Terreni colturali e controllo di idoneità. Giornata di Studio AFI 31/03/2009 Pergola Luigi - Doppel Farmaceutici

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1 Terreni colturali e controllo di idoneità 1

2 Il terreno di coltura è l unico mezzo che abbiamo (con la microbiologia tradizionale) per evidenziare la presenza di contaminazione microbica; per essere quindi certi dei risultati di analisi è fondamentale che questo sia efficace. 2

3 Tutto questo assume maggior importanza se consideriamo che, secondo stime pubblicate da Klaus Haberer al recente PDA Conference di Milano del Novembre 2008, il recupero della contaminazione si aggira intorno al 10% del totale della conta vitale. Questi sono microrganismi non coltivabili a a causa delle limitazioni intrinseche del metodo; scelta della temperatura di incubazione, generalità del terreno, tipo respiratorio, microrganismi difficili cheche necessitano di supplementi specifici. 3

4 Definizione di terreno di coltura 4

5 I terreni di coltura sono dei sistemi solidi o liquidi contenenti sostanze nutritive generalmente costituite da fonti di C, H, O, N, S, P sotto forma di amminoacidi e zuccheri capaci di fornire un ambiente ottimale per la crescita dei microrganismi. Un terreno liquido può essere reso solido semplicemente aggiungendo agar che agendo da solidificante trasforma il terreno in gelatina. 5

6 Classificazione dei terreni 1. Terreni arricchiti 2. Terreni selettivi 3. Terreni di arricchimento 4. Terreni generici 5. Terreni indicativi 6

7 Terreni arricchiti Sono terreni ricchi di nutrienti studiati appositamente per le specie microbiche esigenti da un punto di vista nutritivo, spesso contengono sangue o siero, per simulare meglio le condizioni riscontrate nell'organismo che ospita un determinato microrganismo. 7

8 Terreni selettivi Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di sostanze che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. alcuni esempi di sostanze inibenti. CRISTAL VIOLETTO: Inibitore dei Gram+ VERDE BRILLANTE: Inibitore dei Gram+ CETRIMIDE: Sale d ammoniod attivo sia sui Gram+ che Gram -. ANTIBIOTICI: in genere utilizzati per inibire la crescita dei batteri favorendo quella di lieviti e muffe. 8

9 Terreni di arricchimento Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che rallentano la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame. 9

10 Terreni generici Sono terreni la cui composizione permette un ampio spettro di specie batteriche coltivabili. 10

11 Terreni indicativi Sono terreni la cui composizione permette di evidenziare le qualità fenotipiche dei microrganismi. 11

12 Passi fondamentali per una preparazione di qualità del terreno di coltura Preparazione del terreno Test per il Controllo Qualità Stoccaggio del terreno 12

13 Preparazione del terreno: rif. USP <1117> microbial best laboratory practices Attenersi scrupolosamente a quanto indicato dal fornitore. Il quale deve fornire adeguata certificazione circa le istruzioni i di preparazione per i terreni disidratati. Certificato di analisi per i terreni pronti, comprensivo di data di scadenza, di istruzioni di conservazione e test di idoneità con i microrganismi utilizzati. Pesata La fase di pesatura deve essere accurata, utilizzando una bilancia ia calibrata e ben pulita. 13

14 Preparazione del terreno: Diluente l acqua distillata è il diluente di elezione per i terreni microbiologici. Tutte le pesate effettuate e le quantità di diluente utilizzato devono essere registrate. Dissoluzione del terreno Porre attenzione che il terreno non venga a contatto con sostanze e inibitorie che possono essere presenti come residui del lavaggio della vetreria; eria; i contenitori devono essere accuratamente puliti. I terreni disidratati devono essere dissolti completamente prima della distribuzione nel contenitore finale. Qualora sia necessario riscaldare per dissolvere il terreno, è importante non eccedere con le temperature. 14

15 Preparazione del terreno: Sterilizzazione I tempi dell eventuale eventuale sterilizzazione a vapore, in genere, è indicata dal fornitore; tipicamente si utilizzano cicli a 121 CC per 15 minuti, usando un autoclave con ciclo convalidato. Alcuni terreni vengono sterilizzati per filtrazione, mentre altri, essendo termolabili e non filtrabili, subiscono solo un blando riscaldamento; la preparazione di questi terreni viene effettuata a in condizioni asettiche sotto cappa a flusso laminare sterile utilizzando contenitori ed attrezzature sterili. 15

16 Stoccaggio del terreno: I terreni devono essere etichettati con il numero di lotto, data di preparazione e di scadenza e l identificazionel del terreno. Minimizzare la perdita di umidità e provvedere alla protezione meccanica Importante è la fase di conservazione dei terreni prima dell uso. E necessario garantire la corretta temperatura di conservazione. 16

17 Stoccaggio del terreno: Le condizioni di stoccaggio sono quelle definite dal fornitore o se diverse devono essere convalidate. Non conservare i terreni solidi a temperature inferiori a 0 C. Proteggere il terreno dalla luce e da eccessive temperature. Gli ambienti di conservazione devono essere monitorati. Vale per i luoghi di stoccaggio sia dei terreni pronti che dei terrenit disidratati. 17

18 Stoccaggio del terreno: In caso di guasti alle celle climatiche, il terreno deve essere spostato in ambiente con le condizioni climatiche più vicine a quelle prescritte ma prima dell uso dovrà essere verificata la fertilità di ogni terreno interessato dall anomalia. anomalia. Durante l utilizzo, l il terreno solido che deve essere fluidificato va mantenuto in bagnomaria a CC per non più di otto ore. 18

19 La capacità di un terreno è strettamente dipendente dalla preparazione. Ogni lotto di terreno pronto o preparato deve essere testato: EP (4.4) (3.3) - USP <1117>. 19

20 Parametri che inficiano la qualità del terreno: Il ph è parametro critico (Range secondo istruzioni del fornitore). Flaconi conservati non attenendosi alle raccomandazioni. Terreno scaduto o surriscaldato. Pesata errata. Recipiente di preparazione sporco. Sterilizzazione non corretta. Acqua di cattiva qualità. 20

21 Verifiche dopo la preparazione: ispezione visiva dei contenitori al termine della preparazione e sterilizzazione. integrità dei contenitori e dei coperchi. riempimento omogeneo dei contenitori. eccessivo imbrunimento o variazioni di colore. formazione di cristalli. eccessivo numero di bolle. 21

22 Verifiche dopo la preparazione: contaminazione microbica. stato di ossidazione del terreno. precipitazione dei componenti. corrispondenza numero di lotto e data di scadenza. 22

23 Verifiche dopo la preparazione: Ulteriori parametri da controllare dopo la preparazione sono i seguenti. STERILITÀ. FERTILITÀ (GROWTH PROMOTION). PROPRIETÀ INIBITORIE (INIBITORY PROPERTIES). INDICAZIONI DI CRESCITA (INDICATIVE PROPERTIES). 23

24 Controlli di STERILITÀ: effettuare una verifica della sterilità per ogni lotto di terreno preparato. Tale test viene effettuato incubando una parte del lotto alle temperature di CC e C. Per i terreni non sterilizzati, incubare tutto il lotto alternativamente alla temperatura di CC e C. 24

25 Controlli di STERILITÀ : Dopo incubazione il terreno, per essere approvato, deve risultare sterile; nel caso in cui al termine dei relativi periodi d incubazioned si verifichi crescita microbica, le eventuali analisi effettuate con n i lotti non idonei devono essere invalidate. L esecuzione del test ed i relativi risultati devono essere registrati rati indicando: data d iniziod e di fine incubazione, temperatura d incubazione, esito e sigla analista che ha emesso il giudizio sulla sterilità. 25

26 Controlli di FERTILITÀ : La prova consiste nel determinare le capacità nutritive dei terreni di coltura. I terreni agarizzati contenuti nei flaconi vengono dapprima sciolti e piastrati in numero sufficiente per le prove. 26

27 Controlli di FERTILITÀ : L inoculo del microrganismo appropriato non deve essere maggiore did 100 CFU. I terreni generici (TSA ecc.) inoculati con ceppi batterici sono incubati a CC per non più di tre giorni. I terreni generici inoculati con ceppi fungini sono incubati a o CC a seconda del terreno utilizzato per non più di cinque giorni. I terreni specifici sottoposti al test di fertilità,, vanno incubati alle relative temperature di utilizzo nei test microbici per il tempo più breve indicato. 27

28 Controlli di FERTILITÀ - Esiti: Sui terreni solidi di conta: La crescita ottenuta non deve differire di un fattore maggiore di 2 (il doppio o la metà) rispetto al valore calcolato di un inoculo standardizzato. La crescita del microrganismo test sia comparabile con quanto ottenuto con un lotto precedentemente testato ed approvato. 28

29 Controlli di FERTILITÀ - Esiti: Sui terreni liquidi: avvenga lo sviluppo del microrganismo inoculato e sia comparabile con quanto ottenuto con un lotto precedentemente testato ed approvato. (Non prescritto ma consigliato) Verificare, mediante subculture su terreno selettivo, che l aspettol delle colonie sviluppatesi sia corrispondente al microrganismo test utilizzato. 29

30 Controlli di FERTILITÀ : CASEYN SOYA AGAR Aspergillus niger ATCC Candida albicans ATCC Bacillus subtilis ATCC 6633 Ps. aeruginosa ATCC 9027 St. aureus ATCC 6538 Funghi 5gg C C x Batteri 3 3 gg 30

31 Controlli di FERTILITÀ : CASEYN SOYA BROTH St. aureus ATCC 6538 Ps. aeruginosa ATCC 9027 Bacillus subtilis ATCC non prescritti Salmonella enteritidis NCTC 6017 Escherichia coli ATCC C 3 3 gg 18 h? SABOURAUD DEXTROSE AGAR Aspergillus niger ATCC Candida albicans ATCC C 5 5 gg 31

32 PROPRIETA INIBITORIE INIBITORIE (INIBITORY PROPERTIES ):) La prova consiste nel determinare le capacità inibitorie dei terreni di coltura. Inoculare almeno 100 CFU del microrganismo appropriato. I terreni specifici sottoposti al test di inibizione, vanno incubati alle relative temperature di utilizzo nei test microbici per il tempo più lungo indicato. Esito: Nessuna crescita nel test di inibizione. 32

33 INDICAZIONI DI CRESCITA (INDICATIVE PROPERTIES): La prova consiste nel verificare la capacità dei terreni specifici di coltura di evidenziare i microrganismi tramite l aspettol della colonia e le reazioni biochimiche previste. Inoculare non più di 100 CFU del microrganismo appropriato. I terreni specifici sottoposti al test delle proprietà,, vanno incubati alle relative temperature di utilizzo nei test microbici per un tempo compreso tra quello indicato. Esito: l aspetto sia comparabile con quanto ottenuto con un lotto precedentemente testato ed approvato ovvero comparabile a quanto descritto nelle Farmacopee Ufficiali o, in mancanza, nei manuali dei fornitori di terreni. 33

34 INDICAZIONI DI CRESCITA (INDICATIVE PROPERTIES): Terreno Microrganismo test Aspetto delle colonie VRB glucose agar E. Coli ATCC 8739 Colonie rosse o rossastre circondate da zona di precipitazione rossastra/rosso intensa VRB glucose agar P. Aeruginosa ATCC 9027 Colonie chiare MacConkey agar E. Coli ATCC 8739 Colonie dal rosa al rosso circondate da zona di precipitazione rossastra (bile precipitato) X.L.D. agar Salmonella enterica NCTC 6017 Colonie rosato/rosse con o senza centro nero X.L.D. agar E. Coli ATCC 8739 Inibizione/leggera crescita di colonie gialle Mannitol salt agar S. Aureus ATCC 6538 Colonie gialle circondate da alone giallo Cetrimide Agar P. Aeruginosa ATCC 9027 Colonie trasparenti da incolori a verde fluorescente con intenso aroma fruttato SAB dextrose agar C. Albicans ATCC Colonie bianche cremose 34

35 Controlli microrganismi specifici: Medium Property Incubation temperature Test strains E.E.B.- Mossel Growth promoting x 24 h E. coli ATCC 8739 P. aeruginosa ATCC 9027 Inhibitory x 48 h S. aureus ATCC6538 Test for bile-tolerant gram-negative bacteria VRB glucose agar Growth promoting x 18 h E. coli ATCC8739 P. aeruginosa ATCC9027 Indicative x h 35

36 Controlli microrganismi specifici : Medium Property Incubation temperature Test strains Growth promoting x 24 h E. coli ATCC8739 MacConkey broth Test for Escherichia coli Inhibitory x 48 h S. aureus ATCC6538 MacConkey agar Growth promoting x 18 h E. coli ATCC8739 indicative x h 36

37 Controlli microrganismi specifici : Medium Property Incubation temperature Test strains Rappaport Vassiliadis Salmonella enrichment broth Growth promoting x 18 h Salmonella enterica NCTC 6017 Inhibitory x 24 h S. aureus ATCC6538 Test for Salmonella X.L.D. agar Growth promoting indicative x 18 h x h Salmonella enterica NCTC 6017 Indicative * x h E. coli ATCC

38 Controlli microrganismi specifici : Medium Property Incubation temperature Test strains Test for Pseudomonas aeruginosa Cetrimide agar Growth promoting x 18 h P. aeruginosa ATCC 9027 Inhibitory x 72 h E. coli ATCC8739 Test for Staphylococcus aureus Mannitol Salt agar Growth promoting indicative x 18 h x h S. aureus ATCC 6538 Inhibitory x 72 h E. coli ATCC

39 Controlli microrganismi specifici : Medium Property Incubation temperature Test strains Test for clostridia Reinforced medium for clostridia Growth promoting x 48 h Cl. sporogenes ATCC19404 Columbia agar Growth promoting x 48 h Cl. sporogenes ATCC19404 SAB dextrose broth Growth promoting x 3 d C. albicans ATCC10231 Test for Candida albicans SAB dextrose agar Growth promoting Indicative x 24 h x h C. albicans ATCC

40 Controlli di qualità - Dubbi e suggerimenti : Verificare la fertilità del TSB con Coli e Salmonella * Eliminazione del test indicativo del XLD con E. coli Ufficiale da luglio 2009 Modalità di confronto: non obbliga al confronto parallelo, è ammessa la verifica su carta se chiaramente descritta ( (e.d.q.m.). comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs. Growth promotion per microrganismi specifici è un test qualitativo e non quantitativo; il fattore 2 non è richiesto ma può essere usato per la comparazione insieme, ad esempio, alla dimensione delle colonie al tempo più breve di incubazione prescritto (e.d.q.m.)..). 40

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