VARIABILITA IN PATOLOGIA CLINICA

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1 Cenni di Patologia Clinica Dott.ssa Samantha Messina C.I. Patologia clinica e diagnostica per immagini Anno accademico 2011/2012 II anno, II semestre CdL Fisioterapia, Università degli Studi di Cassino VARIABILITA IN PATOLOGIA CLINICA 1

2 CORRETTA INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI POSIZIONE DEL RISULTATO RELATIVAMENTE AI VALORI DI RIFERIMENTO VARIABILITA DEL RISULTATO 2 CAUSE DELLA VARIABILITA VARIABILITA TOTALE VARIABILITA ANALITICA VARIABILITA BIOLOGICA PRE-ANALITICA ANALITICA POST-ANALITICA INTRAINDIVIDUALE INTERINDIVIDUALE 2

3 LA VARIABILITA è uno dei problemi centrali nell utilizzo dei dati di laboratorio da parte del clinico VARIABILITA BIOLOGICA VARIABILITA INTRA-INDIVIDUALE: a carico dello stesso individuo VARIABILITA INTER-INDIVIDUALE: fra diversi individui 3

4 PRINCIPALI FONTI DELLA VARIABILITA INTRA-INDIVIDUALE Ritmi circadiani Variazioni stagionali Dieta Periodo mestruale Gravidanza PRINCIPALI FONTI DELLA VARIABILITA INTER-INDIVIDUALE Sesso Età Razza Massa corporea Fumo Alcool Farmaci 4

5 VARIABILITA ANALITICA pre-analitica post-analitica analitica VARIABILITA NELLA FASE PRE-ANALITICA Modalità di raccolta e conservazione del campione attribuzione del campione al paziente idoneità del materiale accorgimenti per stabilizzare gli analiti 5

6 VARIABILITA NELLA FASE ANALITICA Procedure standardizzate controlli interni verifica di risultati con valori elevati VARIABILITA NELLA FASE POST-ANALITICA Lettura comprensibile del referto consegna referto in tempi brevi 6

7 VARIABILITA ANALITICA ASSOCIATA A PRELIEVO VENOSO PRELIEVO tecnica sottovuoto principio della siringa Emolisi in vitro EMOLISI: colorazione rossa del plasma o del siero dopo centrifugazione MAGGIORI CAUSE DI EMOLISI 1) Ago di piccolo calibro 2) Presenza di disinfettante sul sito del prelievo 3) Prelievo in zone edematose 4) Aspirazione forzata in siringa 5) Forte pressione nel travasare il sangue in provetta 6) Violento mescolamento del campione di sangue intero 7) Centrifugazione del sangue non sufficientemente coagulato 7

8 SCELTA E UTILIZZO DEGLI ANTICOAGULANTI La maggior parte delle analisi è effettuata su siero Analisi su sangue intero parti figurate del sangue analisi singole componenti del plasma Il plasma contiene delle sostanze che non sono presenti nel siero o che sono presenti in concentrazioni differenti Il plasma è da reputare il liquido che più si avvicina alla composizione reale del sangue circolante ANTICOAGULANTI sangue fluido (scoagulazione) Plasma Parte corpuscolata Il non corretto utilizzo degli anticoagulanti è una delle più frequenti cause di errore preanalitico CHELANTI DEL CALCIO EDTA SALI BISODICO O TRIPOTASSICO CITRATO DI SODIO OSSALATO DI AMMONIO E DI POTASSIO 8

9 SISTEMA DELLA COAGULAZIONE ANTITROMBINA III EPARINA Mucopolisaccaride acido il cui peso molecolare varia nelle diverse preparazioni IN COMMERCIO ESISTE SOTTO FORMA DI SALI K, Na ma viene abitualmente usato il SALE DI Li E AMMONIO LEGA ANTITROMBINA III COMPLESSO EPARINA - ANTITROMBINA III - TROMBINA INATTIVO NON IMPIEGATO: STUDI MORFOLOGICI DELLE CELLULE EMATICHE TEST DI COAGULAZIONE TEST DI ATTIVAZIONE DELLA TROMBINA DOSAGGIO DEL LITIO (o AMMONIO) PLASMATICO 9

10 TRASPORTO DEL PRELIEVO AL LABORATORIO E molto importante che i tempi non siano eccessivi perché influenzano la stabilità del materiale e quindi l accuratezza della misura Entro 45 minuti dal prelievo procedere alla centrifugazione e separazione dei campioni entro 1h Test su fattori della coagulazione più brevi Esame emocromocitometrico VES non oltre 24h entro 7h tempi molto CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI IN LABORATORIO Per diversi motivi vi è la necessità in laboratorio di conservare per tempi più o meno lunghi i campioni da analizzare o già analizzati RAFFREDDAMENTO (4 C) conservazione dei campioni per 2-3 gg, al massimo una settimana CONGELAMENTO (-20 C / -80 C) conservazione per tempi più lunghi. Il metodo migliore è l conservazione di piccole aliquote congelate rapidamente in azoto liquido e conservate a -80 C 10

11 Enzimologia clinica Scopo valutare la concentrazione degli enzimi nei fluidi corporei a fini diagnostici Enzimi: catalizzatori biologici aumentano la velocità di una reazione senza alterarne la stechiometria 11

12 Cinetica Enzimatica E + S ES EP E + P Enzimi a substrato singolo Es. Amilasi, lipasi Enzimi a substrati multipli Velocità di reazione Influenzata da concentrazione di substrato concentrazione di enzima temperatura ph cofattori coenzimi attivatori inibitori 12

13 Legge di Michaelis-Menten Basse concentrazioni Reazione di primo ordine Alte concentrazioni Reazione di ordine 0 Costante di Michaelis- Menten è la concentrazione di substrato che corrisponde ad una velocità di reazione pari al 50% del massimo Enzimi: specificità di substrato 13

14 Localizzazione Enzimatica Liberi nelle cellule di diversi tessuti ed organi Confinati in particolari strutture all interno delle cellule stesse In un determinato tessuto od organo specifico (enzimi organo-specifici) Gli enzimi nel sangue spesso non hanno un ruolo fisiologico presenti anche in situazioni normali invecchiamento fisiologico turnover cellulare eliminati da sistema reticolo endoteliale Rene (es. amilasi) livello di attività normale nel siero è funzione di velocità di rilascio clearance emivita 2 ore 170 ore 14

15 Aumento degli enzimi nel plasma: necrosi o danno cellulare citolisi fuoriuscita enzimi Fattori tossici Ischemia aumentato turnover cellulare Accrescimento Rigenerazione cellulare Neoplasie Gravidanza Induzione enzimatica Farmaci (es. Fenobarbital, alcool) Patologie (colestasi) Il quadro dell aumento può essere sufficientemente tipico da avere un valore diagnostico nel caso di un particolare organo Liberazione enzimi nel circolo la velocità di comparsa nel sangue dipende da passaggio nel sangue diretto attraverso il circolo linfatico localizzazione intracellulare citoplasmatica mitocondriale 15

16 siero sangue plasma orine versamenti Fluidi utilizzati fluidi extracellulari usi patologie epatiche (Transaminasi ALT e AST, bilirubina) patologie cardiache (creatin chinasi totale CPK) patologie muscolari patologie pancreatiche patologie autoimmuni (ELISA e RIA) 16

17 Ematochimica Contrazione muscolare Lo scorrimento reciproco delle molecole di actina e miosina di un sarcomero richiede l idrolisi di molte molecole di ATP Quale è la fonte? La molecola FOSFOCREATINA (1) Fosfocreatina +ADP Creatina + ATP (creatin cinasi) (2) 2ADP ATP +AMP (miocinasi) Il metabolismo energetico delle cellule muscolari è prevalentemente ossidativo 17

18 Contrazione muscolare Fonti energetiche: acidi grassi e corpi chetonici oppure mioglobina ha una affinità per O 2 >>della emoglobina ciò vuol dire che rilascia O 2 solo quando la pressione parziale scende a livelli molto bassi (5 mmhg) Durante uno sforzo intenso e prolungato i muscoli consumano glicogeno > si libera glucosio che viene attivamente metabolizzato nella glicolisi In queste condizioni l eccesso di NADH e H + viene riossidato trasferendo H + all acido piruvico > acido lattico > entra in circolo L acido lattico viene prodotto in quantità e velocità maggiore di quanto non possa essere riversato in circolo > accumula nelle cellule muscolari > senso di fatica > CRAMPI Contrazione muscolare SFORZO FISICO INTENSO E DI BREVE DURATA (100m; nuoto; sollevamento pesi) ESERCIZIO ANAEROBIO Le cellule muscolari sono isolate dal resto del corpo e utilizzano come fonti energetiche proprie 1. fosfocreatina 2. glicogeno 3. mioglobina (seguendo questa priorità) SFORZO FISICO PROLUNGATO (maratona) ESERCIZIO AEROBIO Esiste una cooperazione tra muscolo, fegato e tessuto adiposo Fonti energetiche: glicogeno epatico e acidi grassi (scorte di trigliceridi del tessuto adiposo) 18

19 Gli esami ematochimici L aumento dei livelli sierici della creatinchinasi (CK) (valori normali: < 130 U/l) è un indice di danno muscolare più sensibile dell aumento di qualunque altro enzima sierico La Lo sforzo muscolare normale può innalzare i livelli di CK fino a valori da tre a otto volte superiori a quelli normali (variabilità interindividuale) Gli esami ematochimici (CK) La creatinchinasi (CK) è un enzima prodotto da varie specie tissutali (muscoli e cervello) che appartiene alla classe delle transferasi La sua funzione consiste nel catalizzare la trasformazione della creatina a fosfocreatina, consumando ATP e liberando energia chimica Catalizza la seguente reazione: ATP + creatina = ADP + fosfocreatina + H+ 19

20 Gli esami ematochimici (CK) La CK raggiunge un picco diverse ore dopo lo sforzo, e i suoi livelli rimangono massimali per h, in parte anche a causa della lunga emivita plasmatica dell enzima (da 38 a 118 h) Di conseguenza, bisogna evitare di eseguire il dosaggio della CK a meno di 48 h di distanza da un esercizio muscolare vigoroso Gli esami ematochimici (CK) I livelli dell enzima aumentano anche in seguito al danno muscolare provocato dalla compressione prolungata, come può accadere nelle persone anziane costrette all immobilità su una superficie rigida 20

21 Gli esami ematochimici (CK) Aumenti lievi dei livelli enzimatici (< 4 volte il limite superiore) si verificano: > nelle persone sane in seguito a traumi muscolari minori (iniezioni intramuscolari o elettromiografia ad ago) > negli individui affetti da alcune malattie croniche delle cellule delle corna anteriori (sclerosi laterale amiotrofica) Gli esami ematochimici (CK) Aumenti di entità moderata o notevole si osservano nelle miopatie infiammatorie (i.e. polimiosite, dermatomiosite) in seguito a condizioni che causano necrosi muscolare (i.e.miopatia ipokaliemica). 21

22 Gli esami ematochimici (CK) Gli isoenzimi della CK comprendono: CK-MM (presente principalmente nei muscoli scheletrici) CK-MB (nel muscolo cardiaco) CK-BB (nel tessuto cerebrale) Gli esami ematochimici (CK) Utilizzo: Diagnosi infarto miocardico acuto e reinfarto (CK-MB) Diagnosi precoce dermatomiosite e malattie muscolo-scheletriche che non hanno origine neurogena (Duchenne) (CK totale) 22

23 NECROSI CELLULARE - EMATOCHIMICA La necrosi cellulare può essere evidenziata dal punto di vista delle indagini ematochimiche in base a segni diretti e indiretti Possiamo considerare come manifestazioni dirette dei processi citolesivi la liberazione dai vari compartimenti cellulari (citosol, lisosomi, mitocondri) di enzimi nel torrente circolatorio Con il loro dosaggi non solo si mette in evidenza la presenza di un processo necrotico, ma si può risalire alla sede dove tale processo si è verificato Esistono quadri enzimatici tipici che forniscono al laboratorio un utile strumento non solo per individuare il danno tissutale, ma anche per monitorarne la sua evoluzione. Gli enzimi segnalano il danno abbastanza precocemente, alcune volte le loro variazioni si manifestano poche ore dopo l intervento dello stimolo lesivo. NECROSI CELLULARE - EMATOCHIMICA Entità di lesione Ci sono due aspetti quantitativi della lesione cellulare che vanno considerati: la gravità e l estensione La gravità va da una lesione reversibile (es. aumento della permeabilità di membrana) ad una lesione irreversibile (come la necrosi) L estensione del danno è invece data dal numero di cellule che sono coinvolte Specificità tissutale dei marker di lesione Un marker per essere specifico deve provenire da un determinato tessuto e solo da quello, in questo caso il suo valore diagnostico sarà elevato. Questo requisito è caratteristico di poche sostanze, ma l origine multitissuale può essere superata mediante l associazione di più marker, o attraverso l utilizzo degli isoenzimi (proteine che catalizzano la stessa reazione, ma differiscono per particolarità strutturali) 23

24 NECROSI CELLULARE - EMATOCHIMICA Come marker di lesione si utilizzano: Sostanze normalmente non presenti nelle cellule (e quindi nemmeno in circolo) Sostanze normalmente presenti, ma che presentano variazioni quantitative I fattori che regolano la fuoriuscita dei marcatori dalla cellula e la loro permanenza nei liquidi organici sono i seguenti: Gradiente di concentrazione Peso molecolare Localizzazione intracellulare Tempo di attraversamento del plasma Catabolismo Vie di eliminazione 24

25 MARKERS FINESTRA DIAGNOSTICA I marker che entrano rapidamente nei liquidi biologici tendono ad avere una finestra diagnostica che inizia precocemente rispetto all inizio della lesione; al contrario si comportano quelli che entrano tardivamente e lentamente in circolo Le applicazioni cliniche sono molto importanti: La precocità della diagnosi è legata all utilizzo dei marker precoci Il follow up di una patologia è legata all utilizzo dei marker tardivi 25

26 MARKERS FINESTRA DIAGNOSTICA La finestra diagnostica può essere definita come: l intervallo di tempo durante il quale la misurazione della concentrazione di un marker nei liquidi biologici consente di dimostrare la presenza di una lesione d organo o sistema La concentrazione del marker deve essere al di sopra di un valore critico scelto (livello critico) per dare significato diagnostico valido al marker in questione. Alcune possibili cause di lesioni cellulari che provocano la fuoriuscita di sostanze sono: Presenza di microrganismi patogeni Ingestione di/o contatto con farmaci e tossici Lesioni da agenti fisici Neoplasie 26

27 MARCATORI DI NECROSI MIOCARDICA L infarto miocardio acuto (IMA), la principale causa di morte nei Paesi occidentali è una necrosi del tessuto muscolare del cuore, (miocardio) causata da un periodo di ischemia prolungata L ischemia è una riduzione del flusso sanguigno che comporta una diminuzione dell apporto di ossigeno e conseguente transitoria alterazione della funzionalità meccanica, biochimica, elettrica del tessuto miocardio Cause MARCATORI DI NECROSI MIOCARDICA Generalmente si riconosce la presenza di un restringimento fisso nelle arterie coronarie che provoca una diminuzione del flusso sanguigno di oltre il 75%; in tal modo un aumento delle richieste di sangue da parte del miocardio, come accade durante uno sforzo, non può essere soddisfatto (è il meccanismo di base dell angina pectoris) Il restringimento è causato soprattutto dalla formazione di una placca aterosclerotica nella parete delle arterie coronaria dovuta alla deposizione di lipidi (colesterolo) 27

28 Cause MARCATORI DI NECROSI MIOCARDICA La placca aterosclerotica può andare incontro a brusche modificazioni (i.e. ulcerazioni o piccole emorragie al suo interno) > contrazione dell arteria e/o formazione di un trombo Il trombo è un tappo di piastrine e fibrine che chiude il vaso impedendo il flusso di sangue a valle. Questo processo è alla base sia dell angina instabile sia dell IMA in cui la persistenza dell ischemia prolungata causa un danno irreversibile alle cellule che vanno incontro a necrosi e rilasciano in circolo delle sostanze utilizzate a fini diagnostici, prognostici e di monitoraggio. Patologie cardiache Enzimi e proteine del cuore 28

29 Patologie cardiache Cosa si dosa - Marcatori di necrosi miocardica -BNP - CK - LDH - Mioglobina - Troponina - PCR Patologie cardiache Dosaggio del peptide natriuretico tipo B (BNP) Il peptide natriuretico di tipo B (BNP) è un neurormone prodotto prevalentemente dal ventricolo cardiaco Il BNP è rilasciato dal cuore come risposta alla distensione ventricolare determinata dall espansione della volemia o da un sovraccarico di pressione Il BNP del plasma aumenta con la gravità dell insufficienza cardiaca Esso è un marcatore ormonale eccellente della disfunzione ventricolare sistolica o diastolica 29

30 Patologie cardiache Dosaggio del peptide natriuretico tipo B Scopo: aiutare nella diagnosi di insufficienza cardiaca Valori di riferimento: vn < 100 pg/ml Reperti normali: Le concentrazioni nel sangue superiori a 100 pg/ml sono un fattore accurato di previsione dell insufficienza cardiaca CREATINCHINASI Patologie cardiache La creatinchinasi (CK) è un enzima prodotto da varie specie tissutali (muscoli e cervello) che appartiene alla classe delle transferasi La sua funzione consiste nel catalizzare la trasformazione della creatina a fosfocreatina, consumando ATP e liberando energia chimica Catalizza la seguente reazione: ATP + creatina = ADP + fosfocreatina + H+ 30

31 Patologie cardiache CREATINCHINASI L aumento dei livelli sierici della creatinchinasi (CK) (valori normali: < 130 U/l) è un indice di danno muscolare più sensibile dell aumento di qualunque altro enzima sierico Lo sforzo muscolare normale può innalzare i livelli di CK fino a valori da tre a otto volte superiori a quelli normali (variabilità interindividuale) Patologie cardiache CREATINCHINASI La CK raggiunge un picco diverse ore dopo lo sforzo, e i suoi livelli rimangono massimali per h, in parte anche a causa della lunga emivita plasmatica dell enzima (da 38 a 118 h) Di conseguenza, bisogna evitare di eseguire il dosaggio della CK a meno di 48 h di distanza da un esercizio muscolare vigoroso 31

32 Patologie cardiache CREATINCHINASI I livelli dell enzima aumentano anche in seguito al danno muscolare provocato dalla compressione prolungata, come può accadere nelle persone anziane costrette all immobilità su una superficie rigida Aumenti lievi dei livelli enzimatici (< 4 volte il limite superiore) si verificano: > nelle persone sane in seguito a traumi muscolari minori (iniezioni intramuscolari o elettromiografia ad ago) > negli individui affetti da alcune malattie croniche delle cellule delle corna anteriori (sclerosi laterale amiotrofica) Patologie cardiache CREATINCHINASI Gli isoenzimi della CK comprendono: CK-MM (presente principalmente nei muscoli scheletrici) CK-MB (nel muscolo cardiaco) CK-BB (nel tessuto cerebrale) 32

33 Patologie cardiache CREATINCHINASI Utilizzo: Diagnosi infarto miocardico acuto e reinfarto (CK-MB) Diagnosi precoce dermatomiosite e malattie muscolo-scheletriche che non hanno origine neurogena (Duchenne) (CK totale) Valori di riferimento: I valori della CK totale, determinati con metodica UV variano da U/L per gli uomini U/L per le donne Patologie cardiache CREATINCHINASI I livelli possono essere notevolmente più alti nelle persone muscolose 33

34 Patologie cardiache CREATINCHINASI Gli ambiti di normalità CK-BB non determinabile CK-MB < 5% CK-MM 90%-100% Reperti normali: La CK-MM costituisce il 99% della CK totale presente normalmente nel siero Un isoenzima CK-BB determinabile può indicare una diagnosi di lesione del tessuto cerebrale Livelli di CK-MB >5% della CK totale indicano un infarto del miocardio, specialmente se il rapporto tra lattato deidrogenasi ed isoenzima è >1 (LD invertita) Patologie cardiache LATTATO DEIDROGENASI (LDH) L Enzima catalizza la conversione reversibile dell acido lattico del muscolo in acido piruvico Poiché è presente in quasi tutti i tessuti dell organismo, il danno cellulare aumenta la LDH totale nel siero, limitando la utilità diagnostica della LDH E possibile dosare cinque isoenzimi specifici di tessuti (LDH1 ed LDH2 appaiono principalmente nel cuore) Evitare l emolisi perché provoca artefatti in quanto i globuli rossi contengono LDH1 34

35 Patologie cardiache LATTATO DEIDROGENASI (LDH) Scopo - aiutare nella diagnosi differenziale tra infarto del miocardio, infarto polmonare. - complementare i dati del dosaggio della CK > LDH invertita Proporzioni anormali di ogni enzima, nell IM acuto la concentrazione di LDH1 è >> di LDH2 tra 12 e 48 h dopo l insorgenza dei sintomi; quindi il rapporto è >1 L inversione della combinazione enzimatica anormale è tipica del danno miocardico ed è conosciuta come LDH invertita VALORI DI RIFERIMENTO LDH1 da 14-26% LDH2 da 29-39% LDH3 da 20-26% LDH4 da 8-16% LDH5 da 6-16% Patologie cardiache LATTATO DEIDROGENASI (LDH) 35

36 Patologie cardiache Proteine ed isoenzimi dopo infarto del miocardio Isoenzimi CK-MB: nel muscolo cardiaco ed in piccole quantità nel muscolo scheletrico Lattato deidrogenasi 1 e 2 (LDH1 e LDH2): in cuore, cervello, fegato, reni,muscoli scheletrici, globuli rossi Proteine: Troponina I e troponina T (le proteine contrattili cardiache) hanno una sensibilità maggiore della CK-MB nello scoprire la lesione del miocardio 36

37 Queste diapositive sono state realizzate per il Corso Integrato di Patologia clinica e diagnostica per immagini, Modulo di Patologia clinica, CdL Fisioterapia, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università Sapienza di Roma Nel caso riscontraste errori o inesattezze potete inviare una all indirizzo s.messina@unicas.it Nel caso voleste utilizzare queste diapositive per i vostri corsi vi saremmo molto grati se lo segnalaste allo stesso indirizzo di posta Il materiale del corso è disponibile sul sito 37