Test per il rilevamento o la quantificazione tramite PCR in real-time di Legionella spp. e Legionella pneumophila nei campioni di acqua

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1 iq-check Screen Legionella spp. Kit Codice #: iq-check Quanti Legionella spp. Kit Codice #: iq-check Screen L. pneumophila Kit Codice #: iq-check Quanti L. pneumophila Kit Codice #: Manuale d istruzioni Test per il rilevamento o la quantificazione tramite PCR in real-time di Legionella spp. e Legionella pneumophila nei campioni di acqua

2 SOMMARIO I. Introduzione II. III. La tecnologia iq-check Legionella Composizione del kit III.1. iq-check Screen Legionella III.2. iq-check Quanti Legionella IV. Validità e conservazione IV. VI. Materiale necessario non fornito nel kit IV.1. Reagente e materiali di consumo IV.2. Strumenti e software Precauzioni e raccomandazioni VII. Protocollo VII.1. Prelievo e trasporto dei campioni VII.2. Filtrazione del campione di acqua ed estrazione del DNA VII.3. Preparazione della miscela PCR VII.4. Lancio della reazione di amplificazione VII.5. Analisi dei dati VIII. Interpretazione dei risultati VIII.1. iq-check Screen Legionella VIII.2. iq-check Quanti Legionella IX. AFNOR VALIDATION X. Bibliografia XI. Appendice A: Tabelle di pipettatura Mix PCR 2011 Bio-Rad 2

3 I. INTRODUZIONE La Legionella è un batterio gram negativo presente in tutti gli ambienti acquatici. Il batterio può causare polmonite acuta, Legionellosi, forme più leggere d'infezione polmonare, febbre di Pontiac. In Europa il numero di casi dichiarati di legionellosi aumenta del 25% all anno. Negli Stati Uniti la CDC (Commission for Disease Control) stima che il numero di casi di Legionellosi è compreso fra e all anno. Il ceppo Legionella pneumophila è responsabile di circa il 90% delle infezioni patogene. Il controllo regolare della presenza di Legionella nei sistemi di distribuzione idrica è il solo mezzo di prevenzione della malattia. Il rilevamento di questi batteri è obbligatorio o fortemente raccomandato nella maggior parte dei paesi sviluppati. I metodi di coltura convenzionali per il rilevamento di Legionella spp. e Legionella pneumophila nei campioni d acqua presentano diversi inconvenienti, fra cui la bassa sensibilità e periodi di incubazione lunghi (10-13 giorni di analisi per campioni positivi). I kit iq-check Legionella spp. e iq-check L. pneumophila sono kit per la ricerca o la quantificazione rapida di Legionella (spp. o pneumophila) nei campioni d acqua. Tramite il sistema PCR in real-time, sequenze di DNA specifiche del genere Legionella spp. o della specie Legionella pneumophila vengono amplificate e rilevate grazie a sonde fluorescenti. La quantificazione è possibile utilizzando gli standard iq-check Legionella Quantification Standards nel corso della fase di amplificazione. I risultati vengono ottenuti in meno di 3 ore dopo la fase di filtrazione del campione d acqua e di estrazione del DNA. II. LA TECNOLOGIA iq-check Legionella I test si basano sull amplificazione e sul rilevamento di sequenze genomiche tramite il metodo PCR in real-time. I kit contengono tutti i reagenti pronti per l uso necessari per effettuare l analisi dei campioni: soluzioni di amplificazione contenenti la Taq DNA polimerasi e il controllo interno, sonde e primer fluorescenti specifici, controlli negativi e positivi. Standard supplementari vengono forniti per la quantificazione. I reagenti e il metodo sono ottimizzati per l utilizzo dei sistemi di termociclatori Bio-Rad (per conoscere l elenco completo, contattare il proprio rappresentante Bio-Rad locale). Nel corso della reazione di PCR, i primer si legano alla regione target, poi catalizzati dalla Taq ADN polimerasi, si allungano nel senso 5 verso 3 utilizzando i desossinucleotidi trifosfati (dntps) presenti nella miscela di reazione, creando così una sequenza complementare di DNA, chiamata amplicone. Durante la PCR, una sonda oligonucleotidica specifica si ibrida con gli ampliconi. Questa sonda è marcata da un fluoroforo che emette fluorescenza solo in configurazione ibridata con gli ampliconi. Le sonde che si legano alle sequenze target di Legionella spp. o Legionella pneumophila sono marcate dal fluoroforo FAM. In presenza di DNA target nel campione, l intensità della fluorescenza cresce proporzionalmente all aumento della quantità di prodotti amplificati. La fluorescenza viene misurata direttamente dal modulo ottico del termociclatore durante la fase di ibridazione. Il software associato all apparecchio visualizza in tempo reale l intensità della fluorescenza misurata in funzione del numero di cicli di amplificazione. Per ciascuna reazione, il software determina un Ct, ciclo a partire dal quale la fluorescenza si innalza significativamente al di sopra del rumore di fondo. I valori dei Ct sono correlati al logaritmo del numero di copie iniziali della sequenza target. La lettura dei valori dei Ct consente di rilevare la presenza delle sequenze di DNA target di Legionella, che segnala la presenza del batterio target nel campione d acqua d origine. La quantificazione è possibile tramite comparazione dei risultati alla curva di quantificazione ottenuta con gli standard iq-check Legionella Quantification Standards nel corso della fase di amplificazione. Per ciascun campione, un DNA sintetico che serve da controllo interno è incluso nella soluzione di amplificazione. Questo consente il rilevamento di eventuali fenomeni di inibizione della reazione di amplificazione. Il controllo interno è amplificato allo stesso tempo 2011 Bio-Rad 3

4 delle sequenze target di Legionella spp. o di Legionella pneumophila, con gli stessi primer, ma è rilevato da una sonda marcata con un fluoro foro diverso (canale HEX). Questi metodi consentono il rilevamento o la quantificazione di Legionella spp. o di Legionella pneumophila in tutti i campioni d acqua in 4 ore. I metodi comprendono le fasi seguenti: Filtrazione dei campioni Estrazione del DNA (kit Aquadien, rif Bio-Rad: ), Reazione di PCR per la ricerca di Legionella spp. o Legionella pneumophila (iq-check Screen Legionella spp., rif. Bio-Rad: o iq-check Screen L. pneumophila, rif. Bio-Rad: ) Oppure Reazione di PCR per la quantificazione di Legionella spp. o Legionella pneumophila (iq- Check Screen Legionella spp., rif.: o iq-check Screen L. pneumophila, rif. Bio-Rad: in associazione con gli iq-check Legionella Quantification Standards, rif. Bio-Rad: ). III. COMPOSIZIONE DEL KIT III.1. iq-check Screen Legionella spp. ( ), iq-check Screen L. pneumophila ( ) I kit iq-check Screen Legionella spp. e iq-check Screen L. pneumophila contengono la quantità di reagente necessaria per 96 reazioni. Consentono il rilevamento di un massimo di 94 campioni. Reagente Sonde fluorescenti Soluzione di Amplificazione Controlle Negativo PCR Controllo Positivo PCR iq-check Screen Legionella spp. iq-check Screen L. pneumophila Presentazione 1 provetta, tappo viola (0,55 ml) 2 provette (2 x 2,2 ml) 1 provetta, tappo verde (0,5 ml) 1 provetta, tappo rossa (0,25 ml) III.2. iq-check Quanti Legionella spp. ( ), iq-check Quanti L. pneumophila ( ) Per la quantificazione, gli standard iq-check Legionella Quantification Standards sono associati ai kit iq-check Screen Legionella. Questi standard consentono la quantificazione di un massimo di 94 campioni. iq-check Screen Legionella spp. iq-check Screen L. pneumophila iq-check Legionella Quantification Standards Kit Reagente Presentazione Reagente Presentazione Sonde fluorescenti 1 provetta, tappo viola 1 provetta, tappo bianco Qs1 PCR Standard (0,55 ml) (0,08 ml) Soluzione di Amplificazione 2 provette (2 x 2,2 ml) Qs2 PCR Standard 1 provetta, tappo giallo (0,08 ml) Controlle Negativo PCR 1 provetta, tappo verde 1 provetta, tappo arancione Qs3 PCR Standard (0,5 ml) (0,08 ml) Controllo Positivo PCR 1 provetta, tappo rosso 1 provetta, tappo rosso Qs4 PCR Standard (0,25 ml) (0,08 ml) Materiale di Referenzia 1 provetta, tappo blu (0,08 ml) Scheda di Calibrazione Nota: Il Materiale di Riferimento è un DNA calibrato indipendente dagli Standard di Quantificazione, connesso al Materiale di Riferimento Standard Bio-Rad 4

5 IV. VALIDITÀ E CONSERVAZIONE Sin dalla ricezione, il kit deve essere conservato fra +2 C e +8 C. Ogni reagente conservato fra 2 C e +8 C può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sulla fiala. Nota: Non congelare i reagenti dei kit. V. ATTREZZATURE E MATERIALI NECSSARI NON FORNITI NEL KIT V.1. Reagenti e materiali di consumo Aquadien DNA Extraction Kit (rif. Bio-Rad: ) Puntali con filtro sterili, adattabili sulle micro pipette da 20 μl, 200 μl e 1000 μl Micropipette da 20 μl, 200 μl e 1000 μl Opzionale: Combitip o multidistributori Opzionale: Puntali per Combitip o multidistributori sterili a imballaggio individuale Guanti senza polvere Maschera Acqua distillata sterile Candeggina 5% Alcol (70%) Per le piastre PCR, provette, le pellicole sigillante e i tappi contattare il proprio rappresentante locale Bio-Rad o fare riferimento alle istruzioni per l uso dello strumento utilizzato. V.2. Strumenti e Software CFX96 (rif. Bio-Rad: ) CFX Manager Software Industrial Diagnostic Edition (rif. Bio-Rad: ) Nota: Raccomandiamo l utilizzo di un ondulatore elettrico (UPS) con il termociclatore. Contattare il proprio rappresentante locale Bio-Rad per una lista di strumenti compatibili. VI. PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI Questo test deve essere effettuato solamente da personale qualificato. I campioni di acqua devono essere manipolati ed eliminati come materiali potenzialmente infettivi. Per ciascuna serei di amplificazione, è essenziale usare un controllo negativo e uno positivo. Per la quantificazione, è necessario testare ciascun campione o controllo in doppio. Gli Standard per la Quantificazione sono testati in duplicato in ciascuna serie di amplificazione. Il Materiale di Riferimento deve quindi essere testato in accordo con lo Standard T La qualità dei risultati dipende dal rispetto scrupoloso delle Buone Pratiche di Laboratorio, in particolare in materia di PCR: - Il materiale (pipette, provette, ecc.) non deve circolare da una postazione di lavoro ad un altra. È opportuno utilizzare pipette esenti da DNA per pipettare le sonde fluorescenti, la soluzione di amplificazione e il controllo negativo. È opportuno utilizzare pipette distinte per la pipettatura dei campioni, del controllo positivo o degli standard di quantificazione. - È opportuno utilizzare attrezzature e materiali di laboratorio esenti da DNAse e da RNAse. - È indispensabile utilizzare un controllo positivo e un controllo negativo per ciascuna serie di reazioni di amplificazione. - Per ciascuna serie di quantificazione, si raccomanda di utilizzare un controllo di quantificazione esterna (DNA calibrato indipendente dagli standard di quantificazione). - Non utilizzare i reagenti al di là della data di scadenza. - Miscelare su Vortex i reagenti del kit prima del loro utilizzo per lavorare con soluzioni omogenee Bio-Rad 5

6 - Verificare l esattezza e la precisione delle pipette, nonché il buon funzionamento degli strumenti. - Cambiare guanti regolarmente e al minimo sospetto che possano essere stati contaminati. - È opportuno pulire regolarmente le superfici di lavoro con candeggina al 5% e risciacquare poi con acqua sterile e alcol al 70%. - Indossare guanti senza polvere per non lasciare impronte digitali sulla pellicola ottica per sigillare le micropiastre. Le impronte digitali possono infatti perturbare la lettura dei dati tramite l apparecchio. VII. PROTOCOLLO Si raccomanda vivamente di leggere l intero protocollo prima di iniziare il test. Rispettare scrupolosamente il protocollo proposto. VII.1. Prelievo e trasporto dei campioni I campioni di 1 L d acqua vengono raccolti in base alle norme generali per la ricerca e l enumerazione di Legionella tramite il metodo di coltura (NF T e ISO ). Raccogliere i campioni in recipienti sterili in vetro, in polietilene o in materiale similare. Se il campione d acqua contiene o si presume che contenga un biocida ossidante, aggiungere in quantità sufficiente un agente inattivante appropriato. I campioni devono essere consegnati al laboratorio il più rapidamente possibile, preferibilmente entro 24 ore, in ogni caso senza superare 48 ore dal prelievo del campione. Se i campioni vengono trasportati e analizzati entro 48 ore, allora il trasporto e lo stoccaggio devono essere effettuati a temperatura ambiente (+18 C a +30 C). Se i campioni vengono trasportati e analizzati entro 48 ore, il trasporto e lo stoccaggio devono essere effettuati ad una temperatura compresa fra +2 C e +8 C. Nota: attendere 48 ore dopo un trattamento biocida prima di prelevare un campione d acqua al fine di effettuare un analisi PCR in real-time. VII.2. Filtrazione del campione di acqua ed estrazione del DNA Da 100 a 1000 ml di campione sono filtrati su una membrana di policarbonato da 0,45 μm. Bio-Rad ha realizzato e validato un kit di estrazione di DNA per i campioni d acqua, ovvero il kit d estrazione di DNA Aquadien (rif. Bio-Rad: ). Le performance del metodo di rilevamento o di quantificazione di Legionella spp. o di Legionella pneumophila sono garantite quando il DNA è stato estratto con questo kit d estrazione Aquadien. Fare riferimento alle modalità d utilizzo per ottenere istruzioni complete riguardanti la filtrazione dei campioni e l estrazione del DNA. Nota: nel caso di campioni vischiosi, proponiamo un protocollo di purificazione alternativo. VII.3. Preparazione della miscela PCR 1. Miscelare su Vortex le provette di reagente prima dell utilizzo. Preparare la miscela di reazione iq-check Screen Legionella spp. o L. pneumophila miscelando 40 µl della soluzione di amplificazione e 5 µl di sonde fluorescenti per pozzetto, tenendo conto del numero di campioni, di controlli o di standard che devono essere analizzati. Nota: per la quantificazione, tutti i campioni, controlli e standard sono testati in duplicato. In allegato è fornita una tabella di pipettatura (capitolo XII) indicante i volumi di pipettatura per ciascun numero di pozzetti da trattare. Ad esempio: se 10 campioni in duplicato devono essere amplificati ai fini della quantificazione, 4 standard di DNA e 1 controllo negativo saranno caricati in duplicato nello stesso ciclo. In totale, saranno testati 30 pozzetti, 162 μl di sonde fluorescenti saranno miscelate a 1300 μl di soluzione di amplificazione. Una volta pronta, la miscela di reazione può essere conservata per 1 ora a 4 C Bio-Rad 6

7 Note: Non mescolare standard di quantificazione iq-check Legionella Quantification Standards recanti numeri di lotto diversi. Quando lanciamo insieme sulla stessa piastra una corsa di iq-check Legionella spp. and iq-check TM L. pneumophila, poiché le miscele di amplificazione sono specifiche per ciascun metodo, non dimenticare di far partire due serie indipendenti di standard di quantificazione. Inoltre le due serie di risultati dovranno essere analizzate separatamente. 2. Pipettare 45 μl della miscela di reazione in ciascun pozzetto in base al piano di piastra scelto. 3. Aggiungere 5 μl di campioni o di controlli (verificare più avanti, nella presente nota tecnica, i controlli da testare per lo screening o la quantificazione). 4. Sigillare ermeticamente tramite lo strumento adeguato. Verificare l assenza di bolle d aria in fondo ai pozzetti (è possibile centrifugare rapidamente). 5. Posizionare la piastra nel termociclatore. Verificare il corretto orientamento (pozzetto A1 in alto a sinistra). 6. Chiudere il modulo di reazione. VII.4. Avvio della reazione di amplificazione Prima di avviare una reazione, leggere il protocollo dettagliato corrispondente, fornito nelle istruzioni per l uso dello strumento. 1. Definire il piano di piastra Inserire le informazioni in ciascun pozzetto: - Condizioni di ricerca controlli positivi o negativi, o campioni; Nota: I controlli e i campioni sono depositati in singolo. - Condizioni di quantificazione: standard, controlli negativi o campioni. Indicare la quantità per ciascun pozzetto. Il valore esatto di ciascuno standard di quantificazione è indicato sulla scheda di calibrazione inserita in ciascuna scatola del kit iq-check Legionella Quantification Standards e sul certificato di analisi di ciascun lotto di prodotto. Nota: I controlli, gli standard e i campioni sono depositati in duplicato. 2. Scegliere il protocollo appropriato per il rilevamento o per la quantificazione di Legionella (per conoscere il termo protocollo dettagliato, fare riferimento alla guida dello strumento appropriato). 3. Verificare che lo strumento sia pronto e fare clic su Run. VII.5. Analisi dei dati Utilizzando il CFX96 TM, l analisi dei dati viene effettuata automaticamente dal Software CFX Manager TM Industrial Diagnostic Edition. Per l analisi manuale, analizzare uno dopo l altri i fili dei dati dei due fluorofori. Le fasi da seguire sono le seguenti: 1. Aprire il file di dati da analizzare 2. Ottimizzare i parametri di PCR a) Posizionamento della baseline b) Definizione della soglia di fluorescenza Per informazioni più dettagliate fare riferimento alla guida dello strumento Bio-Rad 7

8 VIII. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Il Software CFX Manager TM Industrial Diagnostic Edition genererà automaticamente anche un rapporto con l interpretazione completa dei campioni e dei controlli. VIII.1. iq-check Screen Legionella Per ottenere il risultato dell analisi, verificare in primo luogo che tutte le curve abbiano le caratteristiche tipiche di una curva di amplificazione: la curva deve essere sigmoide, con una fase di baseline, una fase esponenziale e una fase di plateau. È opportuno inoltre verificare la validità del controllo interno per ciascun pozzetto. Verificare poi la validità dei controlli positivi e negativi prima di leggere i valori di Ct di ciascun campione. 1. Controllo negativi e positivi Affinché il test sia valido, i risultati dei controlli negativi e positivi devono essere i seguenti: Rilevazione di Legionella spp. o di Legionella pneumophila (FAM) Rilevazione del Controllo Interno (Canale HEX) Controllo negativo N/A* 28 Ct 40 Controllo positivo 30 Ct 40 Non significativo * N/A = Non applicable. Il software indica N/A per il Ct di un campione quando la curva di fluorescenza non supera la soglia. Se i risultati dei controlli negativi e positivi differiscono da quelli presentati nella tabella precedente, è necessario ripetere la PCR Campione I risultati dei campioni dovranno essere interpretati come indicato nella tabella sottostante: Rilevazione Legionella spp. o di L. pneumophila (FAM) Rilevazione del Controllo Interno (Canale HEX) Risultati Ct 10 Non significativo Positivo 28 Ct 40 Negativo Interpretazione Presenza del target nel campione Target non rilevato, al limite di rilevazione del metodo N/A N/A Ct > 40 Inibizione Diluire il DNA e estratto e ripetere la PCR o l amplificazione di PCR Ct < 28 Problema di analisi Ripetere l analisi (capitolo VII.5.) Nota: La diluizione del campione di DNA deve essere effettuata nel tampone utilizzato per l eluizione del DNA ed alla fine della fase di estrazione. 3. Limite di rilevamento del metodo Il limite di rilevamento della fase di PCR (Ld PCR) per un metodo di rilevamento e di quantificazione di Legionella tramite PCR è definito come il numero più piccolo di Unità Genoma che generano un risultato positivo alla soglia di confidenza del 90% (NF T90-471). Il limite di rilevamento della fase di PCR (Ld PCR) è di 5 Unità Genoma per 5 μl di DNA estratto Bio-Rad 8

9 Per calcolare il limite di rilevamento teorico del metodo globale (Ld) per un campione di 1 L, occorre prendere in considerazione il fattore Z. Z rappresenta la frazione del campione depositato in ciascun pozzetto PCR. Il valore di Z dipende dal protocollo di estrazione del DNA utilizzato. È fornito nelle istruzioni del kit di estrazione di DNA Aquadien TM. D rappresenta il fattore di diluizione se il DNA è stato diluito prima della PCR. LD = 5 x Z x D Volume del campione filtrato (in L) La Ld teorica del metodo globale è calcolata nel caso di un rendimento di filtrazione e di estrazione del 100%. VIII.2. iq-check Quanti Legionella Per ottenere il risultato dell analisi, verificare in primo luogo che tutte le curve abbiano le caratteristiche tipiche di una curva di amplificazione: la curva deve essere sigmoide, con una fase di baseline, una fase esponenziale e una fase di plateau. È opportuno inoltre verificare la validità del controllo interno per ciascun pozzetto. Verificare poi la validità degli standard di quantificazione e dei controlli prima di leggere la quantità media di Unità Genoma calcolata per ciascun campione. 1. Controlli e standard Affinché il test sia valido, i risultati dei controlli negativi e degli standard di quantificazione devono essere i seguenti: Parametro Rilevazione di Legionella spp. o di Legionella pneumophila (FAM) Rilevazione del Controllo Interno (Canale HEX Controllo negativo N/A* 28 Ct 42 Efficacia della PCR 75% Efficacia di PCR 125% Coefficiente di correlazione (r^2) 0.99 Non significativo QS 1 a QS 4 20 Ct Ct 40 * N/A significa Non Applicabile. Il software indica N/A per il Ct di un campione quando la curva di fluorescenza non si innalza al di sopra della soglia. Se uno degli standard di quantificazione si trova significativamente al di fuori della curva standard, può essere eliminato per ottimizzare i risultati e raggiungere i parametri di cui sopra. Può essere eliminato un solo standard. Il Materiale di Riferimento deve seguire le richieste dello standard T Se i risultati dei controlli negativi e degli standard sono diversi da quelli descritti nella tabella qui di seguito, è necessario ripetere l analisi della PCR o la reazione PCR Bio-Rad 9

10 2. Campioni Rilevazione di Legionella spp. o di L. pneumophila (FAM) Rilevazione del Controllo Interno (Canale HEC) Risultati Interpretazione Ct Valore Medio Ct Qs + 3 σ Positivo Presenza di target nel campione, quantificazione possibile Ct 10 N/A Ct > Valore Medio Ct Qs + 3 σ Inibizione Diluire il DNA estratto (per esempio 1/10) e ripetere l amplificazione di PCR Ct Valore Medio Ct Qs + 3 σ Negativo Target non rilevato al limite del rilevazione del metodo N/A N/A Ct > Valore Medio Ct Qs + 3 σ Ct < Valore Medio Ct Qs - 3 σ Inibizione Problema di analisi Diluire il DNA estratto (per esempio 1/10) e ripetere la amplificazione di PCR per una quantificazione precisa Ripetere l analisi di PCR (capitolo VII.5) o la amplificazione PCR Valore Medio Ct Qs significa il medio di valori di tutti i Ct di Qs dei controlli interni (HEX). σ è la deviazione standard. Note: La diluizione del campione di DNA deve essere realizzata nel tampone utilizzato per l eluizione del DNA alla fine della fase di estrazione Se un campione ha un alta concentrazione di Legionella (Ct FAM < Ct FAM Qs4) il suo Ct HEX dovrebbe essere più alto del Ct HEX del Qs4. Questo campione è fuori dal range dinamico di quantificazione e deve essere diluito e processato nuovamente in PCR, se è richiesta una quantificazione precisa. Un campione con un valore di Ct più alto del valore dell intercetta b non sarà considerato positivo. 3. Calcolo della concentrazione di Legionella I valori indicati nel report per ciascun campione corrispondono alla quantità iniziale di Unità Genoma di Legionella presenti in 5 μl dell estratto di DNA. Per ottenere la concentrazione di Legionella in Unità Genoma/1 L di campione d acqua, tenere conto del valore medio ( UG Medio/pozzetto) calcolato dal software per ciascuno dei campioni. Applicare la formula seguente: X = [Quantità media in 5 µl] x Z x D Volume del campione filtrato (in L) X rappresenta le Unità Genoma di Legionella in 1 L di campione d acqua. Z rappresenta la frazione del campione depositato in ciascun pozzetto di PCR. Il valore di Z dipende dal protocollo di estrazione del DNA utilizzato. Tale valore è fornito nelle istruzioni del kit di estrazione di DNA Aquadien TM. D rappresenta il fattore di diluizione se il DNA è stato diluito prima della PCR. Nota: Se per un campione, sui 2 punti di analisi PCR, uno dei risultati è positivo e l altro negativo, il campione è considerato come positivo Bio-Rad 10

11 4. Limite di rilevamento, Limite di quantificazione e Limite alto di quantificazione del metodo 4.a. Limite di rilevamento del metodo Il limite di rilevamento della fase di PCR (Ld PCR) per un metodo di rilevamento e di quantificazione di Legionella tramite PCR è definito come il numero più piccolo di Unità Genoma che generano un risultato positivo alla soglia di confidenza del 90% (NF T90-471). Il limite di rilevamento della fase di PCR (Ld PCR) è di 5 Unità Genoma per 5 μl di DNA estratto. Per calcolare il limite di rilevamento teorico del metodo globale (Ld) per un campione di 1 L, occorre prendere in considerazione il fattore Z diviso 2 (2 punti di PCR testati per ciascun campione). D rappresenta il fattore di diluizione se il DNA è stato diluito prima del ciclo di PCR. LD = 5 x Z x D Volume del campione filtrato (in L) x 2 La Ld teorica del metodo globale è calcolata nel caso di un rendimento di filtrazione e di estrazione del 100%. 4.b. Limite di quantificazione del metodo Il limite di quantificazione della fase di PCR (Lq PCR) per un metodo di quantificazione di Legionella tramite PCR è definito come il numero minimo d copie necessario per consentire una ripetibilità e una precisione di quantificazione come descritte nella norma NF T Qs1, il primo punto della gamma di standard di quantificazione, corrisponde al Limite di quantificazione per ciascun lotto di kit iq-check Quanti Legionella. Il valore esatto del Qs1 per ciascun lotto di standard di quantificazione è indicato sulla Scheda di Calibrazione e sul Certificato di analisi. Per calcolare il limite di quantificazione esatto per il metodo globale, applicare la formula seguente: Lq = Qs1 x Z Se il laboratorio filtra un volume d acqua diverso da 1 L, o se l estratto di DNA deve essere diluito, il valore Lq del metodo globale cambia. Per calcolare il nuovo Lq per litro d acqua, utilizzare la formula seguente: LQ = Qs1 x Z x D Volume del campione filtrato (in L) 4.c. Limite alto di quantificazione del metodo Il limite alto di quantificazione (LHQ) del metodo corrisponde al valore (per 1 L) dato dal punto più alto della gamma di standard di quantificazione, cioè il punto Qs4. Il valore esatto del Qs4 per ciascun lotto di standard di quantificazione è indicato sulla Scheda di Calibrazione e sul Certificato di analisi. Per ottenere il valore LHQ del metodo, occorre moltiplicare il valore dello standard Qs4 per la frazione del campione analizzato Z e per il fattore di diluizione D. LHQ = Qs4 x Z x D Volume del campione filtrato (in L) 2011 Bio-Rad 11

12 Espressione dei risultati Il risultato finale è espresso in Unità Genoma/L con 2 cifre significative (ad es.: 1300 UG/L per una concentrazione calcolata di 1256 Unità Genoma/L.) Risultato in Unità Genoma/L < 1 < Ld* Interpretazione e conclusione Target non rilevato al limite di rilevamento del metodo Fra 1 e Lq* < Lq Presenza del target, non quantificabile Fra Lq e LHQ* X Presenza del target, risultato quantitativo > LHQ > LHQ Forte presenza del target, superiore a LHQ Diluizione possibile del campione di DNA se si necessita di un risultato quantitativo preciso. * Vedere paragrafo VIII.2, sezione 2c per il calcolo dei valori di Ld, Lq e LHQ del metodo globale. IX. AFNOR VALIDATION La certificazione in accordo con lo standard T (Aprile 2010) è in corso. X. BIBLIOGRAFIA 1. Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol.14: Wolters J, Erdmann VA. (1986). Compilation of 5S rrna and 5S rrna gene sequences. Nucleic Acids Res. 16 Suppl:r MacDonell MT, Colwell RR. (1987). The nucleotide sequence of the 5S rrna from Legionella pneumophila. Nucleic Acids Res. 15: Engleberg NC, Carter C, Weber DR, Cianciotto NP, Eisenstein BI. (1989). DNA sequence of mip, a Legionella pneumophila gene associated with macrophage infectivity. Infect Immun. 57: AFNOR XP T90-471: Detection and quantification of Legionella and Legionella pneumophila by concentration and PCR amplification (April 2006). 6. AFNOR T90-471: Detection and quantification of Legionella and Legionella pneumophila by concentration and PCR amplification (April 2010). 7. NF T , Water quality - Detection and enumeration of Legionella spp. and Legionella pneumophila - Method by direct inoculation and after concentration by membrane filtration or centrifugation. 8. ISO : Water quality - Detection and enumeration of Legionella - Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts Bio-Rad 12

13 IX. ALLEGATO A - Tabella di Pipettura Mix PCR La presente tabella di pipetta tura è stata calcolata prendendo in conto un margine di pipettatura dell 8%. Per la quantificazione, tenere conto del fatto che tutti i campioni e controlli sono testati in duplicato. Ad esempio: se 10 campioni devono essere amplificati ai fini della quantificazione, 4 standard di DNA e 1 controllo negativo saranno caricati nello stesso ciclo. In totale, saranno testati 30 pozzetti ( pozzetti doppi), 162 μl di sonde fluorescenti saranno miscelate a 1300 μl di soluzione di amplificazione. Numeri di Sonde Numeri di Sonde Mix PCR (µl) Mix PCR (µl) campioni fluorescenti (µl) campioni fluorescenti (µl) Bio-Rad 13

14 Avviso riguardante l acquirente: Licenza limitata L utilizzo di questo prodotto è coperto da uno o più dei seguenti brevetti statunitensi e dalle rivendicazioni di brevetto corrispondenti al di fuori degli Stati Uniti: , , , , (solo rivendicazioni da 1 a 23) e (solo rivendicazioni 1 e 6) e dalle rivendicazioni fuori degli Stati Uniti corrispondenti al brevetto statunitense n L acquisto di questo prodotto comprende un immunità limitata e non trasferibile contro procedimenti penali in base alle rivendicazioni di brevetto sopra indicate quando questa quantità di prodotto è utilizzata esclusivamente a fini di analisi alimentare, di analisi ambientale e in microbiologia industriale, compresa la notifica dei risultati delle attività dell'acquirente su remunerazione o di qualsiasi altra considerazione commerciale, e quando viene utilizzata a fini di ricerche proprie dell acquirente. Nessun diritto legato a una rivendicazione di brevetto (come le rivendicazioni 5 Nuclease Process dei brevetti statunitensi N e ) viene trasferito espressamente, per implicazione o per estoppei. Per maggiori informazioni sull acquisto di licenze, contattare il direttore delle concessioni di licenze, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA Bio-Rad 14

15 NOTE 2011 Bio-Rad 15

16 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - Francia Tel.: Rev. B - 01/2011 Fax: Nr.: Bio-Rad 16

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