I cianobatteri potenzialmente tossici: implicazioni sanitarie e gestione del rischio Roma 15 Novembre 2007

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1 I cianobatteri potenzialmente tossici: implicazioni sanitarie e gestione del rischio Roma 15 Novembre 2007 Identificazione e quantificazione delle cianotossine Metodi chimici Simona Scardala Dipartimento Ambiente e Connessa prevenzione primaria Reparto qualità degli ambienti acquatici e delle acque di balneazione

2 Considerazioni generali La determinazione precisa ed accurata di un analita non è solo il risultato di una corretta analisi strumentale, ma è il risultato di tutto un corretto processo analitico 7% 6% 6% 4% Trattamento del campione 30% Operatore Colonne Calibrazione Strumenti 8% Cromatografia 9% 11% 19% Sorgenti di errori Integrazione Introduzione del campione

3 Tempi di lavoro CAMPIONAMENTO ANALISI 6% 6% PREPARAZIONE DEL CAMPIONE GESTIONE DEI DATI 61% 27%

4 Estrazione con solvente Purificazione (SPE) extracellulare Purificazione concentrazione (SPE) Filtrazione su GF/C Centrifugazione Intracellulare Lisi cellulare Estrazione con solvente ANALISI

5 Si prelevano due aliquote di H 2 O TOTALE Lisi cellulare EXTRACELLULARE Filtrazione su GF/C Centrifugazione Filtrazione su GF/C Centrifugazione Purificazione concentrazione (SPE) Purificazione concentrazione (SPE) ANALISI

6 Principali classi di tossine prodotte dai cianobatteri Neurotossine Epatotossine PSP Anatossina-a(s) Anatossine Cilindrospermopsina Nodularine Microcistine Alcaloidi Peptidi ciclici

7 PSP R4 R1 H 2 N O N N R2 H N composti N-solfocarbamilici R4=CONHSO 3 Tossina R1 R2 R3 GTX-5 H H H GTX-6 OH H H C-1 H H OSO 3 - C-2 H OSO 3 - H C-3 OH H OSO 3 - N H OH OH R3 NH 2 Alcaloidi neurotossici Esistono tre classi principali di PSP carbammati R4: CONH 2 Tossina R1 R2 R3 STX H H H neostx OH H H GTX-1 OH H OSO 3 - GTX-2 H H OSO 3 - GTX-3 H OSO 3 - H GTX-4 OH OSO 3 - H decarbamilici R4: H Tossina R1 R2 R3 dcstx H H H dcneostx OH H H dcgtx1 OH H OSO 3 - dcgtx2 H H OSO 3 - dcgtx3 H OSO 3 - H

8 Conservazione del campione In acque dolci queste tossine persistono fino a 90 giorni e non sembrano essere degradate da batteri, tuttavia a T ambiente si può verificare la conversione di tossine C in dcgtx Operazioni di congelamento - scongelamento ed in particolar modo lo stoccaggio di campioni nel surgelatore prima di congelare e scongelare per favorire la lisi cellulare stimola l epimerizzazione (C-2 C-3; GTX-3 GTX-1) Tossine Tossicità relative C C C GTX GTX GTX GTX STX 1 dcgtx dcgtx

9 Estrazione HCl acq (metodo standard AOAC, approvato dal regolamento CE 1664/2006 ) 0.2M CH 3 COOH omogeneizzando C1 GTX C2 GTX CH 3 COOH M HCl M ATTENZIONE ALLA SCELTA DELL ACIDO HCl 1.0 M

10 Concentrazione e Purificazione Elevata idrofilia delle saxitossine Agente di coppia ionica Campione con PSP FASE INVERSA SOLVENTI ORGANICI CARBOGRAPH Eluizione: soluz. acquosa di MeOH soluz. acquosa di CH 3 COOH

11 Tecniche analitiche I metodi più comuni per la quantificazione della saxitossina sono basati su metodi HPLC con derivatizzazione pre-colonna o ossidazione post-colonna e rilevazione fluorimetrica. Significative differenze tra le saxitossine ottenute per estrazione da specie e ceppi diversi di cianobatteri Commercialmente non sono disponibili tutti gli standard necessari per l identificazione o la quantificazione Utilizzando l LC-MS possono essere identificate le singole neurotossine A volte però data la loro idrofilia è necessario aggiungere agenti di coppia ionica per migliorare i tempi di ritenzione. Tali composti però aumentano il rumore di fondo e sopprimono il segnale

12 Anatossina-a(S) Peso molecolare 252 u.m.a. Estere fosforico della N-idrossi guanidina Unica tossina appartenente agli organofosfati prodotta dai cianobatteri Non sono state identificate varianti strutturali

13 Conservazione del campione Durante lo stoccaggio (a 3 o C o anche a -20 o C) e principalmente in ambiente alcalino l anatossina-a(s) perde facilmente il gruppo monometil-fosfato che viene sostituito da un ossidrile. L evaporazione del MeOH durante la fase di purificazione causa una significativa idrolisi dell anatossina-a(s)

14 Estrazione/purificazione Estratto con CH 3 COOH 0.05N: etanolo Surnatante evaporato ridisciolto in H 2 O distillata fino a saggio AChE negativo L estratto acquoso viene applicato ad una C18 per eliminare i pigmenti trattenuti dalla cartuccia L acqua viene quindi caricata su cartuccia a permeazione di gel ed eluita con 0.1N CH 3 COOH

15 Tecniche analitiche Attualmente la determinazione analitica dell anatossina-a(s) è piuttosto difficoltosa Nella molecola non sono presenti gruppi cromofori quindi non è possibile utilizzare l UV come rivelatore Con tecniche LC-MS è possibile effettuare l identificazione qualitativa ma la TOTALE assenza di standard in commercio rende difficile la quantificazione Vengono utilizzati metodi che sono basati sulla capacita dell anatossina-a(s) di inibire la acetilcolinesterasi (AChE),con il grosso limite di tali metodi colorimetrici e che tutti i composti organofosforici danno risposte positive

16 Anatossina-a (C 10 H 15 NO) Ammina secondaria biciclica a basso peso molecolare (MW: 165 u. m. a.) pk a = 9.6 Omoanatossina-a (C 11 H 17 NO) Omologo della Anatossina-a, Differisce dalla Anatossina-a per la presenza in C2 di un propionile anziché un acetile Peso molecolare 179 u. m. a. La spettrometria di massa ha evidenziato la presenza di prodotti di degradazione che sono diidro ed epossi derivati delle tossine originali La Anatossina-a non risulta sia mai stata individuata in ceppi produttori di Omoanatossina-a e viceversa

17 Conservazione del campione Luce e batteri contribuiscono alla degradazione Relativamente stabile al buio, ma alla luce degrada rapidamente anche in assenza di pigmenti il suo tempo di emivita per degradazione fotochimica è di 1-2 ore. Decompone in ambiente alcalino. In campioni senescenti sono stati rinvenuti raramente composti di degradazione non tossici quali diidroanatossina ed epossianatossina

18 Estrazione Estrazione con: H 2 O MeOH acq CH 3 COOH acq soluzione Tyrode ( sol acquosa contenente Sali di potassio, magnesio calcio e sodio e destrosio a ph 7.4) Miscela di MeOH, H 2 O e CH 3 COCH 3 Viene poi aggiunto ESANO per rimuovere i lipidi dall estratto MSPD (Dispersione della matrice in fase solida) Vantaggi: semplicita, riduzione nell uso dei solventi ed eliminazione della possibile formazione di emulsioni

19 Concentrazione e Purificazione Campione a ph7 DEBOLE SCAMBIO IONICO C18 Campione a ph10 SPME alla fibra delle cartucce viene aggiunto un derivatizzante (4-fluoro-7- nitro 2,1,3,- benzossadiazolo) che si lega all anatossina che così derivatizzata può essere analizzata in HPLC con fluorimetro. MeOH con 0.2% TFA MeOH L SPME permette l automatizzazione dell estrazione e dell analisi ma gli LOD sono ancora elevati

20 Tecniche analitiche L anatossina-a non presenta grosse difficoltà analitiche: La struttura è stata identificata con chiarezza già dagli anni 70 Lo standard è facilmente reperibili in commercio Esistono solo due varianti strutturali anatossina-a e omoanatossina-a Si conoscono i loro prodotti di degradazione La scelta del metodo quindi dipende solo dal tipo di campione da analizzare e dalle attrezzature disponibili nel laboratorio

21 Tecniche analitiche La maggior parte dei metodi sono basati sulla CROMATOGRAFIA: La cromatografia su strato sottile viene spesso utilizzata per la purificazione della tossina e come economico metodo di screening. NON È PERÒ PRECISA PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA L HPLC sia con rivelatori UV meglio con rilevatori fluorimetrici. La rivelazione UV presenta un massimo di assorbimento a 227nm ci sono pero molte interferenze e non si vedono i prodotti di degradazione La SPETTROMETRIA DI MASSA sia in LC che in GC ha permesso notevoli progressi nella identificazione delle anatossine. E stato possibile inoltre determinare la struttura dei prodotti di degradazione. Lo svantaggio della GC sta nella necessità della derivatizzazione, tuttavia sono state ottimizzate molte procedure di derivatizzazione della anatossina e della omoanatossina L identificazione di nuove neurotossine è essenziale avere a disposizione tecniche di spettrometria di massa, ma anche tecniche NMR Il limite delle tecniche NMR consiste nel fatto che sono richieste quantità dell ordine dei milligrammi per poter effettuare le analisi

22 ATTENZIONE IN LC-MS! In LC-MS bisogna far attenzione a non confondere con la fenilalanina che ha lo stesso peso molecolare e tempi di ritenzione molto simili. Inoltre analizzate in LC-MS/MS danno frammenti con lo stesso peso molecolare. In questo caso la conferma può venire dall UV in quanto gli spettri delle due molecole sono molto diversi

23 Cilindrospermopsina Alcaloide guanidinico (un gruppo guanidinico triciclico combinato con un idrossimetiluracile) Peso molecolare 415 u.m.a. Contrariamente alle microcistine durante il bloom sembra che una larga parte della tossina sia in forma disciolta -O 3 S OH O H 3 C N NH HN C + NH HN O

24 Conservazione del campione La cilindrospermopsina viene fortemente assorbita dal polietilene, contenitori in polietilene quindi non possono essere utilizzati per il campionamento e/o lo stoccaggio. Stabile per diverse settimane in acqua al buio a ph tra 4 e 10 e a T fino a 50 o C Degrada rapidamente alla luce in presenza di detriti cellulari La cilindrospermopsina negli estratti cellulari se esposta alla luce ha una emivita di ore

25 Estrazione/Purificazione/Analisi Tecniche più utilizzate: HPLC UV, HPLC-DAD LC-MS/MS Estrazione con MeOH o H 2 O CARBOGRAPH INIEZIONE DIRETTA Il metodo raggiunge tali livelli di sensibilità che è possibile evitare sia l estrazione che la purificazione Presenta il picco massimo di assorbimento a 262nm. L analisi all UV non è sensibile e quindi richiede elevate concentrazione MeOH

26 Famiglia di eptapeptidi monociclici che presenta al suo interno una grande varietà strutturale (5) Adda H H 3 C O H Microcistine H 3 C H H (6) D-Glu (7) N-metildeidroalanina (Mdha) HN H O COOH O H 3 C N O H CH 2 H 3 C NH O (1) D-Ala H 3 C H H 3 C H NH H CH 3 NH R 1 R 2 O H COOH MC-LR LD 50 = 50 µg/kg (3) D-eritroβ-metilAsp Più di 80 congeneri

27 Nodularine Famiglia di pentapeptidi ciclici Al contrario delle mc esistono poche varianti O CH 3 C H 3 O CH 3 CH 3 NH O N H COOH H N O O CH 3 CH 3 N COOH NH CH 2 CH 3 O N HN NH 2

28 Conservazione del campione MC e NDL sono relativamente stabili in acqua distillata, in soluzioni sterili e in MeOH ma in presenza di pigmenti fotodegradano rapidamente Dopo l estrazione se il campione non viene analizzato subito è preferibile utilizzare MeOH come solvente di stoccaggio. Studi hanno infatti mostrato che dopo 30 giorni si verifica una parziale degradazione della MC-RR se conservata in acqua o in acido acetico al 5%,. Il ph non influisce sulla stabilità di MC NDL Può esserci degradazione microbica: questa dipende dal tipo di organismi presenti e dalla temperatura, refrigerare il campione può rallentare la degradazione (NDL a Tamb degrada rapidamente) Per il campionamento e lo stoccaggio preferire contenitori in vetro scuro alla plastica se si utilizza rivelatore UV. La plastica rilascia additivi che assorbono a 238 nm e che vengono coeluiti con le MC.

29 Estrazione CH 3 COOH H 2 O in proporzioni diverse MeOH H 2 O MeOH H 2 O sonicando Il metanolo puro risulta essere il solvente migliore per l estrazione delle MC più idrofobe, non è tuttavia molto efficace nell estrazione delle varianti più idrofile come ad esempio la MC-RR. Uno studio effettuato utilizzando percentuali diverse di metanolo ha mostrato che la miscela che permette un più ampio range di varianti è costituita da MeOH-H 2 O al 75%.

30 Estrazione Fegato intestino: MeOH 75-85% omogeneizzando MSPD (Dispersione della matrice in fase solida) n-butanolometanoloacqua (5:20:75) MeOH GLI ESTRATTI POSSONO ESSERE Analizzati direttamente in LC Purificati su C18 La purificazione porta ad una maggiore stabilità nella cromatografia. Senza si verifica facilmente l occlusione della precolonna con aumento della contropressione e conseguente shift dei tempi di ritenzione

31 Concentrazione / Purificazione Campione acidificato CARBOGRAPH Campione acidificato C18 IMMUNOAFFINI Utilizzando le comuni C18 si rischia di avere bassi recuperi per le MC più idrofobe come MC-LW MeOH MeOH MeOH

32 Tecniche analitiche Le tecniche più utilizzate sono quelle CROMATOGRAFICHE più precisamente la CROMATOGRAFIA LIQUIDA Le tossine vengono separate tra loro e da eventuali interferenze coestratte utilizzando generalmente colonne C18 o C8 Le MC-LR ed YR vengono separate piuttosto facilmente utilizzando una colonna a SCAMBIO IONICO La MC-LR e la MC-RR e le rispettive varianti 3-demetilate vengono separate meglio utilizzando colonne C16 AMMIDICHE.

33 Tecniche analitiche La fase mobile maggiormente utilizzata è costituita da acqua e metanolo o acetonitrile. Una maggiore efficienza separativa si ottiene utilizzando gradienti che permettano di coprire più ampi range di polarità in modo da sfruttare le diverse polarità delle microcistine ma anche aggiungendo opportuni modificanti organici come AcNH 4, TFA, Acido Formico. La fase mobile a carattere acido viene ritenuta in genere quella con la capacità di separare un maggior numero di varianti.

34 Tecniche analitiche Con rivelatori UV le microcistine e la nodularina assorbono a nm, per le varianti che contengono amminoacidi aromatici, come la MC-LW che contiene un triptofano, l assorbimento massimo si ha a lunghezze d onda minori e precisamente a 222nm. Grosso limite dei rivelatori UV è che possono esistere molte sostanze coeluite con le MC e che assorbono alle stesse lunghezze d onda. In tali casi rilevatori come il DAD, consentono di affermare con maggiore sicurezza la presenza di MC. L identificazione inequivocabile delle MC si ottiene solo con rivelatori di massa, sia MS che MS/MS. Tali metodiche si sono rivelate fondamentali nell identificazione sia delle MC note che delle nuove varianti

35 Considerazioni conclusive Abbiamo a disposizione una grande varietà di metodi specifici e sensibili per la determinazione delle cianotossine DIFFICOLTÀ A PASSARE DALLA RICERCA PURA AL LAVORO DI ROUTINE

36 Considerazioni conclusive PER MOLTE CIANOTOSSINE: 1. CARENZA DI STANDARD CERTIFICATI 2. MANCANO I DATI TOSSICOLOGICI. Limite di 1 ug/l per MC-LR È necessario calcolare la tossicità equivalente di tutti gli altri congeneri eventualmente rilevati

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