MAGGIO 2007 VOLUME 3, NUMERO 3
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- Beatrice Rizzi
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1 MAGGIO 2007 VOLUME 3, NUMERO 3 Riceviamo occasionalmente richieste per indicatori biologici con una gamma di valori D accettabili molto specifica e/o ristretta. Di recente un cliente ha richiesto un indicatore biologico adatto ai processi di sterilizzazione a gas (EZTest Gas) con un valore D che non superasse i 3.5 minuti. Da un controllo dell inventario si è visto che l unico EZTest gas disponibile per la spedizione immediata aveva un valore D pari a 3.6 minuti, (il valore D non-arrotondato per questo lotto era minuti). Il cliente ha rifiutato di ricevere quel lotto ed ha chiesto un nuovo lotto che corrispondesse esattamente al valore D richiesto. Qual è la differenza nel D-value Per poter dire se un indicatore biologico per EtO con D-value = 3.5 minuti è accettabile in un determinato ciclo, mentre qualunque valore al di sopra di 3.5 minuti è inaccettabile, si devono considerare i dati della frazione negativa del valore D di alcuni lotti di EZTest Gas, presi come esempio e presentati in tabella 1. 1
2 I valori sono espressi come il numero di unità negative sul numero di unità esposte nella quale viene evidenziato il Kill Time empirico. Da un'occhiata rapida, i dati presenti in tabella 1 sembrano differenti tra di loro, ma sono realmente differenti? Queste sottili differenze nei dati della frazione negativa sono rilevabili soltanto usando il Bier Vessel (BIER) che fornisce un minuzioso andamento di flusso di mortalità. Il termine andamento di flusso è correttamente applicabile al BIER perchè è costituito da un insieme di stadi di esposizione e stadi di stan by in un intervallo di tempo molto ristretto. Gli stadi di BIER sono: 1. Caricamento del gas EtO da 0 a 600 mg/l in 60 secondi o meno. 2. Mantenimento della concentrazione del gas entro un range di +/- 30mg/L. 3. Controllo della temperatura di esposizione con un range di +/- 1ºC. 4. Mantenimento dell'umidità relativa a +/- il 10%. 5. Raggiungimento di una pressione sub atmosferica (kpa ~0.7) in un arco di tempo brevissimo (+/-60 secondi). Di conseguenza, con questo tipo di prestazioni di BIER Vessell, la letalità alla quale vengono esposti gli indicatori biologici è molto più succinta e repentina rispetto allo sterilizzatore normale. La ISO 11135:1994, appendice A dichiara che, durante l'esposizione del gas in uno sterilizzatore vuoto, è ammissibile una variazione di temperatura di +/- 3 C da quella prestabilita. Una volta caricato il prodotto invece, deve essere specificata la temperatura minima di inizio, e l intervallo di temperatura osservato durante il ciclo in qualsiasi parte del carico non dovrebbe eccedere i 10ºC. Causa le variazioni concesse per i parametri critici in un normale ciclo usato in produzione, normalmente le condizioni costanti non vengono praticamente mai raggiunte per i seguenti motivi: 2
3 1. le molecole residue dell'aria cercano di uscire dal prodotto e dal materiale da imballaggio, mentre 2. le molecole della miscela di ossido di etilene e azoto tentano di entrare nel prodotto e nel materiale da imballaggio; 3. la penetrazione del calore e le posizioni più fredde del prodotto avvertono un aumento nella temperatura; 4. man mano che la temperatura del prodotto aumenta, le molecole di acqua vengono eliminate e si riduce l'umidità relativa nella posizione interessata; 5. le molecole di acqua vengono assorbite dal materiale d imballaggio, che funge da concorrente al prodotto stesso. Tutte queste molecole in movimento competono per raggiungere un equilibrio all interno dello sterilizzatore. L aumento di temperatura del prodotto agisce direttamente sull agitazione molecolare, mentre le variazioni di pressione hanno effetto sulla direzione del movimento molecolare. I parametri critici sono dinamici e costantemente oscillanti, tali da poterli definire piuttosto come condizioni caotiche nelle quali viene fornita la letalità. Per raggiungere un pieno equilibrio questo stato caotico necessita di tempi lunghi e può anche non essere mai realizzato nei termini di tempo di un ciclo tipico. Fino a quando la temperatura non viene stabilizzata, non può essere raggiunto nessun equilibrio molecolare. Le spore rispondono alle circostanze esatte della posizione nella quale l IB si trova. Diversamente dalla sonda per la misurazione dei parametri fisici, che misura un solo parametro per volta ed in un solo punto del sterilizzatore, le spore dell IB indicano la mortalità generale esistente nell intero carico del prodotto ed in circostanze dinamiche citate sopra. Processo di mortalità nello sterilizzatore Contrariamente al cambiamento repentino di circa 60 secondi tra un processo e l altro che si ha in un BIER Vessell, la fase della carica del gas fino al raggiungimento della concentrazione adatta in un sterilizzatore normale può durare dai 10 ai 40 minuti. Il raggiungimento successivo della temperatura di esposizione all'interno del carico può durare ancora di più; nel frattempo, si da l avvio al processo di mortalità delle spore presenti negli IB trattati, anche se ancora non sono stati raggiunti gli standard di tutti i parametri richiesti nel processo di eposizione. Il tempo di scarico d aria in un processo può essere molto lungo a seconda del tipo d imballaggio. Indi per cui le differenze di 3
4 tempo per il raggiungimento delle condizioni d esposizione standard in uno sterilizzatore normale in rispetto a quello ottenuto nel BIER Vessell può essere causa di una lieve differenza nella resistenza degli IB certificata da quella effettiva nello sterilizzatore usato nel processo produttivo, come dimostrato nella Tabella 1. La letalità accumulata in uno sterilizzatore normale solamente durante le fasi del carico del gas e di scarico dell aria, spesso può essere sufficiente per inattivare le spore dell IB. Ciò è stato dimostrato in uno studio condotto da Mosley ed altri (2002) nella quale, durante un processo di convalida, vari prodotti medici sono stati esposti a zero minuti. Usando entrambe le tipologie di indicatori biologici, le strip e i self-contained, il processo di mortalità avutosi nelle esposizioni a zero-minuti è risultato di pochissime unità positive. Qual è allora la funzione di un indicatore biologico se la maggior parte delle unità di prova vengono rese inattive soltanto nelle fasi di carico e scarico del gas in un ciclo standard? Quando gli Indicatori Biologici vengono usati nella fase di convalida di un ciclo standard, si possono seguire due tipi di approccio; il metodo di combinazione BI/bioburden e il metodo dell overkill, (riferito anche come metodo di metà ciclo). La maggior parte dei clienti usa il metodo overkill. La convalida di Overkill prevede un processo di sterilizzazione molto più lungo del ciclo necessario per la sola inattivazione degli IB. Questo extra tempo è equiparato al raggiungimento dello Sterility Assurance Level (SAL). Di conseguenza, se un indicatore biologico risulta positivo dopo un tale ciclo, allora significa che tutta la letalità extra fornita con il processo è stata inutile ed il ciclo deve essere considerato totalmente fallito. Quindi, gli IB usati come controllo di routine sono ottimi mezzi per rilevare il totale fallimento di un processo dovuto a qualche guasto; per prassi tali guasti accadono veramente. Attualmente, non ci sono strumenti fisici disponibili che possono verificare l avvenuta sterilizzazione nei punti più critici all interno del carico dello sterilizzatore. Come precedentemente dichiarato, le spore batteriche dell indicatore biologico integrano efficacemente tutti i parametri critici presenti durante il ciclo e rispondono alle sollecitazioni esistenti nella posizione in cui l IB è disposto, cioè all interno del carico. 4
5 Un esempio di un fallimento catastrofico della sterilizzazione può essere l umidità inadeguata nel punto dove l IB è alloggiato nel carico. Quando l'umidità è troppo bassa, il 90% o più di letalità attesa può essere persa. Quindi, l improvvisa positività di un IB in un ciclo standard previamente validato non è dovuta all uso di un indicatore biologico con un valore D di alcuni secondi diverso rispetto a quello stabilito durante il processo di validazione, ma è dovuta all alterazione di uno dei parametri critici del processo che porta alla sopravvivenza delle spore. Come illustrato sopra, il valore D sul certificato di analisi (CofA) è una stima accurata di resistenza a determinate condizioni parametriche riportate anch esse nel certificato. Effettivamente il valore D ha molta importanza durante il test di validazione, ma, durante un normale ciclo di produzione non dovrebbe essere la causa determinante della positività degli indicatori biologici. La differenza del D-value Come menzionato sopra, la determinazione del valore D è condotta in un BIER Vessell con parametri del ciclo ben determinati e controllati. Entrambi, la USP e la ISO dichiarano che quando un fornitore conferma il valore D segnalato sul CofA, i risultati ottenuti sono accettabili se cadono nel range +/- di 20% rispetto alla valutazione originale. Quindi, anche se le prestazioni offerte da un BIER sono precise, è riconosciuto che ci possono essere delle piccole differenze nei dati di ritest e queste differenze sono previste e accettate dalle norme stesse. Dalla tabella 1, il valore D medio è 3.6 minuti. Usando il parametro di variazione concesso del +/- 20%, i valori della conferma del valore D citato nel certificato considerati conformi sono tra minuti. Per cui, per quanto riguarda il parametro della resistenza, i suddetti lotti citati sono assolutamente tutti validi in quanto tutti i valori D sono compresi in un intervallo compreso tra di +/-11% del valore dichiarato pari a 3.6 min. Ciò nonostante, probabilmente per timore del risultato falsamente positivo, incontriamo clienti che rifiutano di usare un IB con un valore D persino qualche secondo superiore al loro valore massimo richiesto. Recentemente un cliente ha rifiutato il lotto di EZTest Gas con un valore D di minuti perchè il valore D ha ecceduto la specifica massima del cliente (3.5 minuti) di minuti (3.3 secondi). Sono stati valutati e processati 225 indicatori biologici e attraverso i dati ottenuti dal calcolo della frazione negativa sono stati misurati EMPIRICAMENTE i tempi di sopravvivenza (survival time) ed i tempi di uccisione (kill 5
6 time) delle spore. Il valore D è risultato essere di minuti. Su 225 indicatori biologici, 142 non hanno avuto alcun sviluppo (cioè 142 repliche negative su 225 esposti) e il valore D non-arrotondato è risultato essere , mentre il valore arrotondato segnalato sul CofA è risultato essere di 3.5 minuti. Paragone fra Survival e Kill Time Calcoloto vs. quello Empirico Il Kill time viene calcolato attraverso questa espressione: Kill Time (minuti) = (Log 10 popolazione + 4) X (valore D) Il Survival Time viene calcolato attraverso questa espressione: Survival Time (minuti) = (Log 10 popolazione - 2) X (valore D) Anche se la ISO :2006 richiede al fornitore di includere nel Certificato di Analisi il Survival Time e il Kill Time, in realtà, questi numeri rappresentano una importanza relativa in termini di riduzione logaritmica del numero di spore (SLR). Per illustrare meglio questo concetto, abbiamo considerato le prestazioni di resistenza dell EZTest Gas lotto B (vedere la tabella 1). Con il valore D definito come il tempo necessario, a precise condizioni, per ridurre la popolazione iniziale di spore di un logaritmo, per il lotto B è applicabile la seguente cinetica di letalità: 6
7 Con la popolazione 1.7 x 10^6 e il valore D = 3.5 minuti, il Survival Time calcolato per il lotto B è minuti ed il Kill Time calcolato è minuti. Bisogna ricordare che il Kill Time empirico per il lotto B è soltanto 28.0 minuti, una differenza di 7.81 minuti. Il motivo di discrepanza fra Kill Time empirico ed il Kill Time effettivo è quel +4 che compare nell'equazione del Kill Time. Come si può osservare nella Tabella 2, iniziando con una popolazione pari a 1.7x10^6 per IB, per ottenere tutte le unità di IB esposte negative sono necessari otto x SLR (riduzione logaritmica del numero di spore). Il +4 nell'equazione del Kill Time risulta in un tempo di esposizione necessario per ottenere 10 x SLR della popolazione iniziale. Questo livello di letalità e ben oltre a quello necessario per inattivare le spore dell IB. Come dichiarato precedentemente, il cliente ha rifiutato il valore D di 3.6 minuti (lotto C) perchè ha dichiarato che il Kill Time sarebbe stato troppo alto per il suo ciclo. Il Kill Time calcolato per il valore D = 3.5 minuti (lotto B) è minuti e questo lotto è stato considerato accettabile dal cliente. Notare dalla tabella 1 che se qualsiasi lotto di quelli elencati fosse stato esposto in un BIER ad esposizione di minuti, TUTTE LE unità di tutti i lotti risulterebbero negative, comprese quelle con un valore D = 4.0 minuti. Conclusione Le condizioni standard del BIER Vessell per gas EtO richiedono dei parametri specifici (il EO a 600 +/- 30 mg/l, 54 +/- 1ºC, RH di 10% +/- di 60). Inoltre, è richiesto che il raggiungimento di concentrazione del gas di EO e la successiva evacuazione dell'aria dall alloggiamento deve essere realizzato al massimo in 60 secondi. Le condizioni standard risultano così precise grazie all ottenimento di uno stato di equilibrio in grado di provvedere ad una letalità tale da poter notare anche le minime differenze in resistenza fra i diversi indicatori. In uno sterilizzatore normale queste minuscole differenze sono indistinguibili. Dobbiamo fare attenzione a non incorrere nell errore di richiedere valori troppo limitati dove tali fattori limitanti non possono essere verificati. Per controllare un ciclo di sterilizzazione già validato è erroneo pretendere indicatori biologici con una gamma di prestazioni troppo specifica e ristretta. 7
8 La comparsa inattesa delle unità di IB positive in un processo convalidato è raramente dovuto all uso di un indicatore biologico con un valore D un po più alto di quello desiderato. La vera causa della comparsa di unità di prova positive è soprattutto la perdita o alterazione di uno dei parametri chimico-fisici critici verificatisi durante il ciclo di sterilizzazione e successiva significativa perdita della letalità fornita. Una cosa importantissima da ricordare è che il valore D che compare su un certificato di analisi è una valutazione esatta di resistenza soltanto per un insieme specifico di parametri degli stati di esposizione. Può avere un effetto durante lo sviluppo del ciclo, ma non deve essere considerato come unica causa di positività di un eventuale indicatore biologico durante un normale e completo ciclo di sterilizzazione. 8
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