Thermo Scientific Dewax and HIER Buffers

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1 Thermo Scientific Dewax and HIER Buffers Jennifer Freeland BS, HTL(ASCP) cm, Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, USA; Erico von Bueren MD, PhD, MOR, Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, USA; Sharmini Muralitharan PhD, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA; Xiao-Ying Meng MS, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA; Marsha Harvey Quality Assurance Chemist, Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, USA, William Lienhart, HT(ASCP), Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, USA; Curt King, HT(ASCP), Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, USA; Kelly Miliman, BA, Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo, MI, USA; Ferda Filiz, MD, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA. Application Note LV IT Parole chiave Immunoistochimica, IHC, pretrattamento, smascheramento (recupero) antigenico, HIER, sparaffinatura, solvente organico solubile in acqua. Obiettivi dello studio 1. Illustrare il ruolo critico di un solvente organico solubile in acqua nella nuova formulazione del tampone di sparaffinatura e pretrattamento. 2. Illustrare che la nuova formulazione del tampone di sparaffinatura e pretrattamento ha ottime prestazioni e permette di ottenere ottimi risultati di colorazioni immunoistochimiche. Introduzione La metodica dello smascheramento antigenico (abbreviato come HIER - heat-induced epitope retrieval) è stata sviluppata negli anni 90 per preparare sezioni di tessuto fissate in formalina per la colorazione immunoistochimica (IHC). La metodica originale richiedeva tre specifici passaggi di sparaffinatura della sezione mediante solvente, idratazione in scala di alcoli ed infine incubazione in acqua; HIER poteva successivamente essere realizzato in un tampone acquoso. Alla fine del decennio sono stati introdotti sul mercato sistemi mono passaggio (abbreviato come: all-in-one), nei quali sezioni in paraffina potevano essere sparaffinatura, reidratate e smascherate in una soluzione. Le formulazioni per la metodica all-in-one presentano differenze tra loro ma fondamentalmente utilizzano un surnatante per agire come detergente che agevola la rimozione della paraffina disciolta. Queste formulazioni tradizionali di tampone all-in-one sono efficienti per la rimozione la paraffina da una sezione di tessuto, ma la paraffina sciolta si raccoglie sulla superficie del tampone. Un vetrino posto orizzontalmente risponde bene al trattamento con i tamponi all-in-one di tradizionale formulazione. La paraffina sciolta galleggia sulla superficie del tampone, come uno strato oleoso, e viene lavata via dal successivo ciclo di lavaggio. Però questo sistema non funziona correttamente per vetrini trattati in posizione verticale. La paraffina sciolta, raccolta sulla superficie del tampone nel contenitore, può aderire nuovamente ai vetrini, quando vengono estratti dalla soluzione tampone. Questa nuova deposizione di paraffina può interferire con la successiva colorazione IHC. In considerazione del fatto che il Thermo Scientific PT Module prevede il trattamento dei vetrini in posizione verticale, la tradizionale formulazione dei tamponi all-in-one non era in grado di esprimere il suo totale potenziale (ad esempio i precedenti tamponi PTM 1, 2, 3, e 4). In particolare, è stato rilevato che risulta difficile rimuovere paraffine con alto contenuto di polimeri plastici (ad esempio: le paraffine Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Type 9 e Histoplast LP) utilizzando formulazione tradizionale. Prove condotte per osservare l interazione tra la fase di paraffina sciolta, la fase acquosa, e la sezione di tessuto verticale, hanno permesso di rilevare come il problema principale riguardi la fase oleosa di paraffina sciolta sulla superficie della fase acquosa all interno del contenitore del PT Module. Da questo la decisione di sviluppare un nuovo tampone all-in-one, per migliorare le prestazioni, comunque solo a condizione che la paraffina sciolta potesse risultare dissolta nella fase acquosa. Senza additivo nel tampone che ne incoraggi la solubilità, la paraffina si raccoglie sulla superficie, come olio sull acqua (o olio d oliva sull aceto). Con un additivo scelto opportunamente specificamente un solvente organico solubile in acqua la paraffina si dissolve nella soluzione di tampone in temperatura. I tamponi Thermo Scientific Dewax and HIER Buffers contengono questo tipo di solvente. L obiettivo progettuale per la nuova formulazione è stato quello di ottenere la completa dissoluzione della paraffina nel tampone durante la fase di riscaldamento del processo HIER (circa 62 C). Durante questa fase ad alta temperatura la paraffina si scoglie dal vetrino. In mancanza di additivo nella soluzione tampone, in grado di rendere solubile la paraffina, questa si raccoglie sulla

2 2 superficie, come olio sull acqua (o olio d oliva sull aceto). Ma con un additivo scelto opportunamente specificamente un solvente organico solubile in acqua la paraffina si dissolve nella soluzione di tampone in temperatura. Una volta che i vetrini vengono estratti, non ci sono tracce di paraffina disciolta che coprono nuovamente i preparati. I vetrini possono essere lavati con tampone a temperatura ambiente ed essere inseriti nel Thermo Scientific Autostainer, per essere colorati. Questo studio illustra l importante ruolo che il solvente organico idrosolubile gioca nella possibilità di rendere solubile la paraffina disciolta durante la fase di riscaldamento dello smascheramento antigenico. Lo studio illustra inoltre i risultati di colorazione immunoistochimica ottenuti utilizzando il nuovo tampone e li mette a confronto con prodotti della concorrenza (Dako EnVision Flex Low ph) e con il procedimento convenzionale di sparaffinatura in solvente, reidratazione in alcool e smascheramento antigenico in soluzione tampone. Materiali & Metodi Tamponi concentrati: 1. : tampone per sparaffinatura e pretrattamento formulazione L, contenente sia glicole polietilenico 200 (PEG 200) che un solvente organico solubile in acqua (abbreviato come WSOS - water soluble organic solvent). 2. D2: come L1, ma privo di PEG200 sostituito da acqua distillata (22,0 ml) 3. D3: come L1, ma privo di PEG200 sostituito da acqua distillata (7,5 ml) 4. : tampone citrato standard per pretrattamento, senza proprietà sparaffinanti (controllo negativo) 5. Dako EnVision Flex Low ph (Red): tampone per sparaffinatura e pretrattamento della concorrenza (controllo negativo) Soluzioni di lavoro: 1. Preparare 100 ml con diluizione 1:15 aggiungendo a 6,7 ml 93,3 ml di acqua distillata 2. Preparare 100 ml con diluizione 1:15 aggiungendo a 6,7 ml D2 93,3 ml di acqua distillata 3. Preparare 100 ml con diluizione 1:15 aggiungendo a 6,7 ml D3 93,3 ml di acqua distillata 4. Preparare 100 ml con diluizione 1:100 aggiungendo a 1,0 ml 99,0 ml di acqua distillata 5. Preparare 100 ml con diluizione 1:50 aggiungendo a 2,0 ml Dako Flex Red 98,0 ml di acqua distillata Versare cinque grammi di paraffina Histoplast LP in 100 ml di soluzione di lavoro, preriscaldata a 58 C (punto di fusione della paraffina), e sottoposta ad agitazione costante. Rilevare la percentuale di paraffina disciolta alla temperatura di 58 C. Aumentare la temperatura della soluzione, sempre sottoposta ad agitazione costante, fino al completo scioglimento della paraffina, e rilevare la temperatura raggiunta. Per la soluzione, contenente WSOS, i 5 grammi di paraffina sono stati completamente disciolti ad una temperatura di 62 C. Aumentare la temperatura della soluzione fino C e lasciare raffreddare fino a 55 C (immediatamente al di sotto del punto di fusione della paraffina). Filtrare la soluzione a 55 C e pesare il residuo raccolto sulla carta filtro. La differenza di peso rispetto ai 5 grammi iniziali corrisponde alla quantità di paraffina completamente in soluzione a 55 C. La successione dei processi è stata ripetuta per tutte le soluzioni: D2, D3,, e e i risultati riportati in tabella 1. Metodica di colorazione immunoistochimica e reagenti Le soluzioni di ogni tampone sparaffinante e pretrattante L,, e Dako EnVision Flex Red sono state utilizzate parallelamente nel PT Module con successiva colorazione immunoistochimica su Autostainer 360. I vetrini sono stati trattati in parallelo, per potere rilevare la dissoluzione della paraffina e l efficacia della colorazione immunoistochimica. Per la colorazione immunoistochimica sono stati utilizzati i seguenti reagenti: Sistema di rivelazione: Thermo Scientific UltraVision Quanto HRP DAB Anticorpo primario: HER2 (RM-9103, 1:100), CD3 (RM- 9107, 1:150) e Ki67 (RM-9106 RTU) Controlli: vetrini di controllo CheQpoint HER2 allestiti con sezioni di tonsilla allestiti con tissue microarrayer, 4 μm Ematossilina di Mayer modificata Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Un patologo ha esaminato e valutato i vetrini Risultati Solubilità della paraffina: Questo studio mostra che il solvente organico solubile in acqua permette al tampone acquoso la dissoluzione della paraffina disciolta nella soluzione alle temperature mostrate nella tabella seguente a temperature uguali o superiori al punto di fusione della paraffina. Entrambi i tamponi e D2 mostrano la dissoluzione di approssimativamente il 90% della paraffina a 58 C. Entrambi i tamponi and D2 mostrano la completa dissoluzione della paraffina a 62 C. and D2 hanno mantenuto questa solubilità fino a C. Allo scendere della temperatura, i tamponi e D2 hanno mostrato di mantenere una solubilità della paraffina del 5% sotto i 55 C (3 gradi sotto il punto di fusione della paraffina). Con il tampone D3, contenente glicole polietilenico ma non solvente organico solubile in acqua, è stato rilevato lo scioglimento del 90% della paraffina a

3 58 C, mentre il completo scioglimento è stato ottenuto solo a 66 C. La paraffina pare fondere e formare uno strato superficiale oleoso, anche a C. Il tampone D3 non è stato in grado di trattenere il 2% della paraffina sotto i 55 C. Solo il 40% della paraffina risultava disciolta nel tampone alla temperatura di 58 C e lo scioglimento completo è stato possibile solo al raggiungimento dei 79 C. La paraffina fusa e il tampone si sono mantenuti in fasi separate durante tutto il riscaldamento fino a C. Dopo raffreddamento a 55 C tutta la paraffina è stata rimossa tramite filtrazione e dunque nessuna paraffina è stata trattenuta nella soluzione sotto i 55 C. Con il tampone il 60% della paraffina risultava fusa a 58 C e il completo scioglimento è stato ottenuto a 68 C. La paraffina fusa e il tampone si sono mantenuti in fasi separate durante tutto il riscaldamento fino a C. Dopo raffreddamento a 55 C tutta la paraffina è stata rimossa tramite filtrazione e dunque nessuna paraffina è stata trattenuta nella soluzione sotto i 55 C. Le immagini mostrano i comportamenti agli effetti della solubilità descritti nei punti precedenti. Le foto dei tamponi e D2, scattate a C, mostrano un liquido torbido con uno strato superiore leggermente schiumoso, nessuna separazione tra i diversi strati. I tamponi D3 (con glicole polietilenico ma non solvente organico solubile in acqua),, e Dako Red mostrano uno strato chiaro e incolore al di sopra di una ben distinta fase acquosa. Lo strato superiore è paraffina fusa, lo strato inferiore acquoso. Costanza del ph e risultati della colorazione immunoistochimica Questo studio conferma che i tamponi e D2 mantengono il ph della soluzione concentrata, tra i diversi lotti e cicli di lavoro. Questa costanza del ph contribuisce alla buona qualità della colorazione immunoistochimica. I grafici mostrano le immagini microscopiche che confermano le elevate e costanti prestazioni dei tamponi,, e per l individuazione di HER2 amplificato in uno spot HER2 sul tissue microarray. Analogamente, la qualità della colorazione dello spot 2+ sul HER2 tissue microarray è comparabile tra i tre tamponi. Anche il Ki67 mostra alta e costante qualità della colorazione per i tre tamponi. Gli stessi risultati (qui non mostrati) sono stati ottenuti con altri anticorpi. 3 Tabella: Test di solubilità paraffina Step Action D 1 D 2 D 3 1 Preparare 100 ml di soluzione di lavoro. Formula No PEG200 No WSOS Controllo Concorrenza completa 2 Versare 5g di Histoplast LP peso esatto rilevato. 5,0058 g 5,0126 g 5,0222 g 5,0084 g 5,0057 g 3 Temperatura iniziale / temperatura a cui la 58 C / 62 C 58 C / 62 C 58 C / 66 C 58 C / 79 C 58 C / 68 C paraffina di discioglie completamente. 4 Percentuali di scioglimento alle temperature dello 90% / 100% 90% / 100% 40% / 100% 60% / 100% 60% / 100% step precedente (%). 5 Paraffina residua a 55 ºC. 4,6476 g 4,4546 g 4,8595 g 4,7556 g 4,7271 g 6 Paraffina residua a t.a. (24 ºC). 0,2337 g 0,2570 g 0,1010 g 0 g 0 g 7 Variazione paraffina residua tra 55 ºC e 24 ºC. 5% 5% 2% 0% 0% 8 Paraffina in soluzione a 55 ºC. 0,3582 g 0,5580 g 0,1627 g 0,2528 g 0,2786 g 9 Percentuale rispetto a quantità iniziale. 7% 11% 3% 5% 6%

4 4 Tampone sparaffinante 1 a 59 C. Notare la formazione di completa sospensione (torbida, opaca) e lo strato superiore leggermente schiumoso Tampone sparaffinante 2 a 58 C. Notare la formazione di completa sospensione (torbida, opaca) e lo strato superiore leggermente schiumoso Tampone sparaffinante 3 a 56 C. Notare il fondo chiaro di tampone (arancio), lo strato intermedio schiumoso, e il sottile strato superiore incolore (paraffina fusa) Tampone Dako EnVision Flex Low ph a 72 C. Notare lo strato parzialmente torbido di tampone ( rosa) e e lo strato superiore incolore (paraffina fusa). Tampone a 79 C. Notare lo strato inferiore di tampone incolore e lo strato superiore incolore (paraffina fusa)

5 Risultati ph 5 Concentrato Prima di ciclo 1 Prima di ciclo 2 Dopo ciclo D (basso ph) Tampone citrato di controllo Concentrato Prima di ciclo 1 Prima di ciclo 2 Dopo ciclo 2 HER2 : D2 (basso ph) Tampone citrato di controllo Risultati colorazione immunoistochimica HER2 : Dako Flex (Red) HER2 :

6 6 HER2 2+: Ki67 tonsilla: HER2 2+: Dako Flex (Red) HER2 2+:

7 Valutazioni dei risultati 7 HER2 Valutazione del patologo Ciclo 1 Ciclo 2 Vetrino 1 Vetrino 2 Vetrino 3 3/ Vetrino 1 Vetrino 2 Vetrino 3 3/ CD3 Valutazione del patologo Ciclo 1 Ciclo 2 Ki67 tonsilla Dako Flex (Red) Ki67 Valutazione del patologo Ciclo 1 Ciclo 2 Vetrino 1 Vetrino 2 Vetrino 3 Commenti Solubilità della paraffina I risultati di questo studio mostrano le prove qualitative che il solvente organico solubile in acqua contenuto nella formulazione del tampone ha un impatto rilevante e positivo sul comportamento della solubilità della paraffina. Questa è stata la formulazione base scelta per sviluppare i tamponi sparaffinanti e pretrattanti Dewax and HIER Buffers L, M, e H. Ki67 tonsilla: I tamponi e D2, con solvente organico solubile in acqua, sono stati in grado di solubilizzare la paraffina parzialmente tra 55 e 62 C e completamente a C. I solventi D3, HIERL, e senza solvente organico solubile in acqua, non sono stati in grado di solubilizzare la paraffina, anche ad alta temperatura. La paraffina si è semplicemente fusa e si è separata in uno strato incolore al di sopra della fase liquida, impossibile da omogeneizzare, anche temporaneamente, a nessuna temperatura.

8 I tamponi e L2 con mantengono in soluzione due volte e mezza più paraffina di quanto rilevato con il tampone D3 senza solvente organico solubile in acqua. Il tampone di controllo e quello della concorrenza ( e Dako Flex Red) non hanno trattenuto alcuna paraffina nello stesso range di temperatura; a temperature inferiori a 55 C tutta la paraffina è stata trattenuta dalla carta da filtro. I tamponi per sparaffinatura e pretrattamento con solvente organico solubile in acqua sono patent pending. I tamponi e L2 con mantengono in soluzione due volte e mezza più paraffina di quanto rilevato con il tampone D3 senza solvente organico solubile in acqua. ph e risultati della colorazione immunoistochimica Il solvente organico solubile in acqua non ha influenza sulla costanza del ph o sulla colorazione immunoistochimica. I risultati della colorazione immunoistochimica per tutti i tamponi per sparaffinatura e pretrattamento Thermo Scientific Dewax and HIER Buffers L, M, e H confermano la costanza del ph, la completezza della sparaffinatura e la eccellente qualità di colorazione. I risultati sono assolutamente comparabili con entrambi i prodotti concorrenti (Dako EnVision Flex Low e High ph, Cell Marque Trilogy) e con il metodo classico a tre step di sparaffinatura, reidratazione e pretrattamento. Ringraziamenti Un particolare ringraziamento a Alexis Stubelt per la realizzazione di questo documento. We would like to thank Langxing Pan, MD, PhD, for assistance with slide review. Bibliografia 1. Carson FL: Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd ed. ASCP Press, Chicago, Dako. Data Sheet. Target Retrieval Solution Dako. Material Safety Data Sheet. Target Retrieval Solution Elias, JM. Immunohistochemistry: A Practical Approach to Diagnosis, 2nd Ed O Leary TJ, et al. Protein fixation and antigen retrieval: chemical studies. Biotechnic & Histochemistry, 99999:1, URL: Sheehan DC, Hrapchak BB: Theory and Practice of Histotechnology, 2nd ed. The C.V. Mosby Company, St. Louis, Shi SR, et al. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39: Application Note LV IT Conclusioni Quel che permette di eccellere nella rimozione della paraffina dai vetrini è questo unico comportamento di solvibilità del solvente contenuto nella nuova formulazione dei tamponi di sparaffinatura e pretrattamento. Specificamente, i nuovi tamponi Thermo Scientific Dewax and HIER Buffers L, M, e H ottengono le migliori prestazioni con sezioni di tessuto poste in posizione verticale, come nel caso del PT Module. Con la perfetta sparaffinatura si ottiene l ottimizzazione dei risultati della colorazione immunoistochimica, che risulta costante, omogenea, ripetibile e di alta qualità. Avremo il piacere di dimostrare i nuovi prodotti, ordinabili con i codici TA-999-DHBL, TA-999-DHBM e TA-999-DHBH. Quel che permette di eccellere nella rimozione della paraffina dai vetrini è questo unico comportamento di solvibilità del solvente contenuto nella nuova formulazione dei tamponi di sparaffinatura e pretrattamento. Specificamente, i nuovi tamponi Thermo Scientific Dewax and HIER Buffers L, M, e H ottengono le migliori prestazioni con sezioni di tessuto poste in posizione verticale, come nel caso del PT Module. 8. Shi RW, et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49: Thermo Fisher Scientific. Data Sheet. HIER Buffers Thermo Fisher Scientific. Instructions for Use: Thermo Scientific Autostainer Thermo Fisher Scientific. Instructions for Use: Thermo Scientific PT Module Thermo Fisher Scientific. Instructions for Use: Thermo Scientific Quanto Detection System Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. EnVision is a trademark of Dako. All other trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries. Anatomical Pathology LV10018-IT R9/ Campus Drive Kalamazoo, MI (800)

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