IL RUOLO DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE Anna Barbui S.C. Microbiologia e Virologia U Città della Salute e della Scienza di Torino

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1 IL RUOLO DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE Anna Barbui S.C. Microbiologia e Virologia U Città della Salute e della Scienza di Torino Torino 17 febbraio 2016

2 RISULTATI DI 11 ANNI DI ATTIVITÀ ( )

3 Dal Protocollo operativo luglio 2008 Il ruolo del laboratorio di microbiologia nel contesto della sorveglianza delle infezioni batteriche invasive Laboratorio ospedaliero: Esami urgenti di primo livello meningite: esame chimico- fisico, gram ricerca antigeni, esame colturale, emocoltura sepsi/polmonite: emolcoltura Per un ottimale attuazione del sistema di sorveglianza è cruciale potenziare le capacità di laboratorio in sede periferica Laboratorio di riferimento Regionale: Tipizzazione ceppi batterici isolati 1 livello Indagini molecolari per ricerca/conferma agenti eziologici Laboratorio di riferimento Nazionale: Tipizzazione ceppi batterici Studi epidemiologici su vasta scala

4 Liquor con agente eziologico non identificato Ceppi di S. pneumoniae Ceppi meningococco Ceppi H.influenzae Ricerca mediante PCR agenti batterici di meningite su Liquor Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Tipizzazione molecolare di H.influenzae Stoccaggio e spedizione ceppi

5 Diagnosi di laboratorio delle meningiti: I punti FONDAMENTALI corretta raccolta dei campioni clinici non esiste un esame di laboratorio con affidabilità, rapidità,sensibilità, specificità ottimali UTILIZZARE SEMPRE TUTTI I TEST DI LABORATORIO DISPONIBILI: Esame chimico- fisico Esame microscopico Esame colturale (liquor e sangue) Ricerca antigeni (liquor e urina) PCR (in laboratori adeguatamente attrezzati) tutte le metodiche in PCR per target batterici devono essere considerate di impiego eclusivamente epidemiologico mancandone l adeguata validazione clinica. (PDM AMCLI 2008)

6 Gennaio 2005/Dicembre campioni di liquor

7 Ricerca del DNA batterico con PCR: MICRORGANISMI IDENTIFICATI: Neisseria meningiditis Streptococcus pneumoniae Haemophylus influenzae Escherichia coli Klebsiella spp Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Real time PCR multiplex In caso di sospetto clinico per altri patogeni è possibile allestire test per la ricerca di MTB complex, microrganismi agenti di sepsi e sequenziamento regione 16rRNA del genoma batterico

8 MICRORGANISMI IDENTIFICATI NEI 329 LIQUOR PCR negativa 54% S.pneumoniae 22% N.meningitidis 13% Altro 3% Listeria H.Influenzae 2% 2% S.Agalactiae 3% con PCR: Diagnosi/Conferma 46% dei casi

9 MICRORGANISMI IDENTIFICATI NEI 329 LIQUOR ALTRO 30 SA 20 HI 10 NM 0 SP NEG

10 Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Identificazione/conferma di N. meningitidis gene crga Identificazione dei sierogruppi A gene orf-2 B, C, Y, W-135 gene siad PCR multiplex da campione o da ceppo Si allestiscono 3 reazioni di PCR per ciascun campione Gli amplificati vengono distinti in base al peso molecolare

11 Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Da gennaio 2009: 89 Tipizzazioni Ceppi NM 66 Liquor con PCR

12 Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis 80 B C W-135 Y NT

13 Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae La capsula è il principale fattore di virulenza Di distinguono circa 90 antigeni capsulari Circa un quarto sono frequentemente causa di malattia invasiva Si utilizzano: Pool di antisieri (n.12): checkerboard Antisieri di gruppo (n. 21) Antisieri di tipo (n. 25) Antisieri fattoriali (n.64)

14 Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae Sierotipizzazione di ceppi di S. pneumoniae isolati da sangue o liquor in pazienti da 0 a 14 anni di età 118 ceppi isolati pediatrici nel periodo Vaccinazione 13 V

15 Ceppi di Streptococcus pneumoniae pediatrici identificati F 15B 7B/C 23B 33D 33F NT 22F 23F 19F 1 19A 14 9V 7F 3 6B 5 6A 4 Tot: 63 ceppi 82% ceppi contenuti nel vaccino 13V

16 Ceppi di Streptococcus pneumoniae pediatrici identificati F NT 33 A/B/C 38 15B 15C 1 15A 3 12F 4 7F 6B 11A 9N 10A F 19F 14 19A Tot: 55 ceppi 52.5 % ceppi contenuti nel vaccino 13V

17 Ceppi di Streptococcus pneumoniae adulti identificati Tot: 557 ceppi

18 Ceppi di Streptococcus pneumoniae adulti identificati ceppi 13V ceppi NV 43 % Ceppi presenti nel vaccino 13V

19 Sensibilità ceppi di S. pneumoniae

20 Sensibilità ceppi di S. pneumoniae (circa 600 ceppi) 100% 90% 80% 70% 60% 50% R I S 40% 30% 20% 10% 0%

21 Percentuale di resistenza ceppi di S. pneumoniae (circa 600 ceppi) ,4 21, ,7 6,9 6,7 4,7 1,8 2,3 2,5 2, PG CFTX ER LVFL 5,5 3 1,9

22 Tipizzazione molecolare di H. influenzae PCR multiplex da campione o da ceppo Identificazione/conferma di H. influenzae (gene ompp2) Presenza della capsula (gene bexa) Identificazione dei sierogruppi con primers specifici per a, b, c, d, e, f

23 Tipizzazione molecolare di H. influenzae NT 8 6 F B NC/non B Da gennaio 2012: 48 ceppi Ceppi HI 38 Liquor con PCR + 10 sepsi 67% altro 4% polmonite 18% meningite 11%

24 QUALI CAMPIONI DI LIQUOR DEVO INVIARE? I campioni di Liquor di cui si sospetti una eziologia batterica (meningite primitiva) con test microbiologici negativi (microscopico, antigeni batterici e coltura) I campioni di Liquor di cui si sospetti una eziologia batterica (meningite primitiva) con microscopico e/o antigeni positivi e coltura negativa: la ricerca degli antigeni può dare cross reattività e deve essere confermata con la PCR. In caso di NM ed HI è possibile identificare il sierotipo mediante l analisi del DNA Nel caso di campioni di Liquor di cui si sospetti una diversa eziologia batterica o fungina è possibile eseguire altri test: ricerca del DNA batterico di specie diverse con sequenziamento ricerca del DNA di MTB complex ricerca dell antigene e del DNA di Aspergillus spp ricerca del DNA fungino di specie diverse con sequenziamento ricerca dell antigene di Criptococcus spp

25 COME DEVO CONSERVARE I CAMPIONI DI LIQUOR? Conservazione del campione Conservare a 4 C Non congelare Mantenere le condizioni di sterilità Se si centrifuga il campione: non inviare il surnatante, risospendere ed inviare tutto.

26 COME DEVO INVIARE I CAMPIONI DI LIQUOR? Quantità di campione Ideale 1 ml Minimo 200 ul Compilare l allegato 2 Dati anagrafici necessari: Cognome Nome Data di nascita Luogo di nascita (CF) + E possibile inviare i campioni dal lunedi al venerdi dalle 8 alle 15 Non è necessario telefonare preventivamente

27 COME RICEVERO I RISULTATI? Il laboratorio esegue i test richiesti in ore dal ricevimento del campione Possono essere necessari test di conferma che richiedono più tempo E emesso un referto che viene inviato via mail al SeREMI Il SeREMI inoltra i referti ai referenti delle ASL o AO Il costo dei test è a carico del laboratorio di Riferimento Per i campioni di liquor, se la ricerca del DNA batterico o altri test di approfondimento hanno significato diagnostico e sia necessario allegarli alla documentazione clinica deve essere inviata la richiesta per la prestazione vistata dalla direzione sanitaria.

28 Ceppi di QUALI CEPPI BATTERICI DEVO INVIARE? S. pneumoniae N. meningitidis H. influenzae L. monocytogenes Isolati da siti sterili (sangue, liquor, liquidi cavitari, biopsie, ecc.) COME DEVO CONSERVARE I CEPPI DA INVIARE? Conservare i ceppi a temperatura ambiente in busta CO 2. Questi ceppi sono molto delicati: se non è possibile inviarli effettuare sottocolture ogni 24 o al massimo 48 ore. Non conservare le colture in frigo

29 COME DEVO INVIARE I CEPPI BATTERICI? Inviare sottocolture recenti (per Sp 24 ore) Preferibilmente non inviare i ceppi il venerdì e prefestivi Accompagnare il ceppo con copia dell allegato 2 completo di tutte le informazioni richieste Compilare l allegato 2 Dati anagrafici necessari: Cognome Nome Data di nascita Luogo di nascita (CF)

30 CLINICI DIALOGO ISTITUZIONI LABORATORI OSPEDALIERI LABORATORI DI RIFERIMENTO MIGLIORAMENTO DISPONIBILITA Corretta raccolta dei campioni clinici Rafforzare il ruolo dei laboratori nella diagnosi eziologica Corretta gestione dei campioni da inviare per analisi successive Rispondere alle esigenze dei clinici e dei laboratoristi Valutazione delle problematiche della sorveglianza epidemiologica

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