La diagnosi immunologica. dell infezione tubercolare
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- Riccardo Fiore
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1 Diagnostica di laboratorio della tubercolosi: le antiche certezze e le nuove frontiere La diagnosi immunologica dell infezione tubercolare Dr. Chiara Agrati, PhD Laboratorio di Immunologia cellulare INMI L. Spallanzani
2 Mycobacterium tubercolosis e l uomo: Un equilibrio complesso e delicato
3 Una malattia persistente Rappuoli R. Nat Med 2004
4 Infezione latente e malattia attiva Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno) Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno) Stato di malattia manifesta dal punto di vista clinico, batteriologico e/o radiologico. Infezione tubercolare latente (2 miliardi) Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza segni clinici, batteriologici o radiologici di malattia manifesta. Tipicamente si tratta di individui con intradermoreazione tubercolinica positiva ed un Rx torace normale, che possono essere contatti di un precedente caso di tubercolosi.
5 Risposta immunologica e esito dell infezione High Innate immunity MTB clearence NO Infection Innate immunity Adaptive immunity Latent Infection Controlled >90% Innate immunity Defective Adaptive immunity Disease <10% Reactivation <10%
6 Gran parte del successo di Mtb come agente patogeno è dovuto alla sua capacità di interferire con praticamente ogni meccanismo battericida del macrofago utilizzando tale tipo cellulare come un cavallo di Troia per sfuggire al riconoscimento immune
7 Infezione attiva: a) Microbiologica (Microscopia, Coltura e Metodi molecolari) b) Radiologica Infezione latente Diagnosi a) Test immunologici che valutano la risposta immune (Mantoux, IGRA) Immunità umorale - Riscontro in circolo di anticorpi Immunità cellulo-mediata - Riscontro in circolo di cellule T specifiche per il patogeno
8 Immunità umorale e cellulo-mediata IMMUNITA UMORALE IMMUNITA CELLULO-MEDIATA ANTIGENE BATTERI EXTRA-CELLULARI MICROBI INTRA-CELLULARI ALL INTERNO DI UN MACROFAGO MICROBI INTRA-CELLULARI IN UNA CELLULA INFETTATA LINFOCITI RESPONSIVI LINFOCITA B LINFOCITA T LINFOCITA T MECCANISMO EFFETTORE ANTICORPI SECRETI ELIMINAZIONE DEI BATTERI ATTIVAZIONE DEL MACROFAGO UCCISIONE DEI MICROBI LISI DELLA CELLULA INFETTATA
9 Il ruolo dei linfociti T CD4: - Induzione dei meccanismi battericidi del macrofago - Rimozione del blocco della maturazione del fagosoma e della fusione del fagolisosoma CD8: - aumento delle molecole costimolatorie - Produzione di citochine infiammatorie - Lisi delle cellule infette mediata da citochine - Lisi delle cellule infette mediata da granulolisine
10 Il principale obiettivo dei test immunologici è di identificare le infezioni tubercolari latenti Ma non discriminano tra infezione latente e attiva
11 I test immunologici 1) Mantoux, introdotta nel ) IGRA: Interferon-gamma release assay (dal 2001) 2a) Quantiferon TB Gold 2b) Quantiferon TB In tube 2b) QTSPOT-TB
12 La Mantoux E il più vecchio test diagnostico ancora in uso -1891: filtrato di brodo di coltura (reazione febbrile) PPD (reazione cutanea di ipersensibilità ritardata) -Oggi: inoculazione intradermica di 5UI di PPD e lettura dopo 48-72h. il soggetto che ha immunità specifica produce una papula (lettura dopo h) si misura l infiltrato, non l eritema
13 Vantaggi della Mantoux Utile per predire la TBC attiva Il trattamento dei soggetti Mantoux positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva Basso costo Non richiede l intervento del laboratorio
14 Limiti della Mantoux (1) Problemi di ordine pratico 2 visite (inoculo e lettura 30% dei test rimane senza lettura falsi positivi legati a cross-reazione con altri micobatteri legati a vaccinazione con BCG effetto booster legati alla somministrazione legati alla lettura
15 Vantaggi della Mantoux (2) falsi negativi legati al soggetto testato infezioni disturbi metabolici fattori nutrizionali farmaci (corticosteroidi, agenti immunosoppressivi ) legati alla tubercolina malattie degli organi linfoidi (HD, linfomi ) età (neonati, anziani) infezione di MTB recente stress (chirurgia, GVHD ) improprio stoccaggio, diluizione legati alla somministrazione ritardo dopo la preparazione della siringa quantità insufficiente di antigene somministrato legati alla lettura inesperienza del lettore errori consci o inconsci
16 Lettura della Mantoux: cut-off Cut-off di positività per gruppi di rischio 5 mm 10 mm 15 mm - HIV positivi - contatti recenti di TB - rx compatibile con TB - trapiantati e immunosoppressi - immigrati di recente da aree ad alta prevalenza - tossicodipendenti - residenti e operatori di ambienti a rischio - silicosi, diabete mellito, IRC, leucemie, carcinomi - soggetti senza fattori di rischio
17 I test IGRA IGRA: Interferon gamma release assay 3 principali modifiche rispetto alla Mantoux: a) test in vitro b)antigeni utilizzati: per la stimolazione vengono utilizzati gli antigeni ESAT-6 e CFP-10 10, specifici per MTB ed assenti nel BCG c)hanno un controllo positivo di immunocompetenza
18 IGRA: tests in vitro Measurement of IFN-γ
19 IGRA: antigeni specifici La scelta degli antigeni La Manotux si base sull inoculazione di PPD (purified proteic derivative) che è presente in molti altri micobatteri > specificità ambientali e anche nella vaccinazione con BCG. Gli IGRA utilizzano antigeni codfificati in una regione genica (RD-1) che manca nel BCG e in quasi tutti i micobatteri ambientali. I principali di questi antigeni sono: ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) CFP-10 (culture filtrate protein 10)
20 IGRA: controllo positivo E importante per evidenziare FALSI NEGATIVI
21 Vantaggi degli IGRA Test in vitro Nessun effetto booster Specificità elevata (antigeni ESAT-6 e CFP-10 codificati in una regione genica (RD1) Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione del paziente Interpretazione oggettiva (fornisce un dato di Laboratorio, positivo o negativo, rispetto ad un cut-off universale per tutti i soggetti, indipendentemente dal fattore di rischio cui sono esposti) Disponibilità di un controllo mitogeno (QFT-TB GOLD) che permette di verificare la risposta immunitaria del paziente. Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari
22 Limiti degli IGRA I campioni di sangue devono essere processati entro 8-16 ore Esistono meno dati sull utilizzo di questi test in alcune popolazioni di soggetti come immunocompromessi, bambini e nei follow up seriali
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24 Sensibilità NON esiste un gold standard 1)Proporzione di test positivi in soggetti con TB attiva 2)Stima della sensibilità usando il gradiente di esposizione Specificità NON esiste un gold standard Il Quantiferon è chiaramente più sensibile negli individui vaccinati
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26 Quale test è più opportuno utilizzare? E preferibile usare Mantoux 1) Nei bambini al di sotto dei 5 anni di età. Alcuni esperti suggeriscono che per aumentare la sensibilità sarebbe meglio farli entrambi. E preferibile usare IGRA 1) Persone ad alto rischio di non presentarsi alla 2 visita per la lettura (tossicodipendenti, senza tetto, etc); 2) Persone vaccinate con BCG; 3) Nei follow-up per evitare l effetto booster
27 Quale test è più opportuno utilizzare? Paragonabili = 1) Contatti recenti con persone con TB attiva o sospetta TB attiva. Sul TST ci sono più dati ma c è rischio effetto Booster; per gli IGRA meno dati sui tempi di conversione 2) Screening occupazione per persone a rischio (HCWs). Problema delle conversioni/reversioni
28 Mantoux + IGRA + 1) Test iniziale negativo: 1a) gruppi ad alto rischio di infezione e progfresisone (HIV, bambini < 5 anni); 2a) sospetto fondato di infezione e si desidera conferma 2) Test iniziale positivo: 2a) servono ulteriori evidenze per convincere pazienti; 2b) grupi a bassissimo rischio 3) Nei casi in cui test IGRA è indeterminato/borderline/etc.
29 Laboratorio di Immunologia Cellulare Federico Martini Cristiana Gioia Alessandra Rinaldi Domenico Viola Federica Turchi GRAZIE PER L ATTENZIONE
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