Il campionamento non-invasivo come routine nella gestione della fauna selvatica: il caso di Lepus corsicanus

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1 Conservazione di Lepus corsicanus De Winton, 1898 e stato delle conoscenze, de Filippo et al. (a cura di), 2007, IGF publ. Il campionamento non-invasivo come routine nella gestione della fauna selvatica: il caso di Lepus corsicanus Massimo Pierpaoli 1, Valter Trocchi 2 e Francesco Riga 2 1 NGB Genetics Srl, Ferrara, Italia 2 Istituto Nazionale per la Fauna Selvatica Selvatica, Via Cà Fornacetta 9, I Ozzano E., Bologna, Italia, valter.trocchi@infs.it Abstract A method for species identification and discrimination between Lepus corsicanus and Lepus europaeus, based on noninvasive genetic sampling is presented. Validation of the method is achieved by analising tissue samples of know species and geographical origin and excremental samples collected under controlled conditions. Results indicate that the method is either specific and efficient, allowing detection of hare DNA and species identification in most of the samples analysed. Introduzione La comprensione della biologia di una specie minacciata è un prerequisito fondamentale per poter avviare in modo efficace qualsiasi progetto di conservazione e di tutela di una sua popolazione. Negli ultimi anni le tecniche molecolari non-invasive si sono imposte come strumento utile, e ormai quasi indispensabile, per lo studio dei parametri fondamentali di specie particolarmente elusive o la cui densità di popolazione è particolarmente bassa. La tipologia di dati estrapolabili da un campionamento genetico non-invasivo varia dall'identificazione di specie, fino all'identificazione individuale, permettendo la stima di parametri come la presenza/assenza di una determinata specie, la stima numerica di una popolazione, il rapporto tra sessi, le relazioni di parentela. Lepus corsicanus è presente nel centro-sud Italia in simpatria con L. europaeus. La competizione tra le due specie è considerata come una delle principali cause della riduzione delle popolazioni di L. corsicanus. Questo fatto, unito alla mancanza di dati certi sulla presenza di una o entrambe le specie in molte aree di studio, ha indotto la necessità di mettere a punto uno strumento versatile per l'identificazione di specie, basato sull'utilizzo di materiale biologico raccolto mediante tecniche non-invasive. Lo scopo di questo lavoro è di mettere a punto una tecnica in grado di discriminare Lepus corsicanus e Lepus europaeus, utilizzando un sistema non invasivo basato sul DNA purificato dagli escrementi. Metodi Campionamento di materiale fecale 13 campioni fecali di L. corsicanus sono stati raccolti in aree chiuse e controllate in Lazio, Basilicata e Sicilia, dove precedenti studi hanno indicato la presenza della sola L. corsicanus. Allo scopo di saggiare l'effetto dell'invecchiamento dell'escremento sull'efficienza di amplificazione, 10 dei 13 campioni, provenienti da 2 individui, sono stati raccolti ad intervalli di tempo di ore, a partire dalla seconda ora di deposizione. 10 campioni fecali di L. europaeus sono stati raccolti ad intervalli di ore in un area recintata in Emilia-Romagna. Sono stati infine analizzati 4 campioni di origine sconosciuta, provenienti da un recinto localizzato in Calabria. 63

2 Estrazione del DNA I campioni sono stati conservati in etanolo 95% dal momento della raccolta e a -20 C dal momento dell'arrivo in laboratorio. Il DNA è stato purificato utilizzando il metodo di Gerloff et al. (1995), che prevede una incubazione di circa 10 ore in tampone di guanidina-tiocianato seguita da una seconda incubazione di 2 ore in presenza di particelle silicee, alle quali il DNA si lega, e da una serie di lavaggi in tamponi di guanidina ed etanolo. Il DNA così ottenuto viene infine separato dalle particelle silicee tramite risospensione in tampone di TRIS (10mM) / EDTA (0,1mM) ed incubazione a 56 C per 15'. La soluzione di DNA viene conservata -20 C. Individuazione dei marcatori e disegno dei primers di amplificazione Sulla base di precedenti lavori (Pierpaoli et al. 1999), si è ritenuto che il gene del Citocromo b (Cyt b), localizzato nel genoma mitocondriale, fosse il marcatore più adatto all'individuazione dei polimorfismi diagnostici necessari alla discriminazione delle due specie. L'amplificazione ed il sequenziamento del Cyt b sono stati effettuati seguendo le metodiche descritte in Pierpaoli et al (1999). Il sequenziamento di campioni noti di L. corsicanus e L. europaeus ha infatti permesso di individuare alcuni polimorfismi in grado di discriminare le due specie di lepre. Utilizzando il software Primer3 (Rozen e Skaletsky 2000) sono state sviluppate due coppie di primers specie-specifiche, tale caratteristica è stata ottenuta disegnando i primers in modo che l'estremità 3' fosse localizzata esattamente sul sito polimorfico diagnostico. In questo modo la reazione di PCR genera un prodotto solo se la coppia di primers disegnata per una delle due specie viene associata al DNA estratto dall'escremento di quella stessa specie, in caso contrario la reazione sarà negativa. I prodotti di PCR generati sono inoltre di lunghezza diversa, così da consentirne una facile discriminazione tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2%. I primers sono stati inoltre disegnati in modo da non generare alcun prodotto di amplificazione in presenza di DNA di coniglio. Validazione dei primers La specificità dei primers è stata saggiata mediante amplificazione e sequenziamento di 20 campioni caratterizzati morfologicamente e geneticamente in precedenti studi (Riga et al. 2001, Pierpaoli et al. 1999). I campioni di L. corsicanus, in particolare, sono stati scelti in modo da rappresentare i gruppi geografici individuati nel corso di studi condotti in precedenza (Pierpaoli et al. 1999). Risultati Sviluppo e validazione dei primers di amplificazione I primers utilizzati in Pierpaoli et al. (1999) hanno permesso l'amplificazione ed il sequenziamento di un frammento di Cyt b lungo circa 500 paia di basi (bp). In figura 1 sono indicati alcuni dei polimorfismi che permettono la distinzione di L. corsicanus e di L. europaeus. I primers sono stati quindi provati su una serie di campioni di lepre noti (fig. 2). I risultati confermano la capacità dei primers sviluppati di amplificare i frammenti della lunghezza prevista dall'analisi delle sequenze, rispettivamente di 100 bp. in L. corsicanus e di 268 bp. in L. europaeus. La specificità dei primers sviluppati è stata inoltre provata utilizzando i primers specifici per L. corsicanus su DNA di L. europaeus e viceversa. I risultati (figg. 3 e 4) indicano l'assenza di amplificazione aspecifica. I risultati ottenuti indicano, quindi, che i primers sviluppati sono in grado di amplificare in maniera specifica campioni noti di L. corsicanus e L. europaeus. Queste caratteristiche, unite alle ridotte dimensioni dei frammenti amplificati, sono indispensabili per poter analizzare campioni sconosciuti di escrementi. 64

3 Conservazione di Lepus corsicanus De Winton, 1898 e stato delle conoscenze, de Filippo et al. (a cura di), 2007, IGF publ. Figura 1 - Sequenze di L. corsicanus (sopra) e L. europaeus (sotto). I siti diagnostici sono indicati da asterischi. Figura 2 - Risultati dell'amplificazione effettuata su campioni conosciuti di L. corsicanus e L. europaeus. Corsie da G7 a E7: frammenti di 100 bp. ottenuti utilizzando DNA di L. corsicanus. Corsie da H8 a D8: frammenti di 268 bp. ottenuti utilizzando DNA di L. europaeus. Corsie H7, C8: campioni negativi di controllo. Figura 3 - Risultati dell'amplificazione effettuata utilizzando i primers specifici per L. europaeus. Corsie da H4 a D4: frammenti di 268 bp. (indicati dall'asterisco), ottenuti utilizzando DNA di L. europaeus. Corsie da H5 a D5: assenza di amplificazione osservata utilizzando DNA di L. corsicanus. Corsie C4, D5: campioni negativi di controllo. Figura 4 - Risultati dell'amplificazione effettuata utilizzando i primers specifici per L. corsicanus. Corsie da G1 a D1: frammenti di 100 bp. (indicati dall'asterisco), ottenuti utilizzando DNA di L. corsicanus. Corsie da G2 a C2: assenza di amplificazione osservata utilizzando DNA di L. europaeus. Corsie H1, H3: campioni negativi di controllo. 65

4 Determinazione della specie in campioni di escremento La capacità del sistema sviluppato di determinare la specie in campioni sconosciuti di escremento è stata provata attraverso l'analisi in cieco di 28 escrementi forniti dall'istituto Nazionale per la Fauna Selvatica. Su ogni campione sono state effettuate almeno 2 repliche dell'analisi. I risultati riguardanti 20 campioni sono indicati in figura 5. I risultati indicano una elevata percentuale di amplificazioni positive, infatti hanno dato esito positivo 18 dei 20 campioni analizzati (90%) e 36 delle 40 delle amplificazioni effettuate (90%). La concordanza tra identificazione genetica della specie e classificazione morfologica, effettuata in cieco, è stata del 100%. In tabella 1 sono riportati i risultati delle analisi effettuate. I frammenti ottenuti tramite amplificazione di DNA da escrementi (Fig. 5) sono stati inoltre purificati e sequenziati, allo scopo di confermare la specificità della metodica. I risultati del sequenziamento hanno confermato la diagnosi di specie effettuata utilizzando il sistema descritto sopra. Figura 5 - Risultati delle amplificazioni effettuate in cieco su campioni di escremento. I frammenti lunghi 100 bp. indicano i campioni di L. corsicanus, i frammenti di 268 bp indicano i campioni di L. europaeus. (vedi anche fig. 2). I campioni 1', 2' e 3' rappresentano ulteriori repliche effettuate su un secondo estratto di DNA. NEG: campioni negativo di controllo. Conclusioni Il sistema sviluppato si è dimostrato in grado di amplificare in maniera specifica frammenti di DNA diagnostici per L. corsicanus e L. europaeus. Il sistema si è inoltre rivelato efficace anche in campioni di escrementi, caratterizzati dalla presenza di elevate quantità di inibitori della PCR e dalla scarsa quantità e qualità di DNA bersaglio presente. Si ritiene che tale sistema possa essere impiegato in progetti di monitoraggio della lepre, in particolare in aree dove L. corsicanus e L. europaeus siano presenti in simpatria e si renda necessario non solo stabilire la presenza/assenza della lepre, ma si debba anche determinare quale specie sia presente. 66

5 Conservazione di Lepus corsicanus De Winton, 1898 e stato delle conoscenze, de Filippo et al. (a cura di), 2007, IGF publ. Tabella 1. Risultati delle diagnosi effettuate su 28 campioni di escremento. Specie Origine Invecchiamento Determinazione Genetica L. corsicanus Lazio 12 ore L. corsicanus L. corsicanus Lazio 12 ore L. corsicanus L. corsicanus Lazio >48 ore L. corsicanus L. corsicanus Sicilia (ESEMPLARE B) 12 ore L. corsicanus L. corsicanus Sicilia (ESEMPLARE B) 24 ore L. corsicanus L. corsicanus Sicilia (ESEMPLARE B) 48 ore L. corsicanus L. corsicanus Sicilia (ESEMPLARE B) 60 ore L. corsicanus L. corsicanus Sicilia (ESEMPLARE B) 72 ore L. corsicanus L. corsicanus Basilicata (ESEMPLARE A) 2 ore L. corsicanus L. corsicanus Basilicata (ESEMPLARE A) 36 ore L. corsicanus L. corsicanus Basilicata (ESEMPLARE A) 48 ore L. corsicanus L. corsicanus Basilicata (ESEMPLARE A) 60 ore L. corsicanus L. corsicanus Basilicata (ESEMPLARE A) 72 ore L. corsicanus L. corsicanus (presunta) Calabria >48 ore L. europaeus L. corsicanus (presunta) Calabria >48 ore Negativo L. corsicanus (presunta) Calabria >48 ore L. europaeus L. corsicanus (presunta) Calabria >96 ore Negativo L. europaeus Emilia-Romagna 12 ore Negativo L. europaeus Emilia-Romagna 36 ore L. europaeus L. europaeus Emilia-Romagna 36 ore L. europaeus L. europaeus Emilia-Romagna >48 ore L. europaeus L. europaeus Emilia-Romagna >48 ore L. europaeus L. europaeus Emilia-Romagna >48 ore L. europaeus L. europaeus Basilicata 12 ore L. europaeus 67

6 Bibliografia Gerloff U., Schlotterer C., Rassmann K., Rambold I., Hohmann G., Fruth B. e Tautz D Amplification of hypervariable simple sequence repeats (microsatellites) from excremental DNA of wild living Bonobos (Pan paniscus). Molecular Ecology 4: Pierpaoli M., Trocchi V., Riga F. e Randi E Species distinction and evolutionary relationships of the Italian hare (Lepus corsicanus) as described by mitochondrial DNA sequencing. Molecular Ecology 8: Rozen S. e Skaletsky H Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Pp , in: Krawetz S., Misener S. (Eds.). Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ. Riga F., Trocchi V., Randi E. e Toso S Morphometric differentiation between the Italian hare (Lepus corsicanus DeWinton, 1898) and the European brown hare (Lepus europaeus Pallas 1778). J. Zool. London 253: