GENEQUALITY TAS QF-PCR v.2.0

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1 MANUALE D USO GENEQUALITY TAS QF-PCR v.2.0 cod R-25B Sistema per la diagnosi di trisomie dei cromosomi e di aneuploidie dei cromosomi sessuali GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

2 1 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO Destinazione d uso 4 2 CONTENUTO DEL KIT 5 3 CONSERVAZIONE E STABILITA DEI REAGENTI 6 4 PRECAUZIONI DI UTILIZZO 6 5 NORME DI SICUREZZA Norme di sicurezza generali Norme di sicurezza relative al prodotto 8 6 MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI Reagenti Strumentazione Materiali 9 7 INTRODUZIONE 10 8 PRINCIPIO DEL METODO 10 9 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO RACCOLTA, MANIPOLAZIONE E PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE Sangue Liquido amniotico, CVSs, cellule tissutali e saliva PROTOCOLLO Estrazione del DNA Amplificazione del DNA Analisi dei frammenti INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Analisi di alcuni esempi 21 2

3 13 PROVVEDIMENTI IN CASO DI PROBLEMI LIMITAZIONI DEL DISPOSITIVO PRESTAZIONI DEL DISPOSITIVO Specificità diagnostica Sensibilità diagnostica Specificità analitica BIBLIOGRAFIA 28 3 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

4 1 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO 1.1 Destinazione d uso Il kit GENEQUALITY TAS QF-PCR è un IVD per la determinazione di trisomie dei cromosomi e di aneuploidie sessuali mediante amplificazione multiplex con primer fluorescenti e successiva analisi dei frammenti di DNA su sequenziatore automatico. Marcatori amplificati: AMELX, AMELY, SRY, DXYS218, DXS6809, D13S797, D13S800, D18S390, D18S819, D18S51, D21S1409, D21S1437, TAF9L, DXS1187, D13S627, D13S628, D13S305, D18S391, D18S535, D21S1411, D21S1435 e D21S1442. Il dispositivo è destinato ad essere utilizzato in combinazione con altre procedure diagnostiche per suffragare o meno l ipotesi diagnostica. Il presente manuale è relativo al seguente prodotto: GENEQUALITY TAS QF-PCR Sistema per la diagnosi di trisomie dei cromosomi e di aneuploidie dei cromosomi sessuali. Include tutti i reagenti per l amplificazione del DNA con primer fluorescenti. Codice Prodotto Formato 04-25R-25B GENEQUALITY TAS QF-PCR 25 test Il prodotto è stato validato sugli strumenti Beckman-Coulter CEQ 8000 e CEQ

5 2 CONTENUTO DEL KIT BOX F* CONSERVAZIONE A 30 C/ 20 C DESCRIZIONE ETICHETTA COLORE PROVETTA (P) o TAPPO 25 test 5 test Miscela di amplificazione della Multiplex 1 Miscela di amplificazione della Multiplex 2 DNA di riferimento (20 ng/µl) Master Mix 1 Verde 2 X 220 µl 1 X 50 µl Master Mix 2 Bianco 2 X 220 µl 1 X 50 µl DNA di controllo Blu 30 µl 10 µl 5 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

6 3 CONSERVAZIONE E STABILITA DEI REAGENTI Ciascuna parte del kit deve essere conservata secondo le indicazioni riportate nell etichetta della scatola. In particolare: Box F* Conservare a 30 C/ 20 C Se conservati alle temperature indicate, i componenti del kit sono stabili fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. I reagenti Master Mix 1 e 2 sono sensibili al cambiamento di stato fisico: si raccomanda di non sottoporli a più di due cicli di congelamento/scongelamento. Nel caso di sedute analitiche poco numerose, sarà opportuno aliquotare tali soluzioni. Inoltre entrambe le miscele contengono molecole fluorescenti: si raccomanda di conservare tali reagenti al riparo dalla luce. 4 PRECAUZIONI DI UTILIZZO Il prodotto deve essere utilizzato esclusivamente in vitro da personale opportunamente addestrato e istruito in merito alle tecniche di biologia molecolare applicate alla diagnostica; Prima dell utilizzo del dispositivo, leggere attentamente il manuale d uso in tutte le sue parti; Tenere il dispositivo lontano dalle fonti di calore; Deve essere prestata particolare attenzione alla data di scadenza riportata nell etichetta di ciascuna scatola del kit: non utilizzare i componenti dopo la data di scadenza; I reattivi presenti in ogni kit sono da considerarsi una unità indivisibile. Non frazionare o utilizzare reattivi appartenenti a kit di lotto diverso; Prestare particolare attenzione alle quantità di ciascun reagente utilizzate per il saggio e alle temperature e condizioni specificate nel manuale d uso. In caso di errori il test non potrà essere considerato attendibile; 6

7 Dopo l estrazione conservare il DNA a +2 C/+8 C per breve tempo o a 30 C/ 20 C per tempi più prolungati; Proteggere le miscele di amplificazione contenenti i primer marcati con fluorocromi non esponendoli alla luce diretta durante le varie fasi del test; I reagenti di amplificazione vanno scongelati a temperatura ambiente prima dell utilizzo; l allestimento della reazione di amplificazione e l aggiunta del DNA estratto devono essere fatti velocemente a temperatura ambiente oppure, meglio, in ghiaccio; Evitare durante il pipettamento della miscela di amplificazione la formazione di bolle. In caso di dubbi sulla corretta conservazione del prodotto o sull integrità della confezione, prima dell utilizzo contattare il servizio tecnico di AB ANALITICA L utilizzatore di tecniche di amplificazione degli acidi nucleici deve inoltre prestare attenzione alle seguenti indicazioni: Utilizzare puntali con filtro; Conservare i campioni biologici da testare, i DNA estratti e tutti i prodotti amplificati in luogo separato dai reagenti di amplificazione; Organizzare una suddivisione degli ambienti pre- e post-amplificazione; non far circolare attrezzature e consumabili (pipette, provette, puntali, etc) da un ambiente all altro; Cambiarsi regolarmente i guanti; Pulire le superfici di lavoro con ipoclorito di sodio al 5%. 5 NORME DI SICUREZZA 7 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

8 5.1 Norme di sicurezza generali Indossare guanti monouso nel manipolare reagenti chimici e campioni clinici e lavarsi le mani una volta terminato il lavoro; Non pipettare con la bocca; Poiché nessun metodo diagnostico conosciuto può assicurare l assenza di qualsiasi agente infettivo, è buona norma considerare ogni campione clinico come potenzialmente infetto e trattarlo come tale; Tutti i dispositivi venuti in contatto direttamente con i campioni clinici devono essere considerati come contaminati e smaltiti come tali. In caso di fuoriuscita accidentale del campione, pulire con ipoclorito di sodio al 10%. Il materiale usato per pulire deve essere smaltito in un contenitore per residui contaminati; Campioni clinici, materiali e prodotti contaminati devono essere smaltiti dopo decontaminazione: immersione in soluzione di ipoclorito di sodio al 5% (1 volume di soluzione di ipoclorito di sodio al 5% ogni 10 volumi di fluido contaminato) per 30 minuti; OPPURE autoclavaggio a 121 C per minimo 2 ore (NB: non autoclavare soluzioni contenenti ipoclorito di sodio!!) 5.2 Norme di sicurezza relative al prodotto I pericoli derivanti dall uso di questo prodotto sono quelli associati ai singoli componenti. Componenti pericolosi: nessuno. La scheda di sicurezza del kit è disponibile su richiesta. 8

9 6 MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI 6.1 Reagenti Reagenti per l estrazione del DNA; Acqua sterile DNasi e RNasi free; Olio Minerale (laddove il termociclatore lo richieda); Sample Loading Solution (SLS); DNA size standard adeguato. 6.2 Strumentazione Cappa a flusso laminare (se ne consiglia l utilizzo nella fase di allestimento della mix di amplificazione per evitare contaminazioni; può essere utile inoltre l utilizzo di un'altra cappa del medesimo tipo nella fase di aggiunta del DNA estratto); Micropipette (range: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl; µl); Termociclatore; Microcentrifuga (max rpm); Vortex; Spettrofotometro; Sequenziatore Automatico. Il prodotto è stato validato sugli strumenti Beckman-Coulter CEQ 8000 e CEQ 8800 e risulta potenzialmente compatibile con sequenziatori in grado di leggere i fluorofori D2, D3 e D Materiali Guanti monouso; Puntali sterili con filtro per micropipette (range: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl; µl); Microprovette thin wall da amplificazione (0,2 ml o 0,5 ml); Provette tipo eppendorf (volume 1,5-2 ml). 9 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

10 7 INTRODUZIONE Le anomalie cromosomiche si possono distinguere in due gruppi: anomalie numeriche e di struttura. Tali alterazioni (numeriche o strutturali) vengono riscontrate in circa 1:200 nati e costituiscono un importante causa di difficoltà nel normale sviluppo e di malformazioni congenite nell uomo (Brigitte H.W. et al., 2011). D altra parte una qualsiasi anomalia del cariotipo umano normale (46,XX e 46,XY) ha come conseguenza una patologia di gravità variabile. Questo tipo di alterazioni sono generalmente il risultato di errori durante la gametogenesi (non-disgiunzione dei cromosomi omologhi o rotture cromosomiche seguite da una riorganizzazione degli stessi in combinazioni anomale), ma possono verificarsi anche al momento della fecondazione o nelle prime fasi dello sviluppo embrionale. A livello fetale le più comuni (80% del totale) sono le aneuploidie che interessano i cromosomi 21, 18, 13, X ed Y. Le prime tre possono dare origine ad un corredo cromosomico soprannumerario che va sotto il nome di trisomia e vengono definite comunemente sindromi. In particolare la trisomia del cromosoma 21 è denominata sindrome di Down, quella del 18 sindrome di Edwards e quella del 13 sindrome di Patau. Per quanto riguarda i cromosomi sessuali, X ed Y, la situazione è diversa. In questi casi, infatti, l alterazione consiste nella perdita o nell aggiunta di uno dei due cromosomi rispetto all assetto normale XX che caratterizza il sesso femminile od XY proprio di quello maschile. Si vengono così a formare assetti cromosomici atipici quali la monosomia del cromosoma X denominata sindrome di Turner, XXY sindrome di Klinefelter, XXX ed XYY. Tra le aneuploidie sopra descritte, le trisomie 21, 18 e 13 sono senz altro quelle maggiormente responsabili di malformazioni fetali che portano a gran parte degli aborti precoci durante il primo trimestre di gravidanza. 8 PRINCIPIO DEL METODO L assetto cromosomico del campione analizzato viene determinato mediante una innovativa strategia molecolare di amplificazione enzimatica in vitro del DNA denominata QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction, Adinolfi et al., 1995; Adinolfi et al., 1997). 10

11 Il metodo si basa sull'amplificazione con primer fluorescenti di brevi sequenze di DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (denominati STRs, short tandem repeats). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. La loro natura polimorfica, dovuta al diverso numero di repeats presenti per ciascun locus dato, genera alleli di differente lunghezza. Il segnale di fluorescenza che si ottiene dall amplificazione di tali sequenze è direttamente proporzionale alla quantità di target presente nel templato iniziale. Con l utilizzo di marcatori specifici per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile quindi diagnosticare le aneuploidie più frequenti; il sesso del feto viene inoltre individuato utilizzando i marcatori non-polimorfici Amelogenina (AmelX/Y) che dà prodotti di amplificazione di lunghezza diversa rispettivamente sui cromosomi X ed Y ed il marcatore SRY (specifico per il cromosoma Y). Inoltre l utilizzo del marker paralogo TAF9L (che amplifica sia sul cromosoma X che sul cromosoma 3) è un ulteriore ausilio per la determinazione del corretto assetto dei cromosomi sessuali. Utilizzando per questa reazione dei primer marcati con fluorocromi diversi, è possibile analizzare i prodotti amplificati con un unica corsa di elettroforesi capillare. Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in ore (Hills A et al., 2010). 9 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO Per identificare campioni con trisomia od aneuploidie sessuali, questo sistema diagnostico prevede l allestimento di 2 amplificazioni multiplex in grado di analizzare 21 marcatori microsatelliti in un unico saggio. Alle master mix fornite, previo opportuno aliquotamento, dovrà essere aggiunto il DNA da testare. In accordo con le linee guida QF-PCR for the Diagnostic of Aneuploidy Best Practice Guidelines 2012 v3.01 sono state scelte STRs la cui eterozigosità media fosse piuttosto elevata, ovvero intorno al 70-80%; sono stati inoltre preferiti marcatori tetranucleotidici, poiché viene ridotta la presenza di stutter nell elettroforesi capillare, causa spesso di difficile interpretazione degli elettroferogrammi. 11 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

12 I primer per l amplificazione sono stati disegnati in modo da non avere omologia con sequenze ripetute di DNA, SNPs ed in modo da non formare dimeri tra loro. Ogni primer forward è stato marcato all estremità 5 con un fluoroforo scelto tra D2, D3 e D4, compatibili con sequenziatore Beckman-Coulter. Il materiale di partenza per l analisi è costituito da liquido amniotico, villi coriali o sangue fetale. E sempre necessario testare, parallelamente al campione del paziente, anche il DNA di riferimento in modo da comparare le dimensioni dei frammenti di amplificazione ottenuti. Il DNA, estratto da villi coriali, liquido amniotico o sangue fetale e quello del controllo di riferimento, verrà sottoposto alle 2 reazioni di amplificazione multiplex utilizzando lo stesso profilo termico. I campioni amplificati dovranno essere caricati su un sequenziatore automatico per individuarne le dimensioni. La presenza di trisomie dei cromosomi e di aneuploidie sessuali potrà essere valutata esclusivamente per confronto tra le dimensioni degli amplificati del campione e quelle degli amplificati del DNA di riferimento. Il kit include un controllo positivo di amplificazione rappresentato da un DNA di riferimento (DNA di controllo). Il buon esito dell amplificazione del DNA di riferimento (presenza di tutti gli amplificati attesi) è garanzia del corretto funzionamento della reazione. Tale DNA è di origine umana, ma non costituisce fonte di alcun pericolo per l operatore. 12

13 10 RACCOLTA, MANIPOLAZIONE E PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE Generalmente l indagine per l identificazione di trisomie cromosomiche ed aneuploidie sessuali mediante QF-PCR viene condotta su campioni di DNA derivanti da varie tipologie di campioni clinici quali liquido amniotico, villi coriali, sangue fetale, cellule tissutali e saliva. Il kit GENEQUALITY TAS QF-PCR è stato testato su DNA estratto a partire da liquido amniotico, villi coriali e sangue fetale. Al fine di evitare errori di interpretazione del risultato è fondamentale rimuovere dalla coltura cellulare, derivante da liquido amniotico o da villi coriali, ogni contaminazione con cellule o tessuti materni, che potrebbero interferire con la diagnosi prenatale in QF-PCR Sangue Il prelievo viene eseguito come di routine, osservando tutte le opportune precauzioni di sterilità. Il sangue deve essere trattato con EDTA. Altri coagulanti, come ad es. l eparina, sono potenti inibitori della DNA polimerasi e potrebbero quindi alterare l efficienza della reazione di amplificazione. Il sangue fresco può essere conservato per breve tempo a +2 C/+8 C; se non si procede subito con l estrazione del DNA è quindi necessario congelare il campione Liquido amniotico, CVSs, cellule tissutali e saliva. Il prelievo viene effettuato come di routine. Per eseguire le indagini molecolari, il DNA viene estratto da una quantità esigua di liquido amniotico (pari a 1,5 ml) o di villi coriali (previa coltura cellulare) che possono essere conservati a +2 C/+8 C non oltre le 24 ore. E opportuno centrifugare il campione: al pellet così ottenuto andrà addizionata la matrice di estrazione secondo le istruzioni riportate dal produttore nel manuale d uso del kit di estrazione. 13 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

14 11 PROTOCOLLO 11.1 Estrazione del DNA Per l estrazione del DNA, AB ANALITICA consiglia l utilizzo del kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN) o del kit InstaGene matrix (Bio-Rad), con i quali il prodotto GENEQUALITY TAS QF-PCR Kit è stato standardizzato. Seguire per ciascuna applicazione il protocollo più appropriato, così come consigliato dal produttore. Può essere in ogni caso utilizzato un altro metodo di estrazione, purché consenta l isolamento di un DNA integro e puro. Il DNA ottenuto dovrà quindi essere quantificato allo spettrofotometro. La quantità di DNA da utilizzare in ogni amplificazione multiplex è pari a ng. È importante che, indipendentemente dal materiale di partenza, si utilizzi una procedura di estrazione del DNA che permetta di ottenere concentrazioni di DNA il più possibile simili tra loro, in modo che la QF-PCR possa essere eseguita nella stessa seduta nelle medesime condizioni. Per ulteriori informazioni o approfondimenti sui protocolli di estrazione utilizzabili contattare il supporto tecnico di AB ANALITICA via fax ( ) o linea telefonica (tel ) Amplificazione del DNA ATTENZIONE: E necessario che, per una corretta comparazione tra DNA del campione e DNA di riferimento, il quantitativo iniziale di DNA introdotto nella reazione di amplificazione sia sovrapponibile. Di conseguenza è fortemente consigliato ricorrere ad uno spettrofotometro per quantificare con buona approssimazione il DNA estratto. Una volta scongelati, miscelare i reagenti vortexando le provette, quindi sottoporli a breve centrifugazione. Allestire velocemente la reazione a temperatura ambiente oppure lavorare in ghiaccio o su blocco di raffreddamento. Avere cura, per quanto possibile, di lavorare al riparo dalla luce diretta. Preparare, secondo quanto riportato in tabella 1, una mix sufficiente per il numero di campioni che si intende analizzare, conteggiando anche il caricamento del controllo positivo e del controllo negativo, in cui viene 14

15 aggiunta H 2 O anziché DNA, e considerando inoltre un eccesso corrispondente almeno ad un volume di reazione. Aliquotare la miscela preparata in provette da 0,2 o 0,5 ml, nelle quali verrà successivamente aggiunta un quantità di DNA pari a circa ng. Multiplex1 Volume Multiplex2 Volume Master Mix 1 17 µl Master Mix 2 17 µl DNA estratto ng DNA estratto ng Acqua sterile q.b.a 25 µl Acqua sterile q.b.a 25 µl Volume finale 25 µl Volume finale 25 µl Tab.1 Se il termociclatore lo richiede, aggiungere due gocce di olio minerale. E opportuno amplificare sempre, con i campioni da analizzare, anche un controllo negativo (ad una delle mix va aggiunta acqua sterile al posto del DNA) e un controllo positivo (il DNA di riferimento incluso nel kit oppure DNA genomico precedentemente testato). Centrifugare brevemente le provette. Porre le microprovette nel termociclatore così programmato: 1 ciclo 95 C 2 min 26 cicli 95 C 59 C 72 C 30 sec 90 sec 30 sec 1 ciclo 60 C 30 min storage 10 C 15 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

16 11.3 Analisi dei frammenti Per l analisi dei frammenti, sarà necessario effettuare una corsa per ciascuna multiplex, quindi un totale di 2 elettroforesi capillari per ciascun paziente. E consigliabile effettuare anche l analisi del controllo negativo, per verificare di non avere introdotto eventuali contaminazioni durante la fase di allestimento dell amplificazione dei campioni. La distribuzione dei marcatori nelle due multiplex è riportata in tabella 2. Marker Multiplex Marcatura AMELX 1 D2 AMELY 1 D2 SRY 1 D2 DXYS218 1 D2 DXS D2 D13S797 1 D4 D13S800 1 D4 D18S390 1 D3 D18S819 1 D3 D18S51 1 D3 D21S D3 D21S D4 TAF9L 2 D3 DXS D3 D13S627 2 D4 D13S628 2 D4 D13S305 2 D2 D18S535 2 D4 D18S391 2 D2 D21S D2 D21S D4 Tab.2 D21S D3 16

17 Caricare un aliquota dei prodotti di amplificazione rispettando quanto descritto nelle istruzioni d uso del sequenziatore automatico. Si consiglia di caricare 2 µl di amplificato in 37,5 µl totali di Sample Loading Solution (SLS) (materiale non fornito) e 0,5 µl di size standard adeguato (materiale non fornito) per ciascuna elettroforesi capillare. E necessario riferirsi al manuale del sequenziatore automatico per la scelta degli opportuni reagenti compresa la matrice di corsa e il tampone relativo, e delle condizioni piu indicate al fine di ottimizzare la lettura finale. 17 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

18 12 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Se i controlli inseriti (DNA di riferimento e controllo negativo) hanno dato il risultato atteso, ovvero presenza di almeno una picco per ciascun marker analizzato per il controllo positivo ed assenza di picchi nell elettroforesi capillare nel range compreso tra 110 e 460 bp, per quello negativo, l interpretazione dei risultati è da intendersi come di seguito riportato. Effettuare una comparazione di ciascun frammento tra il DNA di riferimento e quello del paziente, basandosi sull indicazione del peso molecolare di ciascun amplificato riferendosi alla tabella 3, per verificare il corretto numero di copie di ciascun cromosoma. Marker Multiplex Cromosoma Lunghezza bp* Marcatura AMELX 1 AMELY 1 SRY 1 DXS Xp22.2_11,311,533-11,318, D2 Yp11.2_6,733,959-6,742, D2 Yp11.31_2,654,896-2,655, D2 Xq21.33_94,838,089-95,038, D2 DXYS218 1 Xp22.32 Yp D2 D13S797 1 D13S800 1 D18S390 1 D18S819 1 D18S51 1 D21S D21S TAF9L 2 DXS D13S627 2 D13S628 2 D13S q33.2_106,032, ,232, D4 13q22.1_73,774,649-73,975, D4 18q22.3_69,276,580-69,476, D3 18q11.2_24,085,275-24,285, D3 18q21.33_60,848,678-61,049, D3 21q21.2_24,248,717-24,449, D3 21q21.1_21,546,683-21,747, D4 chr3_ chrx_ D3 Xq26.2_130,933, ,133, D3 13q32.1_96,069,504-96,269, D4 13q31.1_85,586,216-85,786, D4 13q13.3_36,925,870-37,126, D2 18

19 Tab.3 D18S391 2 D18S535 2 D21S D21S D21S p11.31_5,681,022-5,881, D2 18q12.2_38,048,775-38,249, D4 21q22.3_44,060,644-44,261, D2 21q21.3_27,748,841-27,949, D4 21q21.3_28,718,455-28,918, D3 *La lunghezza dei frammenti e puramente indicativa e si basa sugli alleli maggiormente frequenti. Esistono varianti che possono avere valori esterni rispetto al range riportato. Di seguito vengono riportate le tipologie di pattern allelico riscontrabili in seguito all amplificazione mediante QF-PCR e successiva elettroforesi capillare dei marcatori microsatelliti utilizzati. Pattern allelico normale: evidenziato dalla presenza di due picchi fluorescenti equivalenti (eterozigosi) che presentano un area ed un altezza di picco sovrapponibile (rapporto diallelico 1:1). Eterozigote normale 1:1 Pattern allelico non informativo: presenza di un solo picco fluorescente per ogni locus polimorfico testato. L impiego di più marcatori con un alto indice di eterozigosità per ciascun cromosoma porta ad una frequenza molto bassa del pattern allelico non informativo (unico picco) per tutti i loci investigati. 19 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

20 Omozigote non informativo Pattern allelico trisomico: evidenziato dalla presenza di tre picchi fluorescenti equivalenti (rapporto triallelico 1:1:1) che presentano un area ed un altezza di picco sovrapponibile; oppure due picchi fluorescenti di area ed altezza differente (picchi sbilanciati, i valori di uno dei quali circa il doppio dell altro) corrispondenti rispettivamente al prodotto di amplificazione di due alleli uguali ed uno diverso (rapporto diallelico 2:1 o 1:2). Trisomia triallelica 1:1:1 Trisomia diallelica 2:1 Per ulteriori informazioni relative all interpretazione dei risultati si rimanda alle Best practice guidelines for QF-PCR, reperibili al sito 20

21 12.1 Analisi di alcuni esempi Di seguito vengono presentati alcuni esempi relativi rispettivamente ad un pattern allelico normale e ad uno patologico. TAF9L3 DXS1187 D21S1442 D13S627 D13S628 D21S1435 D18S391 D21S1411 D13S305 In questa immagine, relativa alla multiplex 2, si può osservare un pattern biallelico normale, in cui la maggior parte dei microsatelliti sono rappresentati in eterozigosi. Trisomia 21 - D21S1442 D21S GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

22 D21S1435 In questo esempio, relativo alla medesima multiplex della figura precedente, è evidenziata la presenza di un pattern trisomico triallelico con rapporto 1:1:1 per i marcatori D21S1442 e D21S1411 e di un pattern trisomico diallelico 1:2 per il marcatore D21S1435. Tale situazione conferma la presenza nell individuo investigato di una trisomia del cromosoma 21 nota come sindrome di Down. Trisomia 18 D18S51 D18S390 D18S819 22

23 D18S535 D18S391 In questo esempio, viene evidenziata la presenza di un pattern trisomico triallelico con rapporto rispettivamente 1:1:1 per i marcatori D18S391 e D18S819, diallelico 1:2 per i marcatori D18S390 e D18S51 e diallelico 2:1 per il marcatore D18S535. Tale situazione è indicativa della presenza nell individuo investigato di una trisomia del cromosoma 18 nota come sindrome di Edwards. 23 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

24 13 PROVVEDIMENTI IN CASO DI PROBLEMI 1. Segnale troppo debole dopo l elettroforesi capillare. Il DNA utilizzato per l amplificazione era degradato Procedere con una nuova estrazione. Il DNA utilizzato per l amplificazione conteneva degli inibitori della reazione di amplificazione Utilizzare un sistema di estrazione adeguato. Il DNA estratto conteneva K+, Na+, Mg 2 + o EDTA: questi reagenti possono influenzare negativamente l efficienza di amplificazione Utilizzare un adeguato sistema di estrazione; Ripetere l estrazione e l amplificazione del DNA. La quantità di DNA amplificata risulta troppo esigua Accertarsi di aver accuratamente quantificato il DNA estratto allo spettrofotometro. Vi era un elevata concentrazione di sali nell amplificato Diluire l amplificato prima del caricamento. Non è stato programmato correttamente il termociclatore controllare che il programma selezionato nel termociclatore corrisponda a quello indicato nel manuale d uso, quindi ripetere l amplificazione con il programma corretto. 2. Segnale troppo intenso, elevata presenza di stutter o disomogeneità tra i diversi picchi dopo l elettroforesi capillare. La quantità di DNA amplificata risulta eccessiva 24

25 Accertarsi di aver accuratamente quantificato il DNA estratto allo spettrofotometro; Diluire 1:10 l amplificato in acqua sterile. Per qualsiasi ulteriore problema o questione, contattare il supporto tecnico di AB ANALITICA via fax ( ) o linea telefonica (tel ). 25 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

26 14 LIMITAZIONI DEL DISPOSITIVO Il kit può avere delle prestazioni ridotte qualora: il campione clinico non sia idoneo all indagine; ad es. il sangue deve necessariamente essere trattato con EDTA. Altri anticoagulanti, come ad es. l eparina, sono potenti inibitori dell attività enzimatica della Taq polimerasi e potrebbero quindi alterare l efficienza della reazione di amplificazione. il DNA risulti non amplificabile (per presenza di inibitori della reazione di amplificazione o inadeguata scelta del sistema di estrazione); il kit non sia stato conservato alla temperatura consigliata e segnalata nell imballo. sia presente mosaicismo cellulare; il dispositivo infatti non è in grado di discriminare la presenza di più linee cellulari nello stesso campione per cui si consiglia, qualora tale situazione fosse sospettata a carico dei cromosomi indagati con questo kit, di confermarne il risultato mediante analisi citogenetica. sia presente contaminazione da cellule materne; la presenza di due genotipi nello stesso campione indica la presenza della suddetta contaminazione che inficia la corretta interpretazione del risultato dell analisi; per tale motivo si consiglia di testare parallelamente un campione di sangue materno. 26

27 15 PRESTAZIONI DEL DISPOSITIVO 15.1 Specificità diagnostica Campioni selezionati per negatività alle trisomie nei cromosomi e alle aneuploidie sessuali sono stati testati con il kit GENEQUALITY TAS QF- PCR e contemporaneamente con altro CE IVD o metodica di riferimento. I risultati ottenuti hanno consentito di calcolare una specificità diagnostica del 100% Sensibilità diagnostica Campioni selezionati per positività alle trisomie nei cromosomi e alle aneuploidie sessuali sono stati testati con il kit GENEQUALITY TAS QF- PCR e contemporaneamente con altro CE IVD o metodica di riferimento. I risultati ottenuti hanno consentito di calcolare una sensibilità diagnostica del 100% Specificità analitica L utilizzo del set minimo di STRs suggerite dalle Linee Guida QF-PCR for the Diagnostic of Aneuploidy Best Practice Guidelines 2012 v.3.01 garantisce l identificazione delle trisomie dei cromosomi e delle aneuploidie sessuali; inoltre i primer scelti per l amplificazione di ciascun marcatore sono stati studiati in modo da non amplificare tratti ripetuti del cromosoma e l allineamento delle loro sequenze nelle più comuni banche dati ha rivelato l assenza di appaiamenti aspecifici. 27 GQ-TAS_QF-PCR_v.2.0_manuale_i docx

28 16 BIBLIOGRAFIA Adinolfi M, Pertl B, Sherlock J. Rapid detection of aneuploidies by microsatellite and the quantitative fluorescent polymerase chain reaction. Prenat Diagn 1997; 17: Adinolfi M, Sherlock J, Pertl B. Rapid detection of selected aneuploidies by quantitative fluorescent PCR. Bioessays 1995; 17: Hills A, Donaghue C., Waters J., Waters K., Sullivan c., Kulkarni A., Docherty Z., Mann K. and Mackie Ogilvie C. QF-PCR as a stand-alone test for prenatal samples: the first 2 years experience in the London region. Prenat Diagn 2010; 30: H.W. Faas B., Cirigliano V., Bui T-H. Rapid methods for targeted prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine 2011; 16: Linee guida QF-PCR for the Diagnostic of Aneuploidy Best Practice Guidelines 2012 v

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