Che cos e la citogenetica?

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1 Che cos e la citogenetica? Lo studio della: Struttura, funzione ed evoluzione dei cromosomi Comportamento dei cromosomi durante la divisione somatica e germinale La citogenetica nasce nel 1956 quando Tjio e Levan svilupparono tecniche per l analisi cromosomica e stabilirono che il numero di cromosomi umani in condizioni di normalita era 46.

2 Perche e importante studiare i cromosomi umani? Malattie cromosomiche costituiscono una grossa categoria di malattie genetiche. Perdita della capacita riproduttiva Malformazioni congenite Ritardo mentale Patogenesi dei fenomeni oncologici

3 Perche e importante studiare i cromosomi umani? Malattie cromosomiche costituiscono una grossa categoria di malattie genetiche Responsabili di > 100 differenti sindromi genetiche definite ed identificabili Sono piu comuni di tutte le malattie genetiche mendeliane da alterazione di un singolo gene Colpiscono l 1% dei nati vivi Colpiscono il 2% delle gravidanze

4 Isolamento di cromosomi umani da campioni ematici - sangue periferico Korf (2000) Figure 5-4

5 Piastra metafasica preparata da linfociti umani di sangue periferico Campione sangue periferico+ fitoemoagglutinina (agglutina globuli rossi e stimola linfociti). Cellule vengono bloccate in mitosi con inibitore microtubuli (es. colchicina). Cellule vengono lisate e e cromosomi metafasici colorati ed esaminati al microscopio.

6 Telomero p Paio di cromosomi omologhi Centromero Cromatidi non fratelli Centromero q Cromatidi Telomero fratelli

7 Centromero unisce i due cromatidi fratelli per un appropriata segregazione alla mitosi ed alla meiosi e il sito di formazione del cinetocoro, la struttura che lega i microtubuli del fuso e regola i movimenti dei cromosomi durante la divisione cellulare I telomeri proteggono le estremita dei cromosomi dalla degradazione e dalla fusione coda-coda con altri cromosomi

8 Come distinguiamo i cromosomi I cromosomi possono essere definiti (diverse nomenclature) in base alla dimensione, alla posizione del centromero ed al pattern di bande (bandeggio).

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10 Morfologia dei cromosomi Metacentrico cromosoma con area centromerica nel tratto centrale della sua lunghezza. I due bracci p e q risultano di uguale lunghezza (1,3,16,19,20) Submetacentrico cromosoma con area centromerica non equidistante dalle due estremità. I due bracci risultano pertanto di ineguale lunghezza (p < di q) (2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,17,18,X,Y) Acrocentrico cromosoma con centromero in posizione subterminale (13,14,15,21,22)

11 Le bande dei cromosomi Le bande cromosomiche si definiscono sulla base del contenuto di DNA delle diverse porzioni del cromosoma. G-bands (scure): AT-rich, contengono meno geni trascritti R-bands (chiare): ricche in GC, contengono più geni trascritti Diversa risoluzione e diverse tecniche Per quello che riguarda la nomenclatura le bande di ciascun cromosoma sono numerate per convenzione a partire dal centromero, verso l estremita del braccio corto e del braccio lungo.

12 Bandeggio Giemsa o bandeggio G1(G-bands trattamento bland con tripsina seguito da colorazione Giemsa). Bande chiare e scure alternate

13 Nomenclatura del bandeggio Pattern di bande G del cromosoma 7 ad alta risoluzione. Il livello di risoluzione e 450 bande per corredo aploide (sinistra), 550 (centro) ed 850 bande (destra). Tecniche piu recenti permettono di esaminare i cromosomi in prometafase (maggiore risoluzione).

14 Definizioni diploide ed aploide Diploide: un set completo di materiale genetico consistente in coppie di cromosomi ognuno dei quali derivante da uno dei genitori. La maggioranza delle cellule animali, con eccezione dei gameti, sono diploidi. Il genoma umano diploide ha 46 cromosomi Aploide: Il corredo cromosomico presente nelle cellule germinali mature (spermatozoi ed ovociti). Nella specie umana il corredo cromosomico aploide corrisponde a 23 cromosomi.

15 Errori nella meiosi Molte delle anomalie cromosomiche che tratteremo si verificano durante il processo della meiosi. La non disgiunzione puo avvenire sia durante la meiosi I che nella meiosi II. Nella meiosi I, inoltre, errori nel processo di ricombinazione possono produrre delezioni cromosomiche, inversioni, traslocazioni e duplicazioni.

16 Conseguenze di una mancata disgiunzione meiotica normale meiosi II Normale meiosi I Coppie di cromosomi omologhi mancata disgiunzione mancata disgiunzione meiosi II Coppie di cromosomi omologhi

17 Cariotipo: patrimonio cromosomico di una cellula o di un individuo ed e costituito da cromosomi visualizzati con le tecniche esposte prima che vengono ordinati in gruppi in base alle dimensioni ed alla posizione del centromero

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19 Cariotipo In condizioni normali questo e costituito da 22 coppie di autosomi piu i due cromosomi sessuali XX, XY 46, XX 46, XY

20 Cariotipo Un cariotipo viene descritto indicando prima di tutto il numero di cromosomi, seguito dalla costituzione dei cromosomi sessuali e da qualsiasi anomalia di numero e di struttura per le quali ci sono delle nomenclature convenzionali.

21 Cariotipo Un cariotipo viene descritto indicando prima di tutto il numero di cromosomi, seguito dalla costituzione dei cromosomi sessuali e da qualsiasi anomalia di numero e di struttura per le quali ci sono delle nomenclature convenzionali. 47, XY, +21 indica maschio XY con 47 cromosomi di cui 1 cromosoma 21 in piu (sindrome di Down) 45, XY, der (14;21) (q10;q10) indica maschio XY con 45 cromosomi ed al posto di 1 cromosoma 14 e 21 normali si trova un cromosoma derivativo dalla traslocazione del braccio lungo (q) del 21 sul braccio lungo del 14.

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23 Come possiamo studiare i cromosomi umani? Utilizzando specifici tessuti ottenuti dall individuo Utilizzando sistemi di cultura In vitro

24 Quali tessuti si possono utilizzare per gli studi clinici? Adulti e bambini Linfociti estratti da sangue (3-5 ml) Fibroblasti ottenuti mediante biopsia cutanea

25 Quali tessuti si possono utilizzare per gli studi clinici? In epoca prenatale: Liquido amniotico (15-20 ml) Villi coriali Prodotto di concepimento

26 Origine dei tessuti (2) Cancro: Midollo osseo (~1 ml) tumori

27 Requisiti del tessuto da utilizzare per studi citogenetici? Campioni tessutali Freschi non fissati o congelati Devono contenere cellule in attiva divisione Devono poter essere coltivate Tutti questi campioni non fissati verranno utilizzati per la preparazione dei cromosomi

28 Che cosa vediamo al microscopio? Analisi al microscopio Fotografia digitale Analisi del cariotipo

29 Anomalie cromosomiche Sono responsabili del 50% degli aborti del 1 st trimestre di gravidanza 5% dei bambini/feti nati morti sono presenti in circa 0.5-1% su 200 nascite - Trisomia 21 - Sindrome di Down syndrome - Sindrome dell X Fragile Anomalie cromosomiche cellule somatiche sono presenti nei tumori

30 Anomalie cromosomiche Numeriche Riguardano cellule con un numero improprio di cromosomi normali Definiamo la ploidia. Euploidia multiplo esatto di N (N numero di cromosomi di un gamete normale). Diploidia 2N, triploidia 3N, tetraploidia 4N Aneuploidia- Monosomie, Trisomie Strutturali Riguardano cellule con uno o piu cromosomi anormali contenenti riarrangiamenti strutturali

31 Anomalie numeriche dei cromosomi Si verificano quando il numero normale dei cromosomi umani, 46, e a l t e r a t o c o n p o l i p l o i d i a, aneuploidia o mosaicismo

32 Poliploidia Quando una cellula presenta un eccesso di corredi cromosomici bilanciati con un multiplo n di 23 cromosomi, essa viene descritta come poliploide.

33 Triploidie e tetraploidie Cellule che presentano un numero triploide (3n) di cromosomi sono identificate come 69,XYY; 69,XXX; o 69,XXY. La triploidia puo derivare dalla fecondazione di un singolo ovocita da parte di due spermatozoi (dispermia) o da una difettosa meiosi nel corso della produzione di un gamete diploide. Si puo verificare anche la tetraploidia (92 cromosomi o 4n) che e di solito il risultato di un difetto verificatosi nella prima divisione zigotica. Sia triloidie che tetraploidie sono letali e risultano in aborto spontaneo.

34 TRIPLOIDIA Frequenza alla nascita = 1/ Frequenza negli aborti = 1/14 Cariotipo 69,XXY 57% Cariotipo 69,XXX 40% Cariotipo 69,XYY 3%

35 Aneuploidie Aneuploidia e il termine usato per descrivere una cellula in cui manca il singolo cromosoma di una coppia (monosomia) oppure vi e una copia eccedente di un cromosoma (trisomia) Acquisizione di un cromosoma: trisomia Perdita di un cromosoma: monosomia

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40 Cause dell aneuploidia

41 Conseguenze cromosomiche di una non-disgiunzione che si verifichi alla prima o alla seconda divisione meiotica

42 Monosomie e trisomie sono compatibili con la vita? Le monosomie come le trisomie sono quasi sempre letali a meno che non interessino un cromosoma sessuale. Vi sono tuttavia nell uomo tre trisomie compatibili con la vita: la trisomia 21 (sindrome di Down) la trisomia 13 (sindrome di Patau) la trisomia 18 (sindrome di Edwards)

43 Family of John Langdon Down John Langdon DOWN Mary Crellins , Royal Earlswood Asylum for Idiots Everleigh Lilian Reginald b John Percival b Norman

44 Pazienti osservati da J.Langdon Down Royal Earlswood Asylum for Idiots in 1880

45 Jerome Lejeune collego il fenotipo ad una trisomia del cromosoma 21

46 Down syndrome (47, +21) Frequenza circa 0.15% 1/800 nati vivi Ritardo mentale (I.Q ) Attesa media di vita molto migliorata: da circa 9 anninnel 1930 ai circa 60 anni di oggi Fattore di rischio per trisomia 21, eta materna

47 Trisomy 21

48 Cariotipo Sindrome di Down 47, XX, +21

49 Quali sono le cause della trisomia 90-95% dei casi la Sindrome di Down e dovuta ad una non disgiunzione meiotica 80% la non disgiunzione si verifica nella meiosis I Nel 95% dei casi il cromosoma 21 in piu e di origine materna Stretta correlazione con l eta materna 1-4% e dovuta a traslocazioni sbilanciate (di cui il 50% de novo ed il 50% ereditarie> Down familiare) 9% bambini Down nati da madri con eta <30 anni; solo 2% quelli nati da madri con eta >35 anni Nel 60% braccia lunghe cromosomi gruppo D (14); 40% cromosomi gruppo G (21 e 22; 90% 21q;21q maggior parte de novo) 1-3% dei casi si tratta di mosaico con contemporanea presenza di linea 47,+21, insieme alla linea normale euploide Manifestazioni cliniche attenuate

50 Correlazione della trisomia 21 con l eta materna WHY?

51 Trisomy 21 Sindrome di Down

52 Segni clinici Sindrome di Down Ritardo nell accrescimento 100% Ritardo mentale 100% Occipite piatto 75% Orecchie ad impianto basso Anomalie dei dermatoglifi 85% Solco palmare trasverso Assenza unilaterale o bilaterale di una costola Ostruzione intestinale Ernia ombelicale Anomalie della pelvi Riduzione del tono muscolare 100% Faccia larga e piatta Rime palpebrali rivolte verso l alto Plica cutanea aggiuntiva occhi Naso corto e mento piccolo Ridotta distranza tra gli occhi (ipotelorismo) Mani piccole e corte (brachidattilia 65%) Palato piccolo ed arcuato Lingua grossa e Sporgente (macroglossia 50%) Anomalie dei denti Cardiopatia congenita nel 40% dei casi (DCAV) Anomalie gastrointestinali gravi nel 5% (stenosi/atresia duodenale, Hirshprung, ano imperforato) Alluce distanziato dalle altre dita

53 Ancora clinica sindrome di Down I bambini Down hanno un rischio di sviluppare leucemie volte maggiore, un aumentata suscettibilita alle infezioni, un aumentata frequenza di cataratta, disfunzioni tiroidee e segni d invecchiamento precoce. Praticamente tutti gli individui affetti dalla sindrome di Down che sopravvivono oltre i 35 anni mostrano le caratteristiche patologiche del morbo di Alzheimer. Con il miglioramento delle terapie mediche e chirurgiche l aspettativa di vita e passata dai 9 anni del 1930 ai quasi 60 di oggi.

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55 Trisomia del cromosoma 18 47, +18 Anche chiamata sindrome di Edwards 1/6000 nati vivi, ma piu comune al concepimento e frequente tra i bambini/feti nati morti Sintomi includono: basso peso alla nascita, gravi anomalie cardiovascolari, onfalocele e/o ernia, grave ritardo mentale, gravi malformazioni congenite 50% dei nati muore entro 1 mese, solo il 10% sopravvive a 12 mesi Di solito la morte sopraggiunge per polmoniti, problemi respiratori o difetti cardiovascolari Quelli che sopravvivono portano un grave ritardo dello sviluppo e la maggioranza non puo camminare

56 Paziente con trisomia 18

57 Trisomia del cromosoma 13, cariotipo 47, +13 Chiamata anche Sindrome di Patau 1/10,000 Sintomi includono: labioschisi, microftalmia, polidattilia postassiale, oloprosencefalia, severo ritardo mentale La percentuale di sopravvivenza e simile a quella della trisomia 18 95% delle trisomie 18 e 13 sono spontaneamente abortite durante la gravidanza

58 Sindrome da trisomia del cr. 13

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60 Anomalie numeriche di cromososmi sessuali Sindrome di Turner, monosomia cromosoma X Sindrome di Kleinfelter, trisomia

61 Monosomia dei cromosomi sessuali

62 Sindrome di Turner (45, X) Bassa statura Collo corto a tenda Pterygium colli Torace a scudo Iposviluppo mammelle con aumento della distanza tra i capezzoli Ovaie rudimentali Fenotipo femminile con disgenesia gonadica ed immaturita sessuale - 1/5000 nate vive - 4% feti (99% feti 45,X abortiti) - amenorrea primaria ed infertilita - intelligenza normale con deficit di specifiche abilita cognitive - difetti a carico del secondo cromosoma sessuale - puo originare sia da non disgiunzione meiotica (80% dei casi meiosi paterna) o da non disgiunzione mitotica - Possibile mosaicismo - Trattamento: ormone della crescita ed estrogeni per aumentare l altezza ed indurre caratteristiche sessuali secondarie

63 Paziente con sindrome di Turner, 45, X0

64 Trisomia dei cromosomi sessuali

65 Sindrome di Klinefelter (47, XXY) Alta statura Scarsa crescita della barba Ginecomastia con sviluppo mammelle di tipo femminile Distribuzione femminile peluria pubica Atrofia testicolare Fenotipo maschile - 1/1000 nati vivi - mancato sviluppo testicolare postpuberale con testicoli piccoli, azoospermia, responsabile d infertilita ed ipogonadismo (bassi livelli di testosterone) - aumentata frequenza patologie comportamentali - ritardo mentale lieve - eventi di non disgiunzione meiotica in relazione all eta parentale - possibili cariotipi 47,XXY; 48, XXXY; 49, XXXXY; 49,XXXYY. Piu cromosomi X sono presenti e maggiore e la probabilita che l individuo presenti ritardo mentale

66 Anomalie numeriche cromosoma Y La sindrome XYY unico fenotipo associato alta statura, normale sviluppo sessuale e normale fertilita aumentata incidenza di problemi comportamentali - 1/1000 nati vivi - derivano da non disgiunzione meiotica nella meiosi paterna /1000 detenuti di manicomi criminali - 48,XXYY 50 volte piu frequente tra i detenuti che nella popolazione di neonati Cromosomi Y addizionali possono essere associati ad anomalie comportamentali?

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69 Anomalie cromosomiche Numeriche Riguardano cellule con un numero improprio di cromosomi normali Strutturali Riguardano cellule con uno o piu cromosomi anormali contenenti riarrangiamenti strutturali Delezioni Duplicazioni Inserzioni Traslocazioni (reciproche e robertsoniane) Inversioni (pericentriche e paracentriche) Cromosomi ad anello Isocromosomi

70 Delezioni cromosomiche Una delezione causa la perdita di una porzione di cromosoma Delezione terminale Delezione interstiziali

71 Agenti che causano delezioni Calore Virus Radiazioni Sostanze chimiche Errori della ricombinazione

72 Emizigote Effetto delle delezioni

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74 Esempio di sindrome da delezione

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76 Duplicazioni La duplicazione causa l aumento del numero di copie di una particolare regione cromosomica

77 Inversioni L inversione si verifica per duplice rottura seguita da rotazione di 180 o del frammento compreso tra i punti di rottura e reinserimento dello stesso nel cromosoma. L ordine dei geni nel tratto reinserito risulta pertanto invertito. Se la regione compresa tra i punti di rottura non include il centromero l inversione si dice paracentrica; se invece comprende anche la regione centromerica, l inversione si dice pericentrica.

78 inversioni Paracentrica, braccio corto Paracentrica, braccio lungo Pericentrica

79 Isocromosoma Gli isocromosomi derivano da una fissione anomala dei centromeri e causano o duplicazione del braccio corto con delezione del braccio lungo (ISO p) o duplicazione del braccio lungo con delezione di quello corto (ISO q). In pratica si viene a costituire un cromosoma metacentrico costituito da due bracci identici (corti oppure lunghi).

80 Traslocazioni Aberrazioni cromosomiche associate col trasferimento di un segmento cromosomico in una nuova posizione del genoma e quindi su un altro cromosoma. Si possono riconoscere due tipi principali di traslocazioni: Reciproche Robertsoniane (fusioni centriche) - coinvolgono cromosomi acrocentrici

81 Traslocazioni La traslocazione Robertsoniana avviene tra due cromosomi acrocentrici. Questi cromosomi (13, 14, 15, 21 e 22) hanno solo il braccio lungo (q) che contiene geni, mentre il telomero è posizionato all estremità del cromosoma. Reciproca Robertsoniana

82 Traslocazione reciproca tra il Cromosoma 3 ed il cromosoma 21. I punti di rottura sul braccio lungo di ciascun cromosoma sono indicati nello schema dalla linea ondulata rossa (A). Il materiale derivante dal cromosoma 21 è indicato in rosso. I cromosomi derivati (der(3) e der (21)) sono indicati dalle frecce sul cariotipo

83 Traslocazione robertsoniana o fusione centrica, delle braccia lunghe dei cromosomi 14 e 21. Il materiale derivante dal cromosoma 21 è indicato in rosso nello schema (a). Il cromosoma derivativo è indicato dalla freccia sul cariotipo

84 Effetti delle traslocazioni In entrambi i casi di traslocazioni (reciproche e robertsoniane) se non si ha perdita di materiale essenziale e non vengono danneggiati geni dalla rottura e dalla successiva riunione, gli individui sono clinicamente normali, ma hanno un rischio aumentato di avere figli con riarrangiamenti cromosomici sbilanciati. In generale si parla di traslocazione bilanciata quando non c è perdita di materiale genetico e di traslocazione sbilanciata quando c è perdita di materiale genetico. Le traslocazioni sbilanciate sono ovviamente associate ad un fenotipo clinicamente osservabile

85 Siti fragili I siti fragili costituiscono marker cromosomiciche vengono ereditati come caratteri mendeliani semplici Vengono chiamati cosi perche in particolari condizioni create in vitro tendono a manifestare rotture cromosomiche Non sono mai presenti in tutte le cellule ma in percentuale molto variabile Possono essere espressione di specifiche patologie genetiche I piu comuni siti fragili sono 3p14; 16q23; Xp22; 6q26. Ne esistono circa 50

86 Come si evidenziano i siti fragili? Utilizzando terreni di coltura che interferiscano con il corretto funzionamento della DNA polimerasi necessaria ai meccanismi di riparo del DNA sensibili all acido folico (bassa concentrazione acido folico, alta concentrazione timidina) Indotti da BrdU, 5-azaticina, afidicolina

87 Sito fragile in Xq27.3: malattia di Martin Bell Terreno povero di folato o terreno con eccesso di timidina che inibisce la timidilato sintasi

88 Crosomoma ad anello La rottura riguarda le porzioni telomeriche del cromosoma. La perdita di queste porzioni rende molto appiccicose le estremita realizzando la formazione di un anello. Spesso si trova sotto forma di mosaico. La sintomatologia dipende dal grado di mosaicismo e dalla quantita di materiale genetico perduto durante la formazione dell anello.

89 Tratta da Gelehrter DT. Genetica medica masson Editore. Modificata da Hassold T.J.. Chromosome abnormalities in human reproductive wastage. Trends Genet, 1986; 2:

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92 Tecniche per evidenziare anomalie cromosomiche Studio del Cariotipo Fluorescent in situ hybridization FISH (locus specifica, painting) Comparative genomic hybridization (CGH)

93 Prometaphase spread cariotipo ad alta risoluzione

94 Fluorescence in situ hybridization FISH

95 Locus-specific probes. Esempio Prader- Willi Diagnosi mediante FISH di una delezione interstiziale nella sindrome di Prader- Willi utilizzando una sonda specifica per la regione critica sul cromosoma 15. Ch 15 centromere (green) Ch 15 PWS critical region (red)

96 Chromosome painting probes Piastra metafasica dopo ibridazione con sonde per i 24 differenti cromosomi

97 Chromosome painting probes Analisi mediante FISH di un paziente con una traslocazione autosomica sbilanciata che coinvolge il cromosoma 10. Painting probe per il ch 9 green, der Ch 10 freccia)

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99 Alterazioni cromosomiche nei tumori Anomalie cromosomiche delle cellule somatiche sono presenti in una varieta di tumori solidi e leucemie Nel linfoma di Burkitt si riscontra frequentemente una traslocazione reciproca di un pezzo dl braccio lungo del cromosoma 8 sul braccio lungo del 14 o meno frequentemente sul braccio lungo del 22 o del 2 Nella leucemia mieloide cronica abbiamo quasi sempre una traslocazione reciproca tra le braccia lunghe dei cromosomi 9 e 22 (Ph 1 o cromosoma Philadelfia)

100 Malattie rare ereditate come caratteri autosomici recessivi caratterizzate da una frequenza di rotture cromosomiche spontanee o indotte piuttosto alta con aumentato rischio di leucemie e tumori solidi Sindrome di Bloom Anemia di Fancomi Atassia Telengectasia

101 Indicazioni al cariotipo Anomalie congenite multiple soprattutto se associate a ritardo mentale Disordini della differnziazione sessuale Ritardo mentale senza diagnosi apparente Neoplasie ematologiche e malattie associate ad instabilita cromosomica Abortivita ripetuta Familiarita per malattie cromosomiche Gravidanza in donne in eta avanzata

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103 Esercizi cariotipi 46,XX 46,XY 46,XX,del(5p) inv(3)(p25q21) 47,XY,+der(1)mat 46,X,r(X) 46,XX,t(2;8)(q21;p13)

104 Esercizi cariotipi 47,XX,+21 45,XX,-14,-21,rob(14q21q) 46,X, Xq- 46,XY,4p- 46,XX/47,XX,+8