DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE / BECKER (DMD / BMD)

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1 DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE / BECKER (DMD / BMD)

2 DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE/BECKER (DMD/BMD) Miopatia ereditaria degenerativa Trasmissione X-linked recessiva Incidenza DMD: 1/3500 nati maschi Incidenza BMD: 1/30000 per la forma Becker I maschi con mutazioni nel gene DMD sono affetti Le femmine portatrici sono sane, tranne che in rarissimi casi di inattivazione sfavorevole del cromosoma X Alto tasso di mutazione de novo - circa 1/3 dei casi sono sporadici

3 DMD Forma più grave DUCHENNE / BECKER Assenza totale o forte riduzione della sintesi di distrofina Fitness riproduttiva: 0% BMD Fenotipo più lieve Distrofina ridotta o strutturalmente alterata Fitness riproduttiva: 70%

4 DMD Caratteristiche cliniche Miopatia degenerativa progressiva Insorgenza nella forma grave tra i 2 e 5 anni Infiltrazione di tessuto connettivo e adiposo Pseudoipertrofia muscolare Lordosi caratteristica spesso accompagnata da scoliosi grave Manovra di Gowers positiva Complicanze polmonari e/o cardiache portano al decesso Riduzione o assenza della distrofina dopo immunoistochimica Circa il 30% dei casi ha QI<75

5 DMD Prognosi Esordio (3-5 anni) Fase di transizione (6-12 anni) Cadute frequenti, debolezza muscolare e perdita fiunzionale, ipertrofia muscolare Perdita della deambulazione (8-14 anni) Fase finale (15+ anni) Problemi respiratori, a volte cardiaci, morte anni

6 BMD CARATTERISTICHE CLINICHE Forma allelica della DMD Meno grave Insorgenza tra 12 e 80 anni Età media alla perdita di deambulazione: 27 anni Età media exitus: 42 anni Il cuore è meno frequentemente compromesso QI nella norma Mutazioni del gene della distrofina che conservano parzialmente la funzionalità della proteina

7 DISTROFINA - Il gene Localizzato sul braccio corto del cromosoma X (banda Xp21) Lungo più di 3000 kb, pari a circa 1,5 % dell intero cromosoma X 79 esoni che costituiscono il 0.6% dell intero gene Contiene 8 promotori Gli introni costituiscono il 99.4% dell intero gene Alta frequenza di ricombinazione intragenica (10-12 %) L mrna full length è di circa 14 kb

8 DISTROFINA Il messaggero L mrna full length è di circa 14 kb gli mrna a piena lunghezza sono controllati da 3 siti diversi nello stesso promotore e sono regolati in modo indipendente DpB: cervello neuroni corticali e ippocampo DpM: muscolo e cardiomiociti DpP: cellule di Purkinje e cervelletto lungo il gene ci sono altri 5 siti-promotore

9 ISOFORME DELLA DISTROFINA NH2 Cys COOH Dp427 NH2 Cys COOH L-Dys N Cys COOH Dp260 Cys COOH Dp140 N Cys COOH Dp116 N Cys COOH Dp71 Esoni: 1L 1B 1M 1P 2 30 Cell. di Purkinje muscolo Corteccia cerebrale retina Tessuti non muscolari Nervi periferici Sistema nervoso centrale (SNC) linfoblasti

10 Isoforme della distrofina originate per splicing alternativi mrna R24 H4 CYS C-TERMINALE proteina

11 DISTROFINA - La proteina Proteina citoscheletrica appartenente alla famiglia delle spectrine Consta di 3685 aa, con PM di 427 kda E espressa soprattutto nel muscolo scheletrico e in piccole quantità nel cervello Dominio NH2: ha tre siti di legame all actina e presenta omologia di sequenza con il dominio legante l actina dell -actinina Dominio Rod: 24 unità ripetute, ognuna di 109 aa e struttura secondaria ad -elica responsabili dell aspetto a bastoncello, con 4 regioni cerniera, che conferiscono flessibilità Dominio Cys: presenta omologia di sequenza con l -actinina e partecipa alla regolazione del legame con alcune proteine legate alla membrana Dominio COOH: specifico della distrofina, ma altamente conservato tra le specie contiene il sito di legame per la sintrofina importante per legare alcuni componenti cellulari interni

12 Complesso delle glicoproteine associate alla distrofina (DAG) Costituito da sarcoglicani, distroglicani e sintrofine Sarcoglicano: 5 proteine ( o adalina,,, ed ), coinvolte nella patogenesi delle varie forme di distrofia dei cingoli Distroglicano distroglicano: localizzazione extracellulare, lega la merosina a livello della lamina basale. Funge anche da recettore per l agrina, quindi è coinvolta nell aggregazione dei recettori dell acetil-colina a livello della regione sinaptica; distroglicano: pr. transmembrana, lega la distrofina a livello delle regioni Cys e COOH

13 Complesso delle glicoproteine associate alla distrofina (DAG) I-band

14 Ruolo della distrofina IPOTESI STRUTTURALE La distrofina funge da ponte tra l apparato contrattile intracellulare e la matrice extra-cellulare, soprattutto a livello delle regioni miotendinee, sottoposte a forte stress meccanico durante la contrazione muscolare. In assenza di distrofina, anche tutte le proteine del DAG diminuiscono; pertanto la mancanza di distrofina produce un difetto al supporto strutturale della membrana, rendendola più suscettibile a rotture durante l attività contrattile. MODELLO DELL AGGREGAZIONE DEI CANALI La distrofina organizza il citoscheletro, che a sua volta è responsabile dell aggregazione dei canali ionici e dei recettori per i neurotrasmettitori

15 DMD Mutation Types % ~ 65% ~ 5-10% ~ 25-30% Deletion Duplication Point

16 Deletions in DMD Gene BMD DMD 5' ' Exons

17 Mutazioni del gene della distrofina Circa il 65% delle mutazioni DMD e BMD sono grosse delezioni del gene che portano alla totale assenza o a ridottissime quantità di distrofina e sono localizzate preferenzialmente in due zone del gene: la deletion rich region prossimale (esoni 1-20) e la deletion rich region distale (esoni 45-53); le mutazioni out of frame sono responsabili più frequentemente del fenotipo Duchenne le mutazioni in frame sono responsabili più frequentemente del fenotipo Becker

18 Diagnosi di BMD/ DMD 1. Biochimica Dosaggio ematico di CPK, LDH, AST, Aldolasi 2. Istopatologica biopsia muscolare indica fibrosi endomisiale, degenerazione e rigenerazione di cellule muscolari, assenza di colorazione per la distrofina 3. Analisi del DNA screening di delezioni comuni o mutazioni note in famiglia

19 Immunoistochimica per la distrofina su biopsia muscolare Muscolo normale Muscolo DMD Muscolo BMD

20 BMD BMD normal DMD DMD Western blot per distrofina da biopsia muscolare di pazienti con BMD o DMD

21 Analisi del DNA 24 esoni del gene DMD amplificati con 4 multiplex-pcr Esone Prodotto di Esone Prodotto di amplificazione amplificazione Multiplex-PCR A Multiplex PCR-C Multiplex PCR-B Multiplex PCR-D PM

22 Multiplex-A Multiplex-B SM Multiplex-C SM Multiplex-D SM

23 (-45, 48) (-48, 51) (-44) Multiplex-PCR per diagnosi di malattia Maschi affetti

24 Reazione di PCR Si raggiunge un plateau concentrazione limitante e inattivazione della polimerasi inefficace anneling dei primers consumo e competizione dei reagenti auto-annealing del prodotto La quantità di prodotto finale non è proporzionale alla quantità di campione iniziale

25 Reazione di PCR La quantità di prodotto finale è proporzionale alla quantità di campione iniziale

26 DMD Deletion Carrier Analysis

27 Q-PCR 24 esoni del gene DMD amplificati con 4 multiplex-pcr Esone Amplicone Esone Amplicone Multiplex-PCR A NED Multiplex PCR-C NED VIC NED VIC NED VIC VIC VIC VIC VIC NED NED FAM 10PK 301 VIC 10PK 301 NED Multiplex PCR-B VIC Multiplex PCR-D NED PM VIC VIC NED FAM NED 5 93 FAM NED 10PK 301 PET NED 10PK 301 FAM

28 FAM EX46 Ex2 Ex5 10PK VIC EX42 Ex53 Ex44 10PK Ex12 Ex8 Ex17 Ex19 Ex1 Ex6 EX50 NED EX52 EX47 EX4 EX13 EX41 10PK EX43 EX51 EX3 EX49 EX48 EX45 PET PK10

29 Dosaggio genico mediante PCR semiquantitativa Gene di rif. Es N Gene DMD Es 45 gene rif. EsN DMD Es45 Es N Es 45 Donna normale Altezza picco Es45 DMD / Altezza picco EsN gene rif. = 1 Gene di rif. Es N Gene DMD Es 45 gene rif. EsN DMD Es45 Es N Es 45 Donna portatrice Altezza picco Es45 DMD / Altezza picco EsN gene rif. = 1/2

30 Calcolo dell indice diagnostico (DI) R X = Altezza picco esone DMD nel paziente Altezza picco esone 10PK nel paziente R C = Altezza picco esone DMD nel controllo Altezza picco esone 10PK nel controllo Indice Diagnostico (DI) = R x /R c normale DI = 1 ( ) normale DI = 0.5 ( ) delezione DI = 0.5 ( ) delezione DI = 0 (assenza esone) duplicazione DI = 1.5 ( ) duplicazione DI = 1 ( )

31 Mean ± 3SD Double dose D I Indeterminate Mean ± 3SD Single dose 0.4 Double dose Single dose Unknown

32 DMD Deletion/Duplication Analysis 79 exons exon 2, 16, 34, 42, 53, 64, 78 DMD A DMD F exon 5, 15, 25, 32, 43, 52, 63, 73 7, 14, 23, 38, 46, 54, 62 DMD B DMD G BP, 6, 17, 26, 33, 45, 55, 65, 75 3, 13, 22, 37, 47, 58, 67, 74 DMD C DMD H 10, 18, 27, 35, 44, 56, 66, 76 DMD D DMD I 1, 11, 21, 30, 40, 50, 60, 71 9, 19, 28, 36, 48, 57, 68, 77 DMD E DMD J 4, 12, 24, 31, 41, 51, 61, 72 8, 20, 29, 39, 49, 59, 69, 79

33 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

34 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) DMD Deletion/Duplication Analysis 79 exons

35 DMD Deletion/Duplication Analysis 79 exons

36 DNA analysis DMD / BMD large genetic rearrangements (deletions / duplications) MLPA - deletion / duplication screening oscreening males and females for deletions / duplications in all 79-exons of the DMD gene in one analysis MAPH (Multiplex Amplifiable Probe Hybridization) - deletion / duplication screening oscreening males and females for deletions / duplications in all 79-exons of the DMD gene in one analysis Multiplex PCR (detection of deletions only) Quantitative multiplex PCR - deletion / duplication screening Southern blotting Fluorescent in situ Hybridisation (FISH) point mutation detection Sequencing DGGE SSCP DHPLC haplotyping Markers in and around the dystrophin gene (RFLP and VNTR/CA-repeat) Frequent intragenic variants (SNP)

37 Indagine indiretta mediante analisi di linkage Utilizza marcatori polimorfici intra- ed extra-genici L associazione di 2 o più marcatori sullo stesso cromosoma costituisce un aplotipo Gli aplotipi vengono utilizzati per seguire nell ambito di una famiglia il cromosoma che porta la mutazione, quando questa non è nota

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39 Analysis of exon products on a capillary sequencer Legend: Example of the results obtained on a capillary sequencer (ABI 3700). Lane B is a control female. Lane D is a male deleted for exons 49 and 51, which can be easily seen by the complete absence of the peaks. Lane A: female deleted for exons 49 and 51. As can be seen by comparison with lane B (control female), the relevant peaks are about half the height, reflecting a decrease in copy number from 2 to 1. Lane C shows a female duplicated for the exons 49 and 51. As can be seen by comparison with lane B (control female), the relevant peaks have increased in height about 50%, reflecting an increase in copy number from 2 to 3

40 MAPH Analysis of exon products on a microarray Legend: Example of the results obtained on a micro-array. PCR-fragments containing DMD exons are spotted in triplicate on each array (top left exons 1-24, top right exons 25-48, bottom left exons 49-72, bottom right exons 73-79). Top: signal obtained with control DNA (Cy-5 labeled). Bottom: signal obtained with DNA from DMD-patient (Cy-3 labeled), deleted for exons The arrays shows that exons 3-20 for the patient DNA do not give a signal, so are deleted.