ANALISI DELLE ACQUE AD USO UMANO: RICERCA DI LEGIONELLA

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1 Numero 18 novembre 2010 ANALISI DELLE ACQUE AD USO UMANO: RICERCA DI LEGIONELLA Legionella spp, batterio responsabile di una forma acuta di polmonite, deve il suo nome all epidemia che nel 1976 colpì un gruppo di veterani dell American Legion a Filadelfia. Microrganismo ubiquitario, è principalmente associato alla presenza di acqua: è stato isolato in ambienti idrici naturali (laghi e corsi d acqua, sorgenti termali, falde idriche ed ambienti umidi in generale) ed artificiali (impianti idrici, fontane, piscine, vasche idromassaggio, impianti di condizionamento). L infezione si trasmette attraverso l inalazione degli aerosol contenenti il batterio. Legionella pneumophila, ed in particolare il serogruppo 1, è responsabile della maggioranza dei casi. Le condizioni che ne favoriscono lo sviluppo sono: - temperatura compresa tra 25 e 45 C - situazioni di ristagno dell acqua - presenza di biofilm - presenza di elementi in tracce (ferro in particolare). Va comunque tenuto presente che Legionella sopravvive anche in condizioni ambientali sfavorevoli, sotto forma di parassita di protozoi ciliati ed amebe. Dal punto di vista microbiologico, Legionella viene definita come un microrganismo Gramnegativo, in grado di crescere in non meno di 2 giorni su terreno tamponato contenente estratto di lievito, carbone, L-cisteina e ferro, formando colonie spesso bianche, viola-blu o verdastre. La crescita in genere non si osserva in assenza di L-cisteina. Le colonie assumono un aspetto caratteristico a vetro smerigliato se osservate con stereomicroscopio a bassa intensità. Alcune colonie sviluppano fluorescenza se sottoposte a luce UV. Queste caratteristiche vengono tenute in considerazione per la ricerca e l identificazione di Legionella nei campioni analizzati. La Normativa di Riferimento originaria per la ricerca di Legionella nelle acque ad uso umano con la tecnica della membrana filtrante è la ISO 11731: 1998, attualmente in revisione. Nel 2004 è stata inoltre introdotta la ISO :2004, valida soltanto per acque con una bassa contaminazione batterica. In questo numero affronteremo separatamente le procedure previste dalle due normative di riferimento, dando infine spunti pratici in riferimento ai materiali da utilizzare. Pagina 1 di 7

2 PROCEDURA DI ANALISI SECONDO ISO La procedura che vedremo di seguito può essere applicata a tutti i tipi di campioni ambientali di acque, incluse acque potabili, industriali e naturali, ed alle matrici associate (sedimenti, depositi e fanghi). RACCOLTA, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI L acqua da analizzare (in genere in volume pari a 1 litro) va campionata in bottiglie sterili, nella quali va aggiunto, in caso di acque clorate, potassio o sodio tiosolfato. E buona norma analizzare l acqua raccolta immediatamente, preferibilmente il giorno stesso del campionamento; questo è tanto più importante per quei campioni contenenti cloro o altri disinfettanti. Considerando che spesso il luogo di campionamento è distante dal luogo in cui viene effettuata l analisi, il trasporto deve essere fatto in modo da minimizzare i tempi (non più di due giorni), ad una temperatura compresa tra i 6 e i 18 C, al riparo dalla luce e dal calore. Una volta arrivato in laboratorio, il campione va analizzato entro 2 giorni dalla sua raccolta, possibilmente non oltre i 5 giorni, mai oltre i 14 giorni, conservandolo a 6±2 C. La temperatura di conservazione del campione appare particolarmente critica in quanto incide sulla conta vitale del microrganismo, che può aderire alle pareti del contenitore o modificare le sue caratteristiche di crescita. In campioni conservati tra 0 e 6 C si evidenzia una diminuzione del numero di microrganismi vitali, mentre la crescita viene stimolata a temperature superiori ai 20 C. Perciò, per minimizzare queste modifiche, la temperatura di conservazione pari a 6±2 C appare quella preferibile. PROCEDURA DI ANALISI Il campione viene inizialmente concentrato, sottoponendolo a filtrazione su membrana o a centrifugazione. Quindi, viene suddiviso in tre aliquote: due vengono sottoposte ad un trattamento di decontaminazione (con acido o con calore), per abbattere l eventuale flora interferente; una verrà invece utilizzata tal quale. Successivamente, i campioni vengono trasferiti su piastra con agar selettivo per Legionella ed incubati. Dopo l incubazione, vengono valutate le caratteristiche morfologiche delle colonie formatesi. Le colonie sospette vengono quindi sottoposte alle prove di conferma. Possiamo schematizzare, suddividendo la procedura in cinque fasi principali: 1. Concentrazione del campione 2. Decontaminazione 3. Crescita su terreno selettivo 4. Esame delle piastre dopo incubazione 5. Test di conferma Concentrazione del campione Questa rappresenta la fase più delicata della procedura, in quanto va ad influenzare in modo significativo il recovery finale del microrganismo. Può essere utilizzata la tecnica di filtrazione su membrana o la centrifugazione Pagina 2 di 7

3 -Filtrazione su membrana Il campione di acqua viene filtrato sterilmente attraverso una membrana di nylon o policarbonato, con diametro da 47 mm a 142 mm e pori di 0.22 o 0.45 µm. Si utilizza a questo scopo un sistema filtrante collegato ad una pompa a vuoto, avendo cura di sterilizzare in autoclave la membrana, se non sterile, posizionata nel blocco filtrante. Se il concentrato ottenuto dopo filtrazione risulta comunque torbido o colorato, è preferibile utilizzare la tecnica di centrifugazione. Dopo filtrazione, la membrana viene posta in un contenitore sterile con tappo a vite. Per garantire il recupero di tutti i microrganismi, si aggiungono 5-25 ml di diluente sterile (soluzione salina di Page o Ringer) o di acqua campione, quindi si agita vigorosamente per almeno 2 minuti, eventualmente dopo aver anche sminuzzato la membrana con forbici sterili. In alternativa, il contenitore può essere sottoposto a trattamento con ultrasuoni da 2 a 10 min, assicurandosi che il livello del diluente sia al di sotto del livello dell acqua presente nel bagnetto a ultrasuoni. Si può anche utilizzare un terzo metodo, che prevede il raschiamento della membrana: in questo caso, la membrana può essere posta in capsula petri (da 60 mm se la membrana ha diametro 47 mm) con 5-10 ml di diluente sterile o di acqua campione; quindi, con l aiuto di bacchette sterili a punta arrotondata, si procede per almeno due volte al raschiamento dell intera superficie, per garantire il recupero di tutti i microrganismi dalla membrana. -Centrifugazione Questa tecnica è utilizzabile per piccole quantità di campione (circa 200 ml) o quando il concentrato ottenuto dopo filtrazione risulta comunque torbido. Il campione viene posto in un contenitore sterile con tappo a vite e centrifugato a 6000 g per 10 min o a 3000 g per 30 min, mantenendo la temperatura tra 15 e 25 C. Il supernatante viene rimosso, mentre il sedimento viene risospeso in 2-20 ml di diluente e rappresenta il campione concentrato da analizzare di seguito. Decontaminazione Questa procedura è necessaria per eliminare la flora interferente e va condotta suddividendo il campione concentrato precedentemente in tre aliquote: una da utilizzare tal quale, una da sottoporre a trattamento termico, una da sottoporre a trattamento con acido. Per il trattamento termico, è sufficiente porre una piccola porzione (1 ± 0.5 ml) di campione concentrato in un contenitore sterile e sottoporlo a riscaldamento (50±1 C) in bagnetto per 30 min. Per il trattamento con acido, si possono utilizzare due metodiche: -centrifugare il campione (1-10 ml) come visto sopra, quindi eliminare la metà del surnatante e risospendere il sedimento sottoponendolo a vigorosa agitazione. Rimpiazzare poi con un apposito tampone acido il volume eliminato ed lasciare fermo il tutto per 5 min dopo leggero mescolamento -più semplicemente, utilizzare un apposito tampone acido 10x e diluirlo direttamente 1:10 con il campione, ottenendo così una soluzione a ph 2.2; quindi lasciare fermo per 5 min. Crescita su terreno selettivo Aliquote di ml di ciascuno dei tre campioni vanno inoculate su piastre con terreno selettivo GVPC agar, distribuendole uniformemente con una spatola sterile. I campioni trattati vanno inoculati immediatamente dopo la fine del trattamento acido o termico. Le piastre vanno poi incubate a 36+/-1 C per 10 giorni. Per evitare la disidratazione delle piastre durante questo periodo è bene porre sul fondo dell incubatore un vassoio con acqua. La presenza Pagina 3 di 7

4 di CO 2 (2.5%) durante l incubazione può migliorare la crescita di alcuni ceppi di Legionella ma non è essenziale. Esame delle piastre dopo incubazione E bene esaminare le piastre con microscopio bioculare in almeno tre occasioni durante il periodo di incubazione, a intervalli di 2-4 giorni. Legionella cresce infatti lentamente è può essere mascherata dalla crescita di altri microrganismi. Le colorazioni assunte dalle colonie delle varie specie possono essere molto diverse: generalmente bianche o grigie, ma anche blu, porpora, marroni, rosa, verdognole o rosso scuro. Osservate allo stereomicroscopio con luce incidente a bassa intensità, tutte però mostrano il caratteristico aspetto a vetro smerigliato. Molte specie, osservate con microscopio a UV (ad una lunghezza d onda di /-nm), emettono fluorescenza con colori caratteristici per ogni specie. Per evitare l uccisione delle colonie è bene però sottoporre le piastre alle radiazioni UV per il minimo tempo necessario. Test di conferma Per confermare le colonie sospette si sfrutta la capacità di Legionella di crescere solo in terreno con cisteina. A questo scopo, si selezionano casualmente per ogni campione almeno 3 colonie sospette, per effettuare una subcoltura di ognuna in BCYE agar e in BCYE-Cys agar (stesso terreno ma privo di cisteina). In alternativa al BCYE-Cys agar, può essere utilizzato Nutrient Agar o Blood Agar. L incubazione va poi effettuata a 36+/-2 C per almeno 2 giorni, confermando infine come Legionella le colonie che crescono solo in BCYE agar. Fanno eccezione Legionella oakridgensis e Legionella spiritensis, che richiedono L-cisteina e ferro per l isolamento primario ma possono crescere debolmente anche in assenza di cisteina. Possono essere poi utilizzati vari metodi di conferma addizionali per l identificazione delle specie di Legionella presenti: cromatografia gas-liquido, immunofluorescenza, agglutinazione al lattice tra questi. PROCEDURA DI ANALISI SECONDO ISO :2004 La procedura che vedremo di seguito è valida soltanto per acque con una bassa contaminazione batterica, in quanto la sovrapposizione di altri microrganismi sulle membrane filtranti renderebbe difficoltosa la ricerca di Legionella, inibendone la crescita. Il campione viene sottoposto innanzitutto a filtrazione su membrana per essere concentrato. La procedura di filtrazione prevede anche una fase di lavaggio del filtro con un apposito tampone acido, per minimizzare la crescita di flora interferente. Quindi, il trasferimento su piastra con agar selettivo per legionella e l incubazione. Dopo l incubazione, vengono valutate le caratteristiche morfologiche delle colonie formatesi. Le colonie sospette vengono quindi sottoposte alle prove di conferma Possiamo schematizzare suddividendo la procedura in quattro fasi principali: 1. Filtrazione del campione con decontaminazione 2. Crescita su terreno selettivo 3. Esame delle piastre dopo incubazione 4. Subcultura per conferma delle colonie Pagina 4 di 7

5 Filtrazione del Campione con decontaminazione Il campione viene sottoposto a filtrazione utilizzando preferibilmente membrane nere in esteri di cellulosa, con diametro 47 mm e pori 0.45 µm, con griglia. Visto che la crescita di Legionella sarebbe inibita dalla presenza di altri microrganismi sulla membrana, la filtrazione prevede anche un lavaggio della membrana filtrante con tampone acido per abbattere la flora batterica presente. Si procede come segue: -sottoporre il campione a filtrazione utilizzando un sistema filtrante collegato ad una pompa a vuoto, ponendo il lato quadrettato della membrana verso l alto - dopo la filtrazione del campione, bloccare il flusso e aggiungere direttamente nel bicchiere di filtrazione 30± 5 ml di tampone acido, lasciando agire a contatto con la membrana per 5 minuti E fondamentale che tutta l area interessata venga ben lavata con il tampone per evitare che si mantengano aree potenzialmente contaminate -riaprire il flusso e consentire la filtrazione del tampone -lavare la membrana con 20+/- 5 ml di soluzione salina di Page Crescita su terreno selettivo La membrana va rimossa dall apparato di filtrazione con pinzette sterili e posta direttamente su piastre con BCYE agar o GVPC agar, facendola ben aderire al terreno in modo da evitare la formazione di bolle d aria. Le piastre vanno poi incubate a 36+/-2 C per 10 giorni. Per evitare la disidratazione delle piastre durante questo periodo è bene porre sul fondo dell incubatore un vassoio con acqua o, in alternativa, incubare le piastre in buste di plastica o contenitori chiusi. La presenza di CO 2 (2.5%) durante l incubazione può migliorare la crescita di alcuni ceppi di Legionella ma non è essenziale. Esame delle piastre dopo incubazione E bene esaminare le piastre con microscopio bioculare almeno due volte, cominciando dal giorno 3 o 4 di incubazione, registrando le colonie sospette Rispetto alla crescita diretta su agar, la crescita su membrana ha alcune caratteristiche peculiari: -Legionella cresce più lentamente; -le colonie che si formano sono più piccole; -alcune specie possono non crescere affatto Come visto precedentemente, le colorazioni assunte dalle colonie delle varie specie possono essere molto diverse: generalmente bianche o grigie, ma anche blu, porpora, marroni, rosa, verdognole o rosso scuro. Osservate allo stereomicroscopio con luce incidente a bassa intensità, tutte però mostrano il caratteristico aspetto a vetro smerigliato. Molte specie, osservate con microscopio a UV (ad una lunghezza d onda di /-nm), emettono fluorescenza con colori caratteristici per ogni specie. Per evitare l uccisione delle colonie è bene però sottoporre le piastre alle radiazioni UV per il minimo tempo necessario. Conferma delle colonie sospette Anche in questo caso, per confermare le colonie sospette si sfrutta la capacità di Legionella di crescere solo in terreno con cisteina. A questo scopo, si selezionano casualmente per ogni campione almeno 5 colonie sospette, per effettuare una subcoltura di ognuna in BCYE agar e in BCYE-Cys agar (stesso terreno ma privo di cisteina). In alternativa al BCYE-Cys agar, può essere Pagina 5 di 7

6 utilizzato Nutrient Agar o Blood Agar. Se sono presenti diversi tipi di Legionella, vanno selezionate almeno due colonie per tipo. L incubazione va poi effettuata a 36+/-2 C per almeno 2 giorni, confermando infine come Legionella le colonie che crescono solo in BCYE agar. Fanno eccezione Legionella oakridgensis e Legionella spiritensis, che richiedono L-cisteina e ferro per l isolamento primario ma possono crescere debolmente anche in assenza di cisteina. Come test addizionale di conferma, può essere utilizzato il test di agglutinazione al lattice, in grado di rilevare specificamente Legionella pneumophila (serogruppo 1 e serogruppi 2-16) e le altre specie di Legionella più comuni. CONTROLLO QUALITA DEI TERRENI Entrambe le normative rivolgono una particolare attenzione alla qualità dei terreni selettivi utilizzati, con particolare riguardo ai loro ingredienti (l alfa-chetoglutarato nel BCYE, ad esempio). Anche piccole variazioni da lotto a lotto possono infatti influenzare la performance del terreno. Perciò è importante che su ogni lotto nuovo di terreno venga effettuato il test di fertilità seguendo la crescita di Legionella pneumophila ser. 1 a 36+/-2 C per 3 giorni. Si utilizzano a questo scopo in parallelo piastre di GVPC agar per le quali sia già stata verificata la fertilità con il ceppo di Legionella indicato e piastre di GVPC agar appartenenti al nuovo lotto. Si può procedere in due modi: - inoculare su entrambe un campione di acqua contaminato con Legionella - utilizzare un ceppo liofilizzato standard di Legionella pneumophila ser. 1 e coltivarlo su BCYE agar per ottenere un ceppoteca da utilizzare poi per i test di fertilità. Sospendere in glycerol broth una quantità di colonie tale da ottenere una torbidità visibile ad occhio nudo ed aliquotare la sospensione in volumi da 1 ml per conservarla a -20+/-5 C; piastrare un aliquota della sospensione su BCYE agar per effettuare i test di identificazione delle specie di Legionella presenti. Possono essere utilizzate subcolture con un massimo di 10 passaggi dalla coltura stock. Per l utilizzo, riportare una o più aliquote a temperatura ambiente, agitarle dolcemente, lasciarle ferme 5-10 minuti e inoculare il volume necessario (ad esempio 0.1 ml) sulle piastre di GVPC da verificare. Dopo l incubazione delle due piastre di GVPC agar, comparare i risultati verificando il numero di colonie e la loro morfologia. MATERIALI Il catalogo KAIROSafe include la gamma completa di articoli necessari per la ricerca di Legionella Terreni e soluzioni per Legionella: BCYE, BCYE-Cys e GVPC agar in formato pronto all uso o disidratato con supplementi; tampone acido e soluzione di Page. Membrane Filtranti in Esteri Misti di Cellulosa Nere, sterili, conf. singola in peelpouch, diametro di 47 mm e pori di 0,45 µm, con griglia; membrane filtranti in nylon bianche, non sterili, diametro da 47 mm a 142 mm e pori 0.22 o 0.45 µm. Pagina 6 di 7

7 Ceppi microbici liofilizzati: Legionella pneumophila ATCC Licensed Derivative per i test di fertilità dei terreni Sistemi per filtrazione: : rampe singole e multiple, imbuti di vetro e acciaio, pompe a vuoto Pinzette in acciaio specifiche per membrane filtranti. Le punte piatte permettono di afferrare l'estremo bordo della membrana evitando il danneggiamento dell'area di campionamento. Test di agglutinazione al lattice, per la conferma di Legionella pneumophila ser. 1 o ser. 2 e di Legionella spp. Flaconi in plastica per campionamento acque, con e senza sodio tiosolfato, sterili irraggiati * The ATCC Licensed Derivative emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark and the ATCC catalog marks are trademarks of ATCC used under license. Kairosafe is licensed to use these trademarks and to sell licensed products manufactured for Mecconti using ATCC materials derived from ATCC cultures. Look for the ATCC Licensed Derivative emblem for products derived from ATCC cultures. Il sito è stato completamente rinnovato. Con una semplice registrazione potrete visionare i nostri LISTINI PREZZO sempre aggiornati. I clienti registrati avranno anche la possibilità di godere di speciali offerte promozionali. Siamo sempre a disposizione per offerte personalizzate. Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Telefono Tel/fax: web: Pagina 7 di 7

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