PROTOCOLLI OPERATIVI PER L ESECUZIONE DI TEST GENETICI NELL INFERTILITA DI COPPIA E IN PREPARAZIONE A PROCEDURE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA

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1 Allegato A PROTOCOLLI OPERATIVI PER L ESECUZIONE DI TEST GENETICI NELL INFERTILITA DI COPPIA E IN PREPARAZIONE A PROCEDURE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA Finalità del documento Il presente documento fornisce una serie di raccomandazioni che il Coordinamento Regionale scientifico e organizzativo per le attività di Genetica Medica ha predisposto, attraverso uno specifico gruppo di lavoro su Test genetici nell infertilità di coppia, con riferimento all impiego di test genetici per questa condizione e per le connesse procedure di fecondazione assistita e alla loro appropriatezza. Queste raccomandazioni si richiamano alle linee guida sui servizi di Genetica Medica, emanate dal Ministero della Salute il 14 luglio 2004, alle delibere della Regione Toscana in tema di attività di Genetica Medica (DCR 145/2004 e DGR 685/2005) - inclusi gli indirizzi operativi recentemente emanati (DGR 887 del ) - e a linee guida e raccomandazioni pubblicate su riviste nazionali e internazionali da parte di società scientifiche negli ultimi 5 anni (si veda la bibliografia): Premessa sullo stato dell arte L'infertilità di coppia si può definire come quella condizione in cui una gravidanza non è iniziata dopo 12 mesi di 'esposizione al rischio', cioè dopo 12 mesi di rapporti sessuali liberi. Dal punto di vista epidemiologico, il problema interessa il 16% delle coppie. Le cause di infertilità di coppia sono riconducibili in circa 1/3 dei casi a fattori maschili, in un altro 1/3 a fattori femminili, e nel restante 1/3 a fattori misti o sconosciuti. Quando la causa è maschile, nella metà dei casi si tratta di una azoospermia o di una oligozoospermia grave (<5x10 milioni/ml), mentre nell'altra metà l oligozoospermia è moderatalieve (>5x10 milioni/ml <20x10 milioni/ml). Quanto a situazioni particolari come quelle della POF, queste interessano 1 donna su 100 a tutte le età, 1 su in età <30 anni, e 1 su <20 anni. Le tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA), regolate in Italia dalla Legge 40/2004, comprendono le inseminazioni intrauterine (1 livello) e le fecondazioni in vitro (2 livello: FIVET, Fecondazione In Vitro con Embryo Tranfer, e ICSI, IntraCytoplasmic Sperm Injection). L impiego dei test genetici in soggetti infertili è aumentato nel corso degli ultimi anni per una serie di motivi, che includono: 1) l aumentata incidenza dell infertilità 2) l aumento delle conoscenze sulle cause genetiche dell infertilità, che ha reso disponibile un numero crescente di esami in grado di diagnosticare diversi tipi di anomalie genetiche 3) il ricorso crescente alle procedure di PMA, per le quali vengono spesso richiesti test genetici 4) in alcuni Paesi la PMA viene effettuata come fase preparatoria alla diagnosi genetica preimpianto per specifiche malattie non associate ad infertilità. In questo testo non viene fatto riferimento a questa specifica situazione, poiché essa non è contemplata dalla legislazione vigente in Italia.

2 Nel complesso, cause genetiche attualmente riconoscibili sono alla base del 10-20% dei casi di infertilità maschile e di una quota minore dei casi di infertilità femminile. Vengono discusse in questo ambito le principali condizioni genetiche associate ad infertilità, che rappresentano il più frequente oggetto di indagini diagnostiche. Per altre cause genetiche di infertilità, le indicazioni al test genetico sono molto limitate ed altamente specifiche, a causa della rarità delle relative condizioni cliniche, o ancora da definire previa dimostrazione del loro ruolo causale. 1. Anomalie cromosomiche. L associazione tra anomalie cromosomiche, rilevabili con l esame del cariotipo, e infertilità è nota da diversi decenni. Le anomalie cromosomiche associate a infertilità sono: - Anomalie del cromosoma X nel sesso femminile; queste sono associate alla sindrome di Turner e a quadri clinici analoghi, con amenorrea primaria o secondaria; alcune anomalie possono determinare insufficienza ovarica prematura con menopausa precoce. - Anomalie dei cromosomi sessuali nei maschi (sindrome di Klinefelter, riarrangiamenti strutturali del cromosoma Y); queste sono pressoché invariabilmente associate a sterilità con azoospermia. - Riarrangiamenti cromosomici bilanciati (generalmente traslocazioni reciproche bilanciate o robertsoniane e inversioni): in entrambi i sessi queste sono associate ad un considerevole aumento del rischio di aborto spontaneo, e, spesso, nella storia riproduttiva di queste coppie si registrano aborti ripetuti; nei maschi, questa classe di anomalie comporta un aumento del rischio di infertilità correlato a oligozoospermia grave-moderata (<10 milioni spermatozoi/ml) o azoospermia. La frequenza di traslocazioni robertsoniane è 10 volte più elevata tra i maschi infertili rispetto alla popolazione generale). Tuttavia, diversi maschi portatori di anomalie bilanciate sono in grado di indurre una gravidanza. 2. Microdelezioni del cromosoma Y. Le microdelezioni del braccio lungo del cromosoma Y rappresentano la seconda causa più frequente di infertilità maschile su base genetica, dopo le anomalie cromosomiche (Krausz e Degl Innocenti, 2006). La presenza di una microdelezione del cromosoma Y è associata ad un quadro clinico di azoospermia o oligozoospermia grave. La frequenza è del 10% circa nel gruppo dei pazienti azoospermici non ostruttivi, mentre è circa del 5-7% in quello degli oligozoospermici gravi (<5x10 milioni /ml). Tali delezioni non sono mai state riscontrate in soggetti normozoospermici. In caso di gravidanza, le microdelezioni del cromosoma Y vengono sempre trasmesse ai figli maschi. 3. Mutazioni del gene CFTR. Il gene CFTR è responsabile della fibrosi cistica (FC), una delle condizioni genetiche più frequenti nella popolazione italiana (prevalenza 1/2500-1/3500). La FC è trasmessa come carattere autosomico recessivo, e la frequenza di eterozigoti ( portatori sani), stimata in base alla prevalenza della malattia, si aggira intorno a 1/25 (4%) nella popolazione generale. L agenesia bilaterale dei vasi deferenti e delle vescicole seminali (CBAVD: Congenital Bilateral Agenesis of the Vas Deferens) è una una patologia associata a mutazioni del gene CFTR. Tale condizione è responsabile del 2% delle azoospermie ostruttive (post-testicolari). Mutazioni del gene CFTR si riscontrano in più del 50% dei pazienti con CBAVD. La diagnosi clinica e molecolare è importante in questi casi poiché è possibile procedere al prelievo di spermatozoi del paziente mediante TESE (TEsticular Sperm Extraction) e, inoltre, qualora anche la partner femminile sia eterozigote per una mutazione del gene CFTR, la coppia può essere ad elevato rischio di avere un figlio affetto da fibrosi cistica. 4. Premutazione del gene FMR1. Questa condizione è la seconda più frequente causa di insufficienza ovarica prematura (menopausa precoce; POF: Premature Ovarian Failure). Il suo riconoscimento è particolarmente importante perché le donne eterozigoti hanno un elevato rischio di avere figli con la mutazione completa del gene, che causa ritardo mentale. Poiché le indicazioni all esecuzione del test in relazione ad una condizione di infertilità sono già pressoché

3 universalmente adottate e dato che raramente donne con problematiche di questo tipo giungono ai centri dove viene eseguita PMA, questo argomento non sarà ulteriormente preso in considerazione. L impiego dei test genetici nell ambito dell infertilità di coppia ha finalità in primo luogo diagnostiche, ma può consentire anche di formulare previsioni sul rischio riproduttivo e di utilizzare, in alcuni casi, la diagnosi prenatale. Inoltre, spesso questi test vengono utilizzati come test di screening per le coppie candidate alla fecondazione in vitro. La dimensione del problema in Toscana Allo stato attuale non esistono stime accurate del numero di coppie con problemi di infertilità in Toscana. Sono invece noti i seguenti numeri di pazienti e cicli di PMA eseguiti presso Centri autorizzati nella Regione Toscana, relativi all anno 2005: -PMA di 1 livello: 933 pazienti, cicli iniziati -PMA di 2 livello: pazienti, cicli iniziati. Tali numeri comprendono sia pazienti residenti in Regione Toscana sia pazienti provenienti da altre regioni. Non è invece noto il numero di pazienti residenti in Regione che si rivolge presso Centri extraregionali per la PMA. I numeri sopra indicati rappresentano una stima minima del numero di coppie (almeno 3.000) con problemi di infertilità, poiché non tutte le coppie procedono alla PMA. Attualmente, i test genetici vengono richiesti alla grande maggioranza delle coppie (in alcuni centri a tutte le coppie) che accedono ai suddetti Centri in previsione di PMA, indipendentemente dalla causa dell infertilità. Indicazioni all esecuzione dei test genetici per infertilità e PMA: revisione della letteratura scientifica La scelta dei test genetici deve essere basata su diversi criteri: evidenze e razionale medicoscientifico; costi; efficacia (anche in termini di prevenzione di malattie genetiche); condizione psicologica della coppia. La revisione della letteratura scientifica mostra notevole disomogeneità nelle indicazioni all esecuzione di test genetici per queste condizioni. Alcuni autori propongono di eseguire i test genetici più comunemente in uso (cariotipo, microdelezioni del cromosoma Y, analisi del gene CFTR) pressoché indistintamente a tutte le coppie con infertilità e a tutte le coppie che si sottopongono a PMA (Foresta et al. 2002). Altri sono più selettivi, e subordinano l esecuzione dei test ad un accurata valutazione clinico-anamnestica, dalla quale emerga il sospetto di una precisa anomalia genetica (Aittomäki et al. 2004). Allo stesso modo, i criteri adottati variano in diversi paesi: ad esempio nei paesi scandinavi, dove gli esami genetici e la PMA sono effettuati esclusivamente nell ambito del Servizio Sanitario Nazionale, la situazione è variegata: prima della ICSI in Norvegia l esame del cariotipo viene proposto ad entrambi i partner, in Svezia solo ai maschi con azoospermia non ostruttiva o oligospermia, e in Finlandia anche alle partner femminili di questi ultimi. Per potere valutare l appropriatezza di esami clinico-diagnostici è necessario tener conto preliminarmente dei dati di studi pubblicati nella letteratura scientifica. I dati disponibili dimostrano inequivocabilmente che le anomalie genetiche prese in esame nell introduzione sono associate a specifiche condizioni (anomalie del cariotipo nei maschi ad azoospermia/oligospermia grave-

4 moderata o a storia di aborto ripetuto; anomalie del cariotipo nelle femmine a storia di aborto ripetuto o ad amenorrea secondaria/menopausa precoce; mutazioni del gene CFTR a azoospermia ostruttiva congenita; premutazione del gene FMR1 a menopausa precoce). L eventuale ruolo che queste stesse anomalie genetiche potrebbero avere in condizioni di infertilità non associate alle suddette caratteristiche è oggetto di discussione. In linea di massima, quando sono emerse associazioni con altri stati (ad esempio, tra anomalie cromosomiche e ridotta qualità dello sperma, queste non erano state soggette ad accurata elaborazione statistica o non hanno trovato conferma con analoga metodologia in altri studi indipendenti. Un esempio in tal senso è rappresentato dallo studio di Cruger et al. (2003). Questi autori hanno studiato la frequenza di anomalie cromosomiche, microdelezioni del cromosoma Y e mutazioni del gene CFTR in una serie di 392 maschi indirizzati all ICSI. Gli autori hanno rilevato un aumento di frequenza di anomalie cromosomiche nei pazienti rispetto ad un gruppo di controllo. Le anomalie cromosomiche erano prevalentemente riscontrate nei soggetti con azoospermia o oligospermia grave, ma 3 anomalie bilanciate o a mosaico sono state osservate anche nel gruppo dei pazienti con spermiogramma normale (90 soggetti) o oligospermia di grado moderato (77 pazienti) mentre nessuna anomalia era presente in un gruppo di controllo (100 soggetti). Gli autori, pur non avendo effettuato un analisi statistica dei dati, concludevano che l esame del cariotipo è indicato per tutti i maschi appartenenti a coppie candidate all ICSI. Considerando la variabilità statistica e il fatto che anomalie cromosomiche analoghe a quelle osservate nello studio in questi gruppi sono osservate nella popolazione generale in assenza di infertilità, la conclusione non appare basata su un grado di evidenza significativo. D altro canto, un altro studio, condotto su casistica molto più ampia (Vincent et al., 2001), ha evidenziato una frequenza significativamente elevata di alterazioni cromosomiche in pazienti con azoospermia non ostruttiva (16.7%), oligozoospermia grave (9.7%) e, in minor grado (4.7%) anche in quelli con oligozoospermia moderata (5-10x10 milioni /ml); la percentuale di anomalie nei soggetti con concentrazione di spermatozoi >10x10 milioni/ml era pari a 0.5%, ovvero sovrapponibile a quella della popolazione generale. L aumentata prevalenza di mutazioni del gene CFTR in pazienti infertili senza azoospermia ostruttiva congenita riscontrata in una minoranza degli studi effettuati è spiegabile con l esistenza di errori statistici intrinseci agli studi di associazione. Infatti, la maggior parte delle raccomandazioni e linee guida suggerisce di eseguire l esame solamente su maschi con documentata azoospermia ostruttiva congenita. Alcuni autori propongono di effettuare comunque l esame a tutte le coppie candidate a PMA e a tutti i maschi infertili, anche perché questo può essere di ausilio per definire il rischio di comparsa di fibrosi cistica in eventuale prole. Tuttavia, i dati disponibili indicano che in assenza di azoospermia ostruttiva congenita e di storia familiare di fibrosi cistica e condizioni correlate la probabilità di trovare mutazioni è identica a quella della popolazione generale. Appropriatezza dei test genetici per infertilità e PMA: indirizzi operativi per la Regione Toscana In considerazione di quanto discusso sopra, viene proposta l adozione del seguente protocollo di test genetici per infertilità e PMA nella Regione Toscana: 1. Cariotipo da sangue periferico - soggetti di sesso femminile: in presenza di amenorrea primaria o secondaria o di segni di menopausa precoce - soggetti di sesso maschile: in presenza di oligozoospermia moderata-grave (<10x10 milioni spermatozoi/ml) o di azoospermia - in entrambi i sessi: in presenza di storia di aborto ripetuto o di storia familiare di anomalia cromosomica bilanciata o di quadri clinici compatibili con patologia

5 cromosomica (tali casi devono essere sottoposti alla valutazione del genetista clinico). 2. Ricerca di microdelezioni del cromosoma Y - in presenza di oligozoospermia grave (<5 mil. spermatozoi/ml) o di azoospermia. Il metodo di elezione indicato nelle linee guida dell EMQN/EAA è basato sull amplificazione di sequenze specifiche (STS) delle tre regioni AZF (Simoni et al. 2004). L esame di primo livello prevede due STS per ciascuna regione AZF e due marcatori di controllo di DNA. In caso di sospetta delezione all esame di primo livello, si procede con lo studio dell estensione della delezione con un set di marcatori aggiuntivi. L esame di secondo livello permetterà di distinguere tra delezioni complete e parziali con significato clinico ben distinto. Questa metodica è capace di individuare quasi la totalità delle delezioni clinicamente rilevanti. 3. Ricerca di mutazioni del gene CFTR - in soggetti di sesso maschile: in presenza di un quadro documentato di azoospermia ostruttiva congenita; in questi casi è necessario valutare preliminarmente mediante ecografia la presenza di anomalie renali, che orienta verso una condizione non dovuta a mutazioni CFTR, caratterizzata da diverse modalità e rischi di trasmissione ereditaria alla prole; in presenza di CBAVD è necessario eseguire nel primo livello di analisi delle mutazioni CFTR anche l analisi dei polimorfismi PoliT e PoliTG nell introne 8, successivamente seguita dall analisi di II livello con ricerca di ampi riarrangiamenti genici mediante MLPA; il III livello d analisi, con lo studio mediante sequenziamento (o DHPLC e sequenziamento) dell intero gene viene eseguito quando il I e il II livello hanno evidenziato 1 sola o nessuna mutazione CFTR - in soggetti di sesso femminile: quando il partner maschile è risultato eterozigote o eterozigote composto per una mutazione CFTR; in questo caso devono essere previsti l analisi di I, II e III livello - in entrambi i sessi l opportunità di eseguire il test va considerata di volta in volta in presenza di storia familiare di fibrosi cistica e condizioni correlate. In relazione a problematiche di infertilità i suddetti test genetici possono essere eseguiti nell ambito del Servizio Sanitario Regionale esclusivamente in presenza delle condizioni sopra elencate. Non devono altresì essere eseguiti altri test genetici di significato non ancora accertato. Le suddette indicazioni andranno rivalutate su base annuale, alla luce di nuove acquisizioni scientifiche. Si dovrà quindi seguire un iter diagnostico strutturato per assicurare un corretto utilizzo dei test genetici e una razionalizzazione dei costi. Il punto di partenza di questo iter è una consulenza genetica finalizzata a: - stabilire l appropriato approccio percorso diagnostico relativo agli esami trattai in questo documento (cariotipo; ricerca di microdelezioni del cromosoma Y; analisi del gene CFTR) - chiarire il significato, i limiti, l attendibilità, la specificità e l opportunità del test - informare sulla storia naturale delle patologie associate ai difetti genetici, con particolare riguardo alla variabilità fenotipica di alcune di queste - acquisire o integrare in dettaglio i dati sulla storia familiare, quando questi non siano già forniti - ottenere il consenso all esecuzione del test. Il risultato del test, sia esso normale o patologico, deve essere sempre accompagnato da una relazione scritta che ne illustri il significato, con particolare riguardo ai limiti degli esami.

6 Bibliografia - -Aittomäki et al Safety issues in assisted reproductive technology. Hum Reprod 3: Cruger DG et al Genetic analysis of males from intracytopasmic sperm injection couples. Clin Genet. 64: Dequeker et al Recommendations for quality improvement in genetic testing for cystic fibrosis. European Concerted Action on Cystic Fibrosis. Eur. J. Hum. Genet. 8:S2- S24 - -Foresta et al Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. Eur. J. Hum. Genet. 10: Krausz C, Degl Innocenti S Y chromosome and male infertility: update, Front - Biosci. 11: Simoni et al EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y- chormosomal microdeletions. Int. J. Androl. 27: Soini et al The interface between assiste reproductive technologies and genetics: technical, social, ethical and legal issues. Eur. J. Hum. Genet. 14: Vincent M-C et al Cytogenetic investigations of infertile men with low sperm counts : a 25-year experience. J. Androl. 23:18-22.