Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani IRCCS -Laboratorio di Immunologia Cellulare- Dr. Domenico Viola TSLB

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1 Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani IRCCS -Laboratorio di Immunologia Cellulare- Dr. Domenico Viola TSLB

2 Un nuovo standard a supporto della diagnosi dell infezione da M. tuberculosis

3 Test basati su IFN-γ Test in vitro che misurano l IFN-γ rilasciato dai linfociti T in risposta ad antigeni tubercolari I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo che contiene mitogeno (fitoemoagglutinina) Ricerca dell IFN-γ dopo opportuna incubazione assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE presenza di IFN-γ = INFEZIONE presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN-γ nel controllo MIT = DEFICIT IMMUNITARIO

4 PRINCIPIO DEL TEST: Nil TBAg MIT QuantiFERON: test brevettato, certificato CE, FDA cleared, che, attraverso la misurazione dell IFN-γ prodotto in vitro, a seguito di una stimolazione linfocitaria (T) specifica* in sangue intero, assicura un prezioso supporto alla diagnosi delle infezioni da M. tuberculosis Normal altitude tubes High altitude tubes * Cellestis Limited e lo Statens Serum Institut (SSI) hanno siglato un accordo per l utilizzo delle proteine M. tuberculosis specifiche nella piattaforma brevettata QFT-TB GOLD In-Tube

5 Test basati su IFN-γ QuantiFERON-TB Gold Metodo ELISA in-tube 1.Raccolta del sangue in provette eparinate (K neg, ESAT6 + CFP10, mitogeno) 2.Incubazione per 16-24h a 37 C 3.Centrifugazione 4.Recupero del plasma e dosaggio dell IFN-γ 1. ELISA sandwich incubazione 120 min 2. Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura COLORE 3. Misura della DO e dosaggio dell IFN-g contro una curva di taratura Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004

6 I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT

7 Confronto tra i test per infezione latente Confronto tra i test per infezione latente Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004 Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004

8 ACCURATEZZA DEL TEST: MIT (mitogeno) % maximal IFN-gamma response Mitogen Concentration used in Q F T -G old Co n ce n tratio n o f M ito g e n PHA a concentrazione critica Un controllo della funzionalità immunitaria del Paziente: Risposta al Mit inversamente proporzionale alla immunocompromissione del Paziente

9 SPECIFICITA DEL TEST: TBAg (ESAT-6, CFP-10, TB 7.7) BCG substrain Tuberculosis complex Antigeni ESAT-6* CFP-10* TB7.7 M tuberculosis + M africanum + M bovis + gothenburg - moreau - tice - tokyo - danish - glaxo - montreal - pasteur - Antigeni specifici brevettati (SSI, Denmark) Cellestis con diritti a livello mondiale Ceppi ambientali Antigeni ESAT-6* CFP-10* TB7.7 M abcessus - M avium - M branderi - M celatum - M chelonae - M fortuitum - M gordonii - M intracellulare - M kansasii + M malmoense - M marinum + M oenavense - M scrofulaceum - M smegmatis - M szulgai + M terrae - M vaccae - M xenopi - *: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) *: CFP-10 (culture filtrate protein-10)

10 OPZIONI DEL TEST: 2 Provette (2P) 3 Provette (3P) Pazienti Clinici Screening di comunità - Bambini - Pazienti con sintomi specifici - TB non polmonare - Ricerca (monitoraggio terapia, etc.) 3 P - Operatori Sanitari: (Ospedali, Università, etc.) - Militari, Immigrati, Carcerati, etc. - Associazioni assistenziali governative e non, etc. - Personale viaggiante: (linee aeree, linee ferroviarie, trasporto pubblico urbano) - Servizio pubblico: (Polizia, Pompieri, Assistenti ambulanze, etc.) 2 P Pazienti Immunocompromessi - HIV/AIDS - Reumatologia e Dermatologia - Dialisi - Candidati a Trapianti - Pazienti con morbo di Chron Screening dei contatti - Personale reparti a rischio (pronto soccorso, etc.) - Ambienti familiari, di lavoro, etc. - Controllo sul territorio

11 QuantiFERON : 1 Step: Prelievo Dopo stimolazione: Plasma conservabile a 2-8 per 4 settimane

12 QuantiFERON : 2 Step: IFN-γ ELISA 50µl Coniugato + 50µl Plasma/Standard 120min. Incubazione TA Lavaggio 100ul TMB 30min. Incubazione TA 50ul Stop Lettura 450nm / nm Completamente automatizzabile, direttamente dal tubo primario Riproducibilità 99.3%

13 QuantiFERON : 3 Step: Calcolo dei risultati Disponibilità di Software dedicato: Test a 2 Provette Test a 3 Provette (valutazione della funzionalità immunitaria) Risultato Qualitativo: Negativo, Indeterminato, Positivo Risultato Quantitativo: IFN-γ UI/mL

14 Scenario of testing: 1,000 people and say 5% have true MTB infection. If we use the estimates of sensitivity and specificity for QFT, TST and T-Spot from Diel et al, Chest, 2010 which test is the most accurate? TEST PPV (%) NPV (%) Accuracy (%) QFT 84.8% 99.2% 98.5% T-Spot 25.4% 99.3% 86.4% QFT is far more accurate than either the TST or T-Spot.TB, providing the correct answer for 985 of the hypothetical 1,000 people (only 15 people incorrect)

15 GRAZIE PER L ATTENZIONE Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani IRCCS -Laboratorio di Immunologia Cellulare-