Determinazione dei microrganismi negli alimen1 Argomen( e obbie(vi

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1 Determinazione dei microrganismi negli alimen1 Argomen( e obbie(vi Necessità e problema0che nella determinazione dei microrganismi negli alimen0 Metodologie alterna0ve Principi - vantaggi e svantaggi applicazioni in ambito alimentare 516

2 Tecniche di biologia molecolare (PCR [±], coltura dipenden0/- indipenden0) Tecniche immunoenzima0che Tecniche basate su proprietà fisiologiche 517

3 Obbie0vo Rilevazione Numerazione (quan0ficazione) Iden0ficazione (0pizzazione) Monitoraggio (di specie o ceppi) 518

4 Strategia scelta in base a: Tipo di alimento Microrganismo o gruppo microbico ricercato (ruolo) Scopo dell analisi 519

5 Necessità - Richieste Accuratezza/Precisione Tempo Livello d informazione Automa0zzazione Costo Personale addestrato 520

6 Da considerare ancora: Difficoltà nella determinazione di microrganismi d interesse alimentare: - microrganismi difficili da col0vare su terreni di coltura (es. Campylobacter jejuni, virus) - microrganismi con danni subletali o vitali non col0vabili (VBNC)

7 Oltre alla microbiologia classica : - Approcci di determinazione dei microrganismi che bypassano fasi di col0vazione - Coltura - indipenden0 o dire^ - U0lizzano tecniche di biologia molecolare e analizzano il DNA (o RNA) dei microrganismi estra`o dire`amente dal campione

8 Analisi tradizionale Analisi dire`a Campione di alimento Arricchimento Terreni selettivi/differenziali Estrazione di acidi nucleici Isolamento di colonie sospe`e ID tradizionale ID molecolare Analisi DNA- rilevazione Analisi RNA- a^vità vitalità virulenza 523

9 DNA: molecola stabile Persiste anche dopo la morte cellulare RNA: molecola che viene degradata rapidamente Degradazione con la morte cellulare RNA (mrna, rrna): indicatore di vitalità 524

10 Metodi basa( sulla biologia molecolare Biologia molecolare: sviluppata negli ul0mi anni, in seguito alle scoperte rela0ve al materiale ereditario delle cellule e dei meccanismi di trasmissione delle informazioni gene0che Metodi basa0 sull analisi delle macromolecole delle cellule, sopra`u`o degli acidi nucleici Ampia applicazione delle metodiche di biologia molecolare con l invenzione della PCR PCR la base per diversi approcci diagnos0ci in ambito della 525 microbiologia degli alimen0

11 Pietre miliari biologia molecolare Inheritance of phenotypic traits DNA, hereditary material Structure of DNA 526

12 Modello Watson- Crick, 1953 Struttura tridimensionale del DNA Replicazione del DNA e trasferimento dell informazione genetica 527

13 Stru`ura di nucleo0de 528

14 Basi azotate 529

15 530

16 Polarità 531

17 Direzione Filamen0 an0- paralleli 532

18 Complementarità 533

19 Meccanismo di replicazione 534

20 Replicazione semi- conserva(va 535

21 PCR Polymerase Chain Reac0on (Reazione a catena della Polimerasi) Metodo di sintesi enzima(ca in vitro di sequenze specifiche di DNA 536

22 537

23 Fasi della reazione a catena della polimerasi Denaturazione Annealing dei primers Estensione 538

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35 Miscela di reazione Tampone di reazione (Tris- HCl 10 mm ph 8.4, 50 mm KCl) MgCl mm o maggiore dntps mm Primers mm Polimerasi UI / 50 μl rxn Target DNA 1 ng - 1 µg 550

36 Reazione PCR Thermal cycler (termociclatore) 551

37 Primer Design Lunghezza: bp Estremità 3 importante (contenuto in G/C) Contenuto in G+C: % Temperatura di mel0ng simile tra i due primers Evitare sequenze ripe00ve Evitare complementarità all interno o tra i primers 552

38 ONmizzazione della PCR Due parametri principali da o^mizzare: Temperatura di annealing Concentrazione di MgCl 2 Specificità (condizioni che perme`ono l amplificazione solo del target DNA) Efficienza (quan0tà di prodo`o PCR, rilevazione) 553

39 La rilevazione dei prodon PCR solitamente avviene arraverso elerroforesi in gel d agarosio 554

40 555

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42 557

43 Primers La 0pologia dei primers varia a seconda dello scopo della PCR per esempio: Primers specie- specifici Primers genere- specifici Primers universali Random primers La scelta dei primers è essenziale per la PCR (specificità ed efficienza) O^mizzazione 558

44 Applicazioni della PCR in microbiologia degli alimen( Applicazione coltura- dipendente: su colonie precedentemente isolate da matrici alimentari per: - iden(ficazione a livello di specie (primers specie- specifici) - cararerizzazione molecolare di isola0 (primers random) Applicazione coltura- indipendente: su DNA estra`o dire`amente da una matrice alimentare per la rilevazione di microrganismi (patogeni) 559

45 Analisi microbiologica tradizionale Pesatura Diluizione iniziale Omogeneizzazione Applicazione PCR coltura indipendente per rilevazione Incubazione Applicazione PCR coltura dipendente per l iden(ficazione Semina su terreni solidi Conta/Isolamento Identificazione/Conferma 560

46

47 Elettroforesi in gel d agarosio di prodotti PCR multiplex (reca per lattobacilli) L. paraplantarum L. pentosus L. plantarum

48 Geni usa0 come carareri diagnos(ci per l a`ribuzione della specie Per microrganismi patogeni: geni che codificano per farori di virulenza sono usa0 come cara`eri diagnos0ci Prova PCR posi(va: il microrganismo appar0ene alla specie patogena o nell alimento è presente il microrganismo patogeno 563

49 Applicazione coltura- indipendente PCR specie specifica

50 Applicazione coltura- indipendente PCR specie specifica

51 Applicazioni della PCR in microbiologia degli alimen( Vantaggi Notevole risparmio di tempo; tempi per la risposta rido^ (specialmente per patogeni) Iden0ficazione inequivocabile Rilevazione di mo VNC (u0lizzando RNA come target) Possibilità di dis0nguere rappresentan0 di una specie 566

52 Problema(che rela(ve all applicazione della PCR per la rilevazione di patogeni negli alimen( Sostanze iniben0 negli alimen0 o nei terreni di coltura u0lizza0 Numero basso di cellule microbiche target Specificità Sensibilità 567

53 Possibili soluzioni Diluire l alimento o il brodo colturale u0lizzato al fine di diluire l inibente Fasi di pre- arricchimento per incrementare il numero di cellule bersaglio Scegliere dei primers con target geni specifici del m.o ricercato U0lizzo di tecniche per la rivelazione dei prodo^ PCR più sensibili del e0dio bromuro in agarosio- concentrazione 568

54 Accorgimen0 Qualità del DNA (o RNA): importanza del protocollo usato per l estrazione del DNA Evitare contaminazioni da DNA estraneo - locali di laboratorio dedica0 alla preparazione della miscela PCR - Ruolo del personale - Puntali con filtro, cappe PCR, luce UV per la decontaminazione - Controlli che servono ad individuare contaminazioni 569

55 Estrazione del DNA Apertura delle cellule (differenze tra eucario0 e procario0, Gram +/- ) - metodi fisici (biglie, sonicazione) - metodi chimici (enzimi) - combinazione Purificazione del DNA (separazione dal resto del materiale cellulare e concentrazione) - si sfru`a le cara`eris0che fisicochimiche del DNA (e delle proteine) - reagen0 organici - colonnine (per affinità)

56 Quan0ficazione del DNA Si basa sull assorbanza a 260 nm (spe`rofotometria) Una soluzione di DNA di 50 ug/ml, ha un assorbanza di 1, misurata in una cuve`a di 1 cm di cammino Rapporto di assorbanza 260nm /assorbanza 280nm ; indicazione di purezza (valori tra considera0 buoni, valori so`o l 1.8, inpurezze di natura proteica)

57 qpcr Quan0ta0ve or Real Time PCR PCR quan0ta0va 572

58 qpcr Monitoraggio dell andamento della reazione PCR in tempo reale Rilevamento dei prodo^ PCR durante la reazione U0lizzo di fluorofori (che si associano ai prodo^ PCR) Strumen0 (termociclatori) che misurano la fluorescenza emessa in ogni ciclo della reazione 573

59 Fluorofori (fluorophores) 574

60 Emissione e detec(on della fluorescenza 575

61 Metodo rapido Contaminazione? Metodo quan(ta(vo qpcr 576

62 Principio qpcr 577

63 578

64 Quan(ficazione Retta di taratura (curva di calibrazione) Equazione: y=-αx+β x: concentrazione (ufc/g) del microrganismo y: valore C t 579

65 Chimica della qpcr Flurofori generici (intercalan0, SYBR Green) Sonde (oligonucleo0di) marcate con fluorofori 580

66 SYBR Green 581

67 Sonde ad idrolisi o TaqMan 582

68 Molecular beacons 583

69 Scorpion probes 584

70 Figure 1. Scorpion probing mechanism. Thelwell N et al. Nucl. Acids Res. 2000;28: by Oxford University Press 585

71 Applicazione della qpcr Quan0ficazione di microrganismi dire`amente in campioni d interesse alimentare Patogeni tecnologici (monitoraggio di fermentazioni) alteran0 Vantaggi della PCR tradizionale Quan0ficazione 586

72 587

73 588

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75 590

76 591

77 Considerazioni re`a di taratura specifica per: microrganismo e alimento importante: qualità di DNA (o RNA) estra`o dall alimento; o^mizzazione comparazione di risulta0 DNA/RNA/conta per valutare lo stato delle cellule del microrganismo ricercato 592

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