DETERMINAZIONE DEL GLUTINE IN ALIMENTI E SUPERFICI

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1 Numero 01/2012 marzo 2012 DETERMINAZIONE DEL GLUTINE IN ALIMENTI E SUPERFICI Considerata l'elevata incidenza delle allergie alimentari e gli effetti anche gravi che possono provocare sull'uomo, le normative prevedono che la presenza di determinati allergeni nei prodotti alimentari (come tali o come derivati) venga segnalata in etichetta. Il riferimento normativo è costituito dalle Direttive Comunitarie 2003/89 e 2005/26, con le successive modifiche, recepite con i D. Leg 114/2006 e 178/2007, che riportano l'elenco completo degli allergeni alimentari da monitorare. In particolare, l'incremento dell'incidenza della patologia celiaca ha portato ad un aumento della richiesta di prodotti alimentari "gluten-free", definiti dal Codex Alimentarium come "contenenti una quantità < 20 PPM di glutine", e ben differenziati anche dagli alimenti che contengono quantità comprese tra 20 e 100 PPM (definiti invece "very low gluten"). La necessità di stabilire con precisione i livelli di glutine presenti negli alimenti ha portato alla messa a punto di tecniche di monitoraggio sempre più sofisticate, che siano in grado di garantire la sicurezza dei prodotti forniti ai consumatori. KAIROSafe propone una gamma completa di prodotti per il monitoraggio quantitativo del glutine in alimenti, materie prime e superfici di lavorazione, utilizzando come marker del glutine totale presente l ω-gliadina del grano. L'operatore potrà scegliere il kit che meglio risponde alle sue esigenze sulla base dell'applicazione, del Limit of detection (LOD) richiesto e delle attrezzature a disposizione. Vedremo di seguito tre kit rapidi e di semplice utilizzo: - Environmental/Surfaces Swabbing (ESS) Kit, per il monitoraggio degli ambienti di lavoro - GLUTEN Flow-Through (GFT), Test Rapido immunoenzimatico - GLUTEN-CHECK ELISA, test classico con metodica ELISA. SWABBING KIT PER MONITORAGGIO DELLE SUPERFICI L'attento monitoraggio degli ambienti di lavoro per la ricerca di allergeni in fase di processazione e manipolazione degli alimenti è diventato un punto cruciale per i programmi HACCP, portando alla messa a punto di prodotti specifici per questo scopo. I sistemi proposti da KAIROSafe vogliono garantire agli operatori del settore alimentare un metodo rapido ed efficace che consenta loro di verificare le procedure di pulizia utilizzate, eliminando così il rischi di cross-contaminazioni. Kit semplice, sicuro ed efficace, Environmental/Surfaces Swabbing (ESS) Kit può essere utilizzato per il monitoraggio di superfici anche di difficile accesso. E' stato formulato per rispondere anche alle esigenze di chi non ha un laboratorio attrezzato e quindi adatto ai più vari settori (produttori, catering, mense, comunità, laboratori...). E' costituito da un tampone soft in Pagina 1 di 6

2 nylon con punto di rottura e da una soluzione neutralizzante e stabilizzante contenente un colorante blu alimentare, che ne consente una facile eliminazione dopo il test. Utilizzo: -identificare la superficie da campionare, eventualmente utilizzando un delimitatore -rimuovere il tampone dalla confezione -rimuovere il tappino dalla provetta ed immergere il tampone fino a bagnarne completamente la testa nella soluzione blu -premere la testa del tampone sui bordi della provetta per rimuovere l eccesso -campionare la superficie interessata con il tampone umidificato -inserire il tampone nella provetta ed agitarlo per disperdere quanto recuperato -ripetere il campionamento -inserire il tampone nella provetta e spezzare lo stelo al punto di rottura -richiudere con il tappino e conservare per l analisi. Il campione così ottenuto può essere sottoposto a test dopo mescolamento, utilizzando i kit ELISA o Gluten Flow Through presentati di seguito. Il Limit of Detection (LOD), espresso in PPM (parti per milione o mg/kg) dipenderà poi dalla tecnica utilizzata per l'analisi del campione GLUTEN FLOW-THROUGH (GFT) TEST RAPIDO Kit unico, rapido e sensibile, utilizzabile per materie prime, alimenti, prodotti finiti e superfici, il test immunoenzimatico Gluten Flow-Through è stato formulato per rispondere in particolare alle esigenze di chi non ha un laboratorio attrezzato o di chi effettua un numero limitato di test. I risultati si ottengono entro 20 minuti, determinando valori di glutine di PPM (1 PPM nel caso dei tamponcini), in pochi semplici passaggi: preparazione del campione, estrazione, diluizione e test finale. Riassumendo, un piccolo campione viene estratto con la specifica soluzione fornita. L estratto viene quindi diluito e versato nell apposito spazio sulla cartuccia, dove viene lentamente assorbito. Il glutine eventualmente presente nel campione viene poi evidenziato utilizzando una soluzione di visualizzazione: il campione positivo formerà uno spot rosa, confrontabile con un controllo. 1-Preparazione del campione Si parte da 0,35 ± 0,02 g di campione. Per l'analisi delle superfici, si potrà testare direttamente 1 ml della soluzione proveniente dall'ess Kit dopo campionamento ed andare direttamente al punto 4 visto di seguito (assorbimento, test finale) Pagina 2 di 6

3 Polveri fini, farine, impasti fluidi e prodotti liquidi possono essere testati tal quali. Per alimenti consistenti, sarà necessario un processo di omogeneizzazione, per ottenere un' estrazione ottimale. Birra e vino non necessitano di estrazione, possono essere direttamente diluiti (passaggio 3) 2-Estrazione -Mescolare accuratamente le soluzioni incluse nel kit. Se la soluzione gialla di estrazione non è perfettamente lilmpida, riscaldarla leggermente in bagnetto termostatato -Inserire il campione nella provetta di estrazione utilizzando il cucchiaino in dotazione o altro strumento -tappare la provetta e mescolare con vortex per almeno 1 min -lasciare ferma la provetta per almeno 2 min per consentire l estrazione del glutine. Alcuni campioni sono particolarmente difficili da estrarre (ad es: briciole secche di pane): procedere allora al riscaldamento per min, agitando ogni tanto. -mescolare nuovamente con vortex la provetta di estrazione per almeno 1 min -attendere la separazione di uno strato limpido al di sopra del campione, corrispondente all estratto, o facililtare la separazione centrifugando a 2000g per 5 min. -rimuovere accuratamente con una pipetta l eventuale strato di grasso formatosi sulla superficie 3-Diluizione -con una pipetta, aspirare una parte dell estratto ed aggiungerne 7 gocce nella provetta di Liquido Diluente. -mescolare leggermente, ottenendo così una soluzione giallo pallido 4-Assorbimento e test finale -Rimuovere la pellicola dalla cartuccia e versare il contenuto della provetta di Liquido Diluente (o la soluzione proveniente dall ESS kit) nell area test centrale -lasciare assorbire per 3-5 min (6-7 min in caso di campioni particolarmente viscosi) -pulire ed asciugare bene la cartuccia con il pad assorbente -lentamente, versare la Soluzione di Visualizzazione rosa nell area test -lasciare assorbire per 3-5 min, quindi leggere i risultati entro min. 5-Interpretazione dei risultati Perché il test dia valido, nella parte destra dell area test dovrà sempre evidenziarsi lo spot rosa di controllo. Uno spot rosa chiaramente visibile nella parte sinistra indica la presenza di mg/kg di glutine (1-2 mg/kg o più in birra o vino; meno di 0.5 mg/kg per l ESS kit). Più intensa sarà la colorazione, maggiore la quantità di glutine presente nel campione. Pagina 3 di 6

4 Campione negativo campione positivo campione positivo GLUTEN-CHECK ELISA La tecnica ELISA utilizza anticorpi monoclonali di topo per riconoscere le proteine del glutine (marker: ω-gliadina del grano). La metodica immunoenzimatica a "sandwich", sviluppata inizialmente da Skerrit & Hill, è ben standardizzata, flessibile ed utilizzabile per il monitoraggio di materie prime, prodotti finiti o superfici. Il range del saggio è compreso tra 5 e 100 PPM di glutine, con LOD 1 PPM. Qui di seguito schematizziamo le fasi della metodica: Si utilizzano piastre a micro pozzetti sulla cui superficie vengono fatti aderire gli specifici anticorpi monoclonali La gliadina piastra presente negli estratti alcolici del campione si lega agli anticorpi sulla Un secondo anticorpo, collegato ad un enzima HRP, si lega alla gliadina Il substrato TMB sviluppa un colore blu in presenza dell enzima HRP In parallelo con i campioni da analizzare, vengono sottoposti a test degli standard a quantità nota di glutine (5, 10, 25, 50, 110 PPM), che consentono di elaborare una curva di riferimento. Pagina 4 di 6

5 Prima di essere sottoposti a test ELISA, i campioni vanno preparati, estratti e diluiti. 1-Preparazione del campione Polveri fini, farine, impasti fluidi e prodotti liquidi possono essere direttamente estratti. Per alimenti consistenti, sarà necessario un processo di omogeneizzazione, per ottenere un' estrazione ottimale. La soluzione proveniente dall ESS kit dopo campionamento potrà invece essere testata direttamente con ELISA o eventualmente diluita. 2-Estrazione -preparare in provetta 1 parte di campione + 9 parti di Soluzione di Estrazione -agitare vigorosamente per almeno 2 min fino ad ottenere una sospensione ottimale -porre in bagnetto termostatato a 55 C per 45 min -agitare vigorosamente per qualche secondo durante l estrazione e per 2 min al termine -centrifugare a 500 g per 15 min o, in alternativa, lasciare fermo per 30 min fino ad osservare uno strato limpido al di sopra del campione. -se compare uno strato grasso, rimuoverlo con cautela 3-Diluizione Preparare una diluizione 1:10 dell estratto, aggiungendo 0.1 ml a 0.9 ml di Soluzione di Diluizione 1X. La diluizione 1:10 è da preferire per i campioni che si ritengono gluten free o Very low gluten. Se si suppone che il contenuto di glutine sia elevato, si può procedere anche con ulteriori diluizioni 1:10 o diluizione 1:100. Gli estratti così diluiti sono ora pronti per essere sottoposti al test elisa 4-Allestimento del test Preparare un profilo dei pozzetti, come nell esempio qui a fianco. Dovranno essere presenti, in duplicato: -Punti per curva standard: S0: diluente 1X; S1-S5: standards glutine -Controlli del Kit Low e Mid -Campioni -Seguendo il profilo, mettere 100 µl in ogni pozzetto -Agitare leggermente la piastra, coprirla ed incubare a temperatura ambiente per 40 min -Lavare i pozzetti per 3 volte con Soluzione di Lavaggio 1X -Rimuovere attentamente l eccesso di liquido ponendo la piastra a testa in giù -aggiungere 100 µl di anticorpo anti-gliadina con HRP (reagente verde) -coprire la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 40 min -lavare per 4 volte con Soluzione di Lavaggio 1X e rimuovere come sopra Pagina 5 di 6

6 -aggiungere 100 µl di Substrato TMB -coprire la piastra ed incubare al buio per 15 min, fino allo svilupparsi di una colorazione blu -aggiungere 100 µl di Stop Solution: il colore vira da blu a giallo -agitare leggermente la piastra, quindi procedere alla lettura 5- Lettura dei risultati Si procede alla lettura con spettrofotometro a 450 nm, entro 60 min. Le fasi di lavaggio e lettura delle piastre possono essere automatizzate utilizzando i lettori ELISA in commercio. Diversi software consentono di impostare direttamente la curva di riferimento, ottenendo poi i valori per i campioni. Il sito è stato completamente rinnovato. Con una semplice registrazione potrete visionare i nostri LISTINI PREZZO sempre aggiornati. I clienti registrati avranno anche la possibilità di godere di speciali offerte promozionali. Siamo sempre a disposizione per offerte personalizzate. Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Telefono Tel/fax: info@kairosafe.it web: Pagina 6 di 6