da parte dei genitori 2) generalmente essi non sono direttamente diagnostici ma indirizzano i sospetti verso ulteriori indagini 3) molti genitori non sanno neanche se e quali di essi vengono praticati 4) cautela va messa nei casi positivi per evitare errori di interpretazione da parte dei genitori

63 Test genetici ausiliari Test di paternità Test di zigosità Banca del DNA

64 Test di paternità In questo tipo di test vengono comparate sequenze di DNA di un adulto e di un bambino per stimare la probabilità che i due abbiano rapporti di parentela. La maggioranza delle richieste di questa analisi è di tipo sociale, ma alcune volte, lo stabilire la paternità, si rende necessario per l interpretazione dei dati familiari

65 Punti da considerare 1) Un particolare individuo può essere escluso come genitore biologico usando questo test, ma non può essere confermato in maniera assoluta. 2) Non esiste una metodologia unica per tutti i laboratori e questo rende l affidabilità statistica molto variabile

66 Test di Zigosità Il test di zigosità compara le sequenze di DNA di individui provenienti da una gestazione multipla (gemelli, triplette, ecc,) al fine di stabilire se sono monozigoti (identici) o dizigoti (fratelli). L indicazione medica risiede nei trapianti d organi (fratelli monozigoti sono i donatori migliori) e nella suscettibilità a malattie (se un fratello monozigote è affetto l altro è ad altissimo rischio)

67 Punti da considerare 1) Se si considera il caso di un test genetico per malattia, la zigosità diventa fondamentale perché l esito del test si applicherebbe anche all altro 2) Non esiste una metodologia unica per tutti i laboratori e questo rende l affidabilità statistica molto variabile

68 Banca del DNA Questo è un servizio accessorio che può risultare utile. Esso consiste nella estrazione del DNA da cellule e dalla sua conservazione per test futuri. Il DNA è stabile per anni. Questo servizio può essere richiesto da: 1) Malati allo stadio terminale di una malattia, in cui si sospetti una componente genetica. In questi casi il test diagnostico potrebbe non essere utile al paziente, ma la conservazione dell informazione sul suo genoma potrebbe essere essenziale per l analisi dei suoi congiunti 2) Individui affetti da malattie per le quali non è ancora disponibile un test genetico 3) Persone che non vogliono sottoporsi attualmente al test, ma che si riservano di farlo in futuro Frozen cells GENETIC BANK DNAs Geneti c inform ations

69 Punti da considerare 1) E importante che i familiari siano d accordo, al momento del prelievo, su chi potrà avere l accesso alle informazioni dopo la morte del donatore 2) Una accurata documentazione deve essere provvista sul prelievo in banca al fine che i membri della famiglia sappiano della sua esistenza

70 Il test genetico: lo stato attuale nel mondo

71 Numero di mutazioni causa di malattie umane scoperte per anno up to

72 Mutazioni al As of , HGMD contains mutations in 1929 genes

73 La madre di tutti i problemi Eterogeneità genetica: La stessa malattia genetica può essere causata da differenti mutazioni In differenti geni = Eterogeneità di locus Nello stesso gene = Eterogeneità allelica In ogni caso: Per diagnosticare una singola malattia bisogna cercare molte mutazioni

74 Pericolo Ieri E possibile fare un test genetico per questa malattia? No, mi spiace, ma il gene non è stato ancora identificato Oggi E possibile fare un test genetico per questa malattia? No, mi spiace, ma ci sono troppi geni e troppe mutazioni da analizzare

75 Conclusioni Le limitazioni ad un utilizzo più ampio dei test genetici consistono nella difficoltà tecnica della loro esecuzione insieme all alto grado di eterogeneità genetica delle malattie. Per questo motivo ogni laboratorio tende specializzarsi in un limitato numero di malattie, frammentando l offerta diagnostica

76 Soluzione: la rete

77 Alcuni suggerimenti pratici per rispondere a domande imbarazzanti? Non pretendo di avere tutte le risposte. A dire la verità non m'interessano nemmeno tutte le domande.

78 Domande A mio fratello è stata diagnosticata l atassia di Friedreich. Dove potrei praticare il test genetico di carrier??

79 Internet

80 Alcuni siti utili Test genetici disponibili nel mondo (Si può raggiungere via NCBI) Test genetici disponibili in Italia

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94 Il Futuro Non faccio mai previsioni, specialmente sul futuro. Sam Goldwyn Mayer

95 Alcune previsioni (non mie) In Europa, secondo previsioni affidabili, il settore crescerà rapidamente nel corso dei prossimi anni ed entrerà a far parte della prassi medica convenzionale rivestendo un ruolo sempre maggiore nella diagnosi e nelle previsioni riguardanti la salute di un individuo. I servizi di analisi potranno essere offerti anche a livello transnazionale o transcontinentale, dato che non vi è alcun motivo per cui le analisi debbano essere effettuate in prossimità della fonte del campione del paziente. Alcune società negli Stati Uniti già reclamizzano su Internet servizi di analisi genetiche destinati al pubblico. A condizione che siano adottate adeguate politiche regolamentari, si assisterà allo sviluppo di un importante mercato globale competitivo per gli esami genetici.

96 In quali campi? Malattie comuni Farmacogenetica

97 Scenari futuri: incubi? Considerata la natura multifattoriale delle malattie la cui componente genetica potrà essere identificata dai test, è ragionevole pensare che la tendenza terapeutica possa essere orientata alla modificazione dei comportamenti e degli stili di vita

98 Farmacogenetica Per farmacogenetica si intende la differente sensibilità individuale su base genetica ai farmaci Test genetici potranno personalizzare le terapie

99 The end