REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction)

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1 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI ( PCR =Polymerase Chain Reaction) Verso la metà degli anni 80, il biochimico Kary Mullis mise a punto un metodo estremamente rapido e semplice per produrre una quantità illimitata di copie della sequenza di un singolo gene. Questo metodo, chiamato PCR, è in grado di copiare sequenze di DNA che sono inizialmente presenti in quantità estremamente basse. L unica condizione è che si conosca, almeno in parte, la sequenza nucleotidica del gene che deve essere copiato. Con la PCR le 2 catene di un campione di DNA vengono separate ed incubate con la DNA Polimerasi (Taq Polimerasi, da Thermus acquaticus, stabile al calore), dntp e 2 Primer oligonucleotidici le cui sequenze sono complementari a quelle fiancheggiatrici del campione in esame. I primer, a partire dai quali la DNA Pol. inizia a sintetizzare le catene complementari, delimitano il frammento di DNA che deve essere studiato (DNA bersaglio). Ogni ciclo di questo processo raddoppia la quantità di DNA bersaglio e quindi, anche partendo da un unica copia di DNA, si ottiene un amplificazione geometrica. In Figura sono illustrate le varie fasi del processo.

2 La reazione utilizza la ripetizione di tre fasi che si svolgono a diverse temperature : fase 1) DENATURAZIONE: la sequenza di DNA stampo viene denaturata al calore mediante incubazione a 94 C al fine di ottenere la separazione delle catene. La fase dura 1-2 minuti fase 2) IBRIDAZIONE: in seguito al raffreddamento, i primers (o inneschi) si legano alle rispettive sequenze complementari sulle catene singole di DNA bersaglio. Questa

3 fase viene eseguita per 1-2 minuti ad una temperatura inferiore alla temperatura di denaturazione DNA stampo- Primer. La temperatura di ibridazione viene scelta quindi in base alla sequenza dei primers e si calcola mediante l applicazione di questa formula empirica: T= 2X(A+T) + 4 X (G+C) dove A, T, C, G, indicano il numero dei nucleotidi presenti nel primer fase 3) ESTENSIONE: la DNA polimerasi utilizza i dntps, presenti nella miscela di reazione, per allungare i primers ibridati usando come stampo la singola catena di DNA bersaglio. In questo modo avviene la sintesi della catena complementare. Per l'estensione viene utilizzata una temperatura di 72 C (temperatura ottimale per l attività enzimatica) per 1-3 minuti

4 La PCR viene realizzata utilizzando uno strumento chiamato termociclatore: questo strumento, opportunamente programmato, passa da una fase all altra modificando la temperatura della miscela d incubazione presente all interno della microprovetta. Pertanto, finito un primo ciclo di denaturazione, ibridazione ed estensione, lo strumento riporta la temperatura a 94 C per denaturare i frammenti appena formati e ripete il ciclo per un numero variabile di volte (in genere da 25 a 40) Venti cicli di PCR aumentano di circa 1 milione di volte (2 20 ) la sequenza bersaglio con grande precisione ed efficienza

5 Obiettivo della esercitazione: Verificare la eventuale presenza soia OGM a partire dai campioni di DNA estratto Procedimento per l amplificazione del DNA di soia estratto il 3/04/2008 e del DNA OGM CONCENTRAZIONE DEI COMPONENTI NELLA MISCELA PRESENTI NEL KIT JUMP START Accu Taq LA DNA POLIMERASE Mix Buffer 10 x : 20 mm Tris-HCl ph 7, mm KCl + 25 mm MgCl 2 dntp : miscela dei 4 dntp primers: 20 µm Taq DNA polimerasi: 0,75 µl = 1.2 Unità

6 PROCEDIMENTO In una provetta da microcentrifuga pipettare nel seguente ordine (il volume finale della miscela di reazione è di 25 µl) 1) H 2 O 10.7 µl 2) Buffer 10 x 2,5 µl 3) dntp 0,5 µl 4) primers OGM 0,5 µl 5) primers PSII 0,5 µl 6) DNA Soia 10µl (~ 0.2 µg) 7) Taq DNA polimerasi 0.3 µl PROCEDIMENTO amplificazione DNA SOIA OGM In una provetta da microcentrifuga pipettare nel seguente ordine (il volume finale della miscela di reazione è di 25 µl) 1) H 2 O 17.7 µl 2) Buffer 10 x 2,5 µl 3) dntp 0,5 µl 4) primers OGM 0,5 µl

7 5) primers PSII 0,5 µl 6) GMO-positive control DNA 3µl (~ 0.2 µg) 7) Taq DNA polimerasi 0.3 µl Pippettare all interno della microprovetta PCR l opportuna quantità di H 2 O, all interno di una microspinco sterile Continuare con l aggiunta dei successivi reattivi, spippettando di volta in volta al fine di miscelarli opportunamente. RICORDARSI DI CAMBIARE IL PUNTALE DOPO AVER PIPETTATO CIASCUN REATTIVO Dopo aver aggiunto l enzima Taq Polimerasi, chiudere la microspinco e picchiettare dolcemente il fondo Centrifugare mediante l opzione short spin Incubare in termociclatore col seguente file di amplificazione: 94 C 2 95 C 1 59 C 1 72 C 2 72 C cicli

8 Per la realizzazione dell esperimento, dopo aver preparato i campioni, questi andranno sistemati nel porta campioni del termociclatore. Quindi verranno attivati i vari cicli di amplificazione, con le seguenti condizioni sperimentali : fase 1) DENATURAZIONE: la sequenza di DNA stampo viene denaturata al calore mediante incubazione a 94 C fase 2) IBRIDAZIONE: in seguito al raffreddamento, i primers si legano alle rispettive sequenze complementari sulle catene singole di DNA bersaglio. La temperatura di ibridazione è di 59 C (questa temperatura è stata scelta in base alla sequenza dei primers utilizzati per questa reazione) fase 3) ESTENSIONE: la DNA polimerasi utilizza i dntps, presenti nella miscela di reazione, per allungare i primers ibridati usando come stampo la singola catena di DNA bersaglio. In questo modo avviene la sintesi della catena complementare. Per l'estensione viene utilizzata una temperatura di 72 C Si riporta la temperatura a 94 C per denaturare i piccoli frammenti appena formati e si ripete il ciclo (denaturazione per 40 volte) Al termine della PCR (4 esercitazione), i prodotti di amplificazione (5 µl) dovranno essere controllati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide

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