REFERENTE SCIENTIFICO: Dr.ssa Claudia Virno Lamberti ICRAM Roma

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1 Sezione Provinciale di Ferrara Corso Giovecca, Ferrara Tel. 0532/ Fax 0532/ TEST DI EMBRIOTOSSICITA CON MOLLUSCHI BIVALVI: MESSA A PUNTO DELLA METODOLOGIA CON Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas, Tapes philippinarum E VERIFICA DELLA SENSIBILITA DEI SAGGI A RAME E GLICOL DIETILENICO REFERENTE SCIENTIFICO: Dr.ssa Claudia Virno Lamberti ICRAM Roma AUTORI: Federica Savorelli ICRAM Roma; Fernando Gelli, Donatella Palazzi, Pier Luigi Trentini ARPA ER sez. di Ferrara; Laura Pantaleoni, David Pellegrini ICRAM Roma; Simone Modugno, Laura Pregnolato Università di Ferrara. Paolo Melotti, Alessandra Roncarati Università di Bologna

2 INDICE: PREMESSA pag.4 PROGRAMMA OPERATIVO pag.5 INTRODUZIONE pag. 6 L ecotossicologia pag. 6 I saggi di tossicità in ecotossicologia pag. 7 I saggi di tossicità acquatica pag. 8 Il saggio ecotossicologico con embrioni e larve di molluschi bivalvi pag. 9 La tossicità ambientale del rame pag. 10 Il glicol dietilenico pag. 11 OBIETTIVI pag. 12 MATERIALI E METODI Scelta dei riproduttori e stabulazione pag. 13 Saggio embriotossicologico con Mytilus galloprovincialis La produzione dei gameti pag. 17 La fecondazione dei gameti pag. 20 L incubazione degli embrioni pag. 21 Lettura dei campioni pag. 22 Analisi dei dati pag. 26 Accettabilità del test pag. 26 Tabella riassuntiva pag. 27 Saggio embriotossicologico con Crassostrea gigas La produzione dei gameti pag. 28 La fecondazione dei gameti pag. 30 L incubazione degli embrioni pag. 31 Lettura dei campioni pag. 31 Analisi dei dati pag. 32 Accettabilità del test pag. 32 Tabella riassuntiva pag. 33 Saggio embriotossicologico con Tapes philippinarum La produzione dei gameti pag. 34 La fecondazione dei gameti pag. 36 L incubazione degli embrioni pag. 37 2

3 Lettura dei campioni pag. 38 Analisi dei dati pag. 41 Accettabilità del test pag. 41 Tabella riassuntiva pag. 42 RISULTATI E DISCUSSIONE pag. 43 CONCLUSIONI pag. 49 BIBLIOGRAFIA pag. 50 3

4 PREMESSA ARPA ER Ferrara ed ICRAM, dopo un ampia ricognizione su gli organismi impiegabili per l esecuzione di saggi di embriotossicità, hanno individuato nel mitilo (Mytilus galloprovincialis), nell ostrica concava (Crassostrea gigas) e nella vongola filippina (Tapes philippinarum) alcune specie di molluschi adatte allo svolgimento di test in ambiente marino e salmastro. Questi bivalvi, ad esclusione di Tapes philippinarum, sono organismi prescelti dall EPA per la stesura delle metodiche in tema di embriotossicologia in acque marine. Le sperimentazioni che sono state realizzate nell anno di attività del presente progetto si sono basate su due presupposti: 1) che indicazioni importanti sulla sensibilità di Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas e Tapes philippinarum a sostanze di riferimento siano fondamentali ai fini della eventuale validazione dei metodi; 2) che la scelta di sviluppare le attività di ricerca finalizzate al controllo delle acque marine e dei sedimenti utilizzando queste specie di molluschi è riconducibile alla possibilità di riprodurre tali organismi in condizioni controllate. Pertanto, parallelamente alla messa a punto dei saggi embriotossicologici, sono state avviate prove per ottimizzare le tecniche di riproduzione indotta dei molluschi, affinché risultino di agevole attuazione in condizioni di laboratorio. Questa sperimentazione è stata condotta in stretta collaborazione con i partner dell ICRAM di Roma, della Regione Emilia-Romagna (in particolare per lo studio su T. philippinarum), dell Università di Ferrara e dell Università di Bologna. Tali ricercatori hanno fornito supporto tecnico-scientifico in merito agli aspetti biologici ed ecotossicologici, mentre per gli aspetti attinenti la riproduzione indotta dei molluschi ci si è avvalsi della consulenza del Dr. Edoardo Turolla del Centro Ricerche sui Molluschi di Goro (FE). 4

5 PROGRAMMA OPERATIVO In data 1 maggio 2005, hanno avuto inizio le attività inerenti il progetto di ricerca Test di embriotossicità con molluschi bivalvi. La sperimentazione, della durata di un anno, aveva le seguenti finalità: realizzare un impianto per il mantenimento dei molluschi Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas e Tapes philippinarum in condizioni controllate; applicare metodi efficaci per indurre i riproduttori all emissione di gameti; avviare l esecuzione di test ecotossicologici mediante l impiego di embrioni di Mytilus galloprovincialis e Crassostrea gigas applicando metodi standardizzati esistenti; mettere a punto una metodologia originale di saggio sui primi stadi vitali di Tapes philippinarum. Sostanze da testare: rame e glicol dietilenico. 5

6 INTRODUZIONE Per una rapida e corretta valutazione della qualità biologica degli ambienti acquatici, si va sempre più diffondendo l uso di indicatori biologici in associazione agli indicatori chimico-fisici, poiché spesso concentrazioni inferiori a quelle misurabili attraverso le normali tecniche di analisi danno conseguenze a livello biologico, ed inoltre sostanze tossiche ed altre sorgenti di stress, se si presentano in modo sinergico, possono produrre sugli organismi viventi effetti diversi da quelli che produrrebbero se presenti singolarmente. Gli indicatori biologici sono risposte biologiche in grado di stimare o di prevedere gli effetti di varie cause di stress sull ambiente. Tali indicatori sono generalmente riferiti a specifiche comunità biologiche, ad esempio alla fauna ittica, ai molluschi, alle comunità macrozoobentoniche, ed alla distribuzione del fitoplancton e della vegetazione acquatica. Gli indicatori biologici possono essere suddivisi in: Indicatori ecologici (ad esempio: gli indici biotici delle acque e la diversità di specie); Indicatori tossicologici (ad esempio: indicatori di bioaccumulo e test di tossicità). L ecotossicologia L ecotossicologia, disciplina ambientale di origine recente, è stata definita nel 1969 da Truhaut, come una branca della tossicologia, derivante dall incontro dell ecologia (studio scientifico delle interazioni biotiche e abiotiche che determinano la distribuzione degli organismi viventi) con la tossicologia classica (studio degli effetti dannosi delle sostanze sull uomo). Questa nuova disciplina ha come obbiettivo lo studio, mediante metodo scientifico, del destino e degli effetti dei contaminanti nell ambiente, non limitandosi solo all osservazione ed alla descrizione dei fenomeni, ma elaborando anche previsioni (Vighi et al., 1998). L ecotossicologia è una disciplina trasversale che si avvale, in maniera integrata, della chimica ambientale, della tossicologia e dell ecologia: La chimica ambientale per studiare il movimento, il trasporto e le trasformazioni delle sostanze chimiche nell ambiente, con approcci che non si limitano a prendere in considerazione separatamente i diversi comparti (come l aria, l acqua, gli organismi, i suoli ed i sedimenti), ma che cercano di avere una visione di sistema, tendenzialmente previsionale; La tossicologia ambientale per possedere strumenti atti alla valutazione del danno, non solo a livello dei singoli organismi e delle specie, ma anche su sistemi biologici complessi (come ad esempio le popolazioni e le comunità); 6

7 L ecologia per evidenziare quali sono i processi chiave che caratterizzano i diversi sistemi e le relazioni che intercorrono tra gli organismi ed il supporto non vivente che li ospita. Il tutto al fine di produrre dei criteri (scientifici) ecotossicologici concepiti per stabilire fino a che punto certe modificazioni del sistema, come l immissione di nutrienti o di sostanze tossiche, siano inefficaci o siano efficaci in maniera accettabile. I campi d indagine dell ecotossicologia sono: studi sulla distribuzione degli inquinanti nell ambiente: l ingresso, i movimenti, l immagazzinamento in specifici comparti ambientali, e la potenziale trasformazione; studi relativi agli effetti degli inquinanti sugli organismi viventi, intendendo con questo l alterazione di strutture o di funzioni delle popolazioni o delle comunità che possono modificare strutture o funzioni dell ecosistema. Dagli studi ecotossicologici ci si aspetta di ottenere: dati per il controllo del rischio al fine della gestione ambientale; risposte alle richieste sociali per la sintesi ed il rilascio di nuove molecole nell ambiente; sviluppo di principi empirici e teorici per incrementare le conoscenze sul comportamento e sugli effetti delle sostanze chimiche negli ecosistemi. I saggi di tossicità in ecotossicologia Lo scopo della sperimentazione tossicologica, nel campo dell ecotossicologia, è quello di definire le quantità massime di sostanze potenzialmente pericolose che possono essere accettate al fine di una adeguata difesa del bersaglio che si intende proteggere, cioè gli ecosistemi naturali o più in generale la biosfera nel suo complesso. La sperimentazione, però, può essere condotta solo su un numero limitato di specie e da queste poi deve essere estrapolata all enorme numero di specie viventi conosciute. Studi tossicologici possono essere effettuati con finalità di ricerca scientifica di base (studio dei meccanismi d azione tossica, o ricerca di relazioni tra la struttura delle molecole e la loro attività biologica), o per scopi applicativi più o meno diretti, spesso con un preciso valore legale (classificazione delle sostanze in funzione del loro effetto, o l adempimento di norme legislative nazionali o internazionali). I saggi ecotossicologici sono suddivisibili in due categorie: I saggi di tossicità acuta: questi test hanno l obbiettivo di misurare l effetto dovuto all esposizione di sostanze pure o di miscele, la cui durata sia compresa, di norma, tra 15 minuti e 96 ore. I risultati ricavati da tali saggi vengono poi impiegati per la valutazione degli effetti tossici dovuti a fenomeni di contaminazione temporanei o nelle classificazioni di tossicità. 7

8 I saggi di tossicità cronica: questi test hanno l obbiettivo di calcolare una soglia di tossicità, ovvero quel livello di esposizione massimo che traccia il confine tra livelli efficaci e livelli non efficaci a tempo indeterminato. Per la misura delle risposte a lungo termine vengono dunque impiegate esposizioni lunghe, relativamente alla durata della vita delle specie in esame. I saggi di tossicità acquatica Nei saggi tossicologici acquatici l organismo in esame assume il contaminante, che si trova in soluzione nel mezzo, attraverso la respirazione (con le branchie) o tramite la membrana cellulare dell epidermide. Grazie a meccanismi di ripartizione e di equilibrio tra l acqua e i comparti di assorbimento, si ha poi un progressivo aumento della concentrazione del tossico all interno dell organismo. Il destino del tossico, inoltre, una volta assorbito, è legato ai processi di distribuzione, metabolizzazione ed escrezione. È ovvio, quindi, quanto sia difficile poter stimare la concentrazione interna della molecola saggiata. È dunque convenzione quantificare la tossicità in termini di concentrazione della sostanza nel mezzo. In ogni tipo di saggio tossicologico è di primaria importanza che per tutta la durata del test la concentrazione della sostanza si mantenga costante nel tempo. Bisogna quindi porre attenzione alla persistenza della sostanza nel mezzo, che sarà funzione sia dei processi di trasformazione chimica, come l idrolisi e la fotolisi, che di trasporto di massa, quale la volatilizzazione. Esistono due diverse tecniche di esposizione nei test di tossicità acquatica: I saggi statici: possono essere senza rinnovamento (cioè una volta iniziati, le soluzioni delle sostanze da saggiare e il mezzo dei controlli non vengono rinnovati per tutta la durata del saggio) o con rinnovamento (cioè una volta iniziati, le soluzioni delle sostanze da saggiare e il mezzo dei controlli vengono rinnovati con soluzioni fresche a tempi determinati). I saggi a flusso continuo: in essi una soluzione concentrata della sostanza in esame viene continuamente pompata in un opportuno sistema di diluizione, e da lì all organismo da saggiare. Per ottenere un quadro degli effetti sugli ecosistemi acquatici, certo non esauriente, ma sotto un certo punto di vista relativamente completo, di norma si opera effettuando saggi su organismi rappresentativi dei principali anelli delle catene trofiche: produttori primari (ad esempio: microalghe); consumatori primari (ad esempio: microcrostacei planctonici); 8

9 consumatori secondari (ad esempio: pesci); decompositori (ad esempio: batteri). Il saggio ecotossicologico con embrioni e larve di molluschi bivalvi Uova, embrioni e larve di bivalvi marini sono tra gli organismi più comunemente usati in test acuti di saggio della tossicità di inquinanti, come ad esempio metalli pesanti, pesticidi e detergenti, o per valutare la qualità biologica delle acque e dei sedimenti in aree costiere soggette ad effetti antropici (Volpi Ghirardini et al., 1995). I bivalvi impiegati in embriotossicologia, infatti, soddisfano gran parte dei requisiti che devono possedere i buoni indicatori di tossicità: sono organismi di cui si hanno conoscenze biologiche approfondite e che sono facilmente reperibili; per i test è possibile impiegare stadi molto sensibili del loro ciclo vitale, nonché disporre di end-point facilmente osservabili; è possibile utilizzare per i saggi stadi di sviluppo omogenei e, per tempi limitati, sono organismi facili da mantenere in laboratorio, nonché sufficientemente tolleranti alla manipolazione (Volpi Ghirardini et al., 2001). La sensibilità e la rapidità di risposta degli stadi larvali ed embrionali dei molluschi bivalvi come bioindicatori da usare in saggi di tossicità è ampiamente riconosciuta a livello internazionale (US EPA, 1995; ASTM, 1998). Attualmente in Italia, però, tali saggi di tossicità non sono ancora entrati a far parte delle indagini di routine per la valutazione della qualità delle acque marine costiere e di transizione. Nel saggio ecotossicologico con embrioni e larve di bivalvi marini, la valutazione della tossicità degli inquinanti è basata sulla percentuale di larve-d (primo stadio della larva veliger) anormali trovate dopo la fertilizzazione delle uova e la successiva incubazione nell acqua sotto investigazione per un certo periodo di tempo (24 48 ore, a seconda della specie impiegata). Durante tale periodo infatti l organismo si trova in una fase particolarmente delicata dello sviluppo poiché si verificano delle importanti modificazioni fisiologiche che portano alla formazione del veliger (figura 1) e l eventuale contatto con sostanze tossiche potrebbe provocare la morte, il rallentamento dello sviluppo, o uno sviluppo non corretto delle larve (Brunelli et al., 2004). 9

10 Figura 1: Mytilus galloprovincialis: prima fase dello sviluppo larvale. La tossicità ambientale del rame Il rame è un metallo pesante e una volta immesso nell ambiente tende a permanervi secondo un certo fattore d accumulo. La sua presenza nell ambiente marino e fluviale non costituisce una novità, trattandosi di una sostanza pur sempre rinvenibile in natura. Da diversi decenni però, la sua concentrazione è aumentata notevolmente in alcune aree, soprattutto in corrispondenza di grandi agglomerati urbani ed insediamenti industriali. Le più importanti fonti d immissione dei metalli pesanti nell ambiente marino sono gli sversamenti fluviali, i depositi atmosferici e gli apporti dalla geosfera (per esempio attraverso meccanismi d erosione). La concentrazione di rame nelle acque degli oceani generalmente non supera i valori di 4 mg/l. Concentrazioni maggiori si possono trovare in acque costali e negli estuari soggetti a fenomeni d inquinamento. 10

11 Il rame, come altri metalli, è un micronutriente essenziale per la vita di molti organismi, come costituente di enzimi redox, se presente nelle giuste concentrazioni; mentre se è in eccesso può essere tossico. Studi su alcuni pesci, infatti, hanno mostrato come esposizioni degli organismi ad elevate concentrazioni di rame influiscano negativamente sulla loro capacità di assorbimento del sodio. Il rame, inoltre, se è presente insieme ad altri tossici può esercitare un effetto combinato sugli organismi; recenti studi hanno appunto evidenziato come il rame si presenta più additivo con cloro, zinco, cadmio e mercurio, mentre riduce la tossicità del cianuro. Il glicol dietilenico Il glicol dietilenico è un composto organico liquido, incolore, inodore e poco volatile, ampiamente utilizzato a livello industriale quale antigelo, liquido ignifugo ed additivo per motori diesel ad iniezione. Nel settore petrolifero il composto viene comunemente utilizzato per impedire la formazione di idrati di carbonio nelle condotte utilizzate per il trasporto del gas a terra, e pertanto lo si può riscontrare in concentrazioni variabili all interno delle acque di produzione delle piattaforme petrolifere off-shore. 11

12 OBIETTIVI Mytilus galloprovincialis e Crassostrea gigas sono specie ampiamente utilizzate in embriotossicologia per le quali sono disponibili metodiche standardizzate (ASTM, 1998; US EPA, 1995) e metodi semplificati (His et al., 1997); Tapes philippinarum, invece, è un mollusco che ad oggi non risulta essere utilizzato a questo scopo, presumibilmente per le difficoltà che riscontrano gli operatori nell indurre i riproduttori all emissione di gameti. L obiettivo della presente sperimentazione, pertanto, è stato quello di verificare la possibilità di stabulare in laboratorio per brevi periodi (alcuni giorni) bivalvi riproduttori di queste tre specie usando acqua marina artificiale, applicare metodi efficaci per indurre tali organismi all emissione di gameti e mettere a punto test ecotossicologici con embrioni e larve di Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas e Tapes philippinarum, valutando la sensibilità dei singoli saggi a due sostanze (nitrato di rame e glicol dietilenico). La procedura impiegata per l esecuzione dei saggi con mitilo ed ostrica concava è quella proposta per queste specie da US EPA (1995) con alcune delle modifiche apportate da His et al. (1997); per la messa a punto del test con T. philippinarum ci si è avvalsi della stessa procedura proposta da US EPA (1995), modificata opportunamente per essere adattata alla specie oggetto di studio. I test sono stati eseguiti con acqua marina artificiale contenente concentrazioni crescenti della sostanza da testare; per ciascuna specie di bivalve e per sostanza sono state effettuate almeno 3 prove, impiegando ogni volta lotti diversi di organismi, ed eseguendo ciascun test con nitrato di rame e glicol dietilenico in parallelo. I risultati sono stati confrontati con quelli disponibili in letteratura. L EC50 è stata calcolata applicando il metodo statistico Trimmed Spearman-Karber ai dati raccolti nel corso delle prove, mentre NOEC e LOEC sono state definite mediante ANOVA e test di Dunnet (previa trasformazione in arcsin dei dati di mortalità e verifica della omogeneità delle varianze). I valori medi di EC50 ottenuti esponendo le tre specie a ciascuna sostanza sono stati confrontati tra loro mediante ANOVA e test di confronto multiplo di Tukey (previa trasformazione in log10 delle EC50 e verifica della omogeneità delle varianze). 12

13 MATERIALI E METODI Scelta dei riproduttori e stabulazione I riproduttori di Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas e Tapes philippinarum (esemplari di almeno un anno di età) sono stati prelevati sia in natura (C. gigas), sia da allevamenti (M. galloprovincialis, T. philippinarum) situati nella Sacca di Goro, sito non inquinato in termini di concentrazioni di metalli pesanti e di altre sostanze tossiche (area sottoposta a monitoraggio periodico). I molluschi sono stati trasportati in laboratorio a secco, avvolti in un panno umido, all interno di un contenitore termico. Una volta in laboratorio, si è proceduto alla verifica della loro maturità. Per fare ciò si sono sacrificati alcuni individui: questi sono stati aperti, forzando le valve ed incidendo col bisturi i muscoli adduttori, e sono state osservate le gonadi. Se l individuo non aveva raggiunto la maturità sessuale, la gonade si presentava a riposo o non sufficientemente matura mostrando un aspetto particolarmente assottigliato e quasi trasparente, tanto che si riusciva ad intravedere il colore della conchiglia sottostante; viceversa se l individuo era sessualmente maturo la gonade si presentava molto più sviluppata e se incisa con un bisturi si osservava un abbondante fuoriuscita di gameti (figura 2). Figura 2: M. galloprovincialis: confronto tra gonade immatura (a sinistra) e gonade matura (a destra). 13

14 Fatto ciò si è proceduto a costituire il lotto di riproduttori: dapprima sono stati scartati gli animali già morti o compromessi per la perdita di acqua, poi sono stati esclusi tutti quegli organismi malformati o con evidenti segni di rottura della conchiglia. Successivamente i molluschi che hanno superato la selezione sono stati puliti dal detrito e dagli organismi epibionti (mediante raschiatura manuale della conchiglia), sciacquati rapidamente sotto acqua corrente e stabulati per alcuni giorni in un impianto sperimentale (figure 3 e 4). Tale apparato era costituito da due vasche tronco-coniche (A, B) in plexiglass della capacità di 45 litri ciascuna, operanti in ciclo chiuso. L acqua di allevamento, proveniente da un serbatoio (L) della capacità di 25 litri posto all uscita di un apparato per la filtrazione meccanico-biologica, veniva pompata all interno delle due vasche. La pompa impiegata aveva potenza pari a 600 l/h. La velocità dell'acqua fornita alle singole vasche troncoconiche è stata mantenuta costante (400 ml/min). Questa velocità di flusso poteva essere modificata regolando gli appositi rubinetti (D, E). Il sistema di filtraggio meccanico-biologico era costituito da un modulo (C) situato esternamente rispetto alle vasche e composto da 4 differenti comparti, ciascuno della capacità di 25 litri. Il primo comparto è stato riempito con materiale inerte (lana di vetro), mentre i successivi comparti con gusci di bivalvi (cannolicchi). Questo materiale, oltre all azione filtrante di tipo meccanico, svolge anche quella di supporto per la crescita dei microrganismi che operano la depurazione biologica (Nitrobacter e Nitrosomonas). Il filtro è stato inizialmente inoculato con materiale derivante da un esistente filtro funzionante per ridurre il tempo di attivazione. L'acqua nel serbatoio (L) veniva mantenuta ad un livello costante attraverso una linea di ritorno (F, G, H, I) scaricante nel primo comparto del filtro. Una pietra porosa posta nel serbatoio (L) assicurava che l'acqua venisse ben miscelata ed aerata. Figura 3: Dispositivi troncoconici impiegati per la stabulazione dei bivalvi. 14

15 A B F F D E G G H H I I L L C C Figura 4: Schema dell apparato utilizzato per la stabulazione dei bivalvi. LEGENDA: A-B: incubatoi; C: filtro biologico; D-E: entrata dell acqua; F-G: filtro con rete in nylon a dimensione variabile; H-I: valvole di scarico; L: serbatoio con pompa. 15

16 L acqua marina artificiale utilizzata per la stabulazione dei molluschi e per l esecuzione dei saggi embriotossicologici, è stata preparata aggiungendo ad acqua deionizzata sale marino artificiale Instant Ocean in quantità variabile a seconda della specie, ed è stata maturata per almeno una settimana attraverso il filtro chimico-biologico dell impianto. Per l intera durata della sperimentazione sono stati monitorati routinariamente i più importanti parametri chimico-fisici, utilizzando una sonda multiparametrica. I dati raccolti hanno evidenziato l elevata stabilità chimica dell acqua (vedi grafici seguenti), che successivamente è stata utilizzata per indurre i riproduttori all emissione dei gameti e per eseguire i saggi. Esempio di monitoraggio di parametri chimico-fisici: dati raccolti durante la sperimentazione con Tapes philippinarum. O 2 (% di saturazione) ph 85 8,3 80 8,2 75 8, ,9 60 7,8 01/07/ /07/ /07/ /08/ /08/ /09/ /09/ /07/ /07/ /07/ /08/ /08/ /09/ /09/2005 Temperatura ( C) Salinità 23,00 29,5 22,50 29,3 29,1 22,00 28,9 28,7 21,50 28,5 01/07/ /07/ /07/ /08/ /08/ /09/ /09/ /07/ /07/ /07/ /08/ /08/ /09/ /09/

17 Conducibilità 43,02 42,99 42,96 42,93 42,9 42,87 42,84 01/07/ /07/ /07/ /08/ /08/ /09/ /09/2005 Saggio embriotossicologico con Mytilus galloprovincialis La produzione dei gameti I riproduttori di Mytilus galloprovincialis dello stock selezionato (30 organismi), dopo alcuni giorni di condizionamento nell impianto di stabulazione (acqua marina artificiale al 30±1 di salinità e temperatura di 19±1 C), sono stati indotti all emissione di uova e spermi applicando un protocollo di stimolazione termica. Gli individui sono stati posti a secco alla temperatura di 4 C per 3-4 ore, quindi sono stati trasferiti in una vasca contenente acqua a 28 C (riscaldata utilizzando due riscaldatori elettrici ed un aeratore per favorirne il movimento). L acqua utilizzata per la stimolazione era acqua marina artificiale, a salinità 30±1 e ph 8,3, preparata con una miscela di sali già pronta in commercio (Instant Ocean ), fatta girare per diversi giorni attraverso un sistema di filtrazione meccanico-biologico, e filtrata con un setaccio di maglia corrispondente a 25 μm. Dal momento in cui la quasi totalità degli organismi ha aperto le valve e ha ripreso la filtrazione si sono attesi 30 minuti, quindi li si è trasferiti in una seconda vasca contenente acqua alla temperatura di 18 C (figura 5). Anche in questo caso si è potuta osservare la riapertura della valve e la ripresa della filtrazione. In caso di mancata emissione, dopo un ora sono stati somministrati uova e spermi, ottenuti da alcuni organismi sacrificati, e sono stati applicati ulteriori cicli termici a 28 C e 18 C alternativamente, fino ad ottenere l emissione di almeno un paio di organismi di ambo i sessi. 17

18 Figura 5: M. galloprovincialis: trasferimento dei riproduttori nella vasca con acqua alla temperatura di 18 C. Gli organismi emittenti sono stati prontamente rimossi per essere posti singolarmente in beaker da 250 ml contenenti 200 ml di acqua salata artificiale (la stessa impiegata per la stimolazione, ma filtrata nei giorni precedenti la sperimentazione con un filtro a porosità di 0,45 μm), aerata per 24 ore prima dell utilizzo e portata alla temperatura di 18 C (figura 6). Figura 6: M. galloprovincialis: maschio in emissione. 18

19 I riproduttori di M. galloprovincialis possono essere indotti all emissione di uova e spermi anche applicando un protocollo che prevede la stimolazione chimica dei molluschi. Le prove di stimolazione possono essere eseguite su lotti di 30 mitili mantenuti in schiuditoio con acqua marina artificiale per almeno 3-4 giorni alle stesse condizioni rispetto al luogo di prelievo. Prima di procedere alla fase di stimolazione, i molluschi vanno mantenuti a secco per alcune ore (pretrattamento). Come stimolante viene impiegato il perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) secondo la metodica descritta da Morse et al. (1977) e modificata da Turolla et al. (2002a, 2002b). Il protocollo di stimolazione differisce da quello proposto da Morse et al. (1977) per alcuni elementi fondamentali: i riproduttori sono stimolati in massa e non singolarmente e il tempo di esposizione al perossido d idrogeno è ridotto da 2,5 ore a 15 minuti. È invece mantenuta uguale la concentrazione iniziale dello stimolante (5 mm). Ogni partita di riproduttori viene stata stimolata in ambiente basico (ph 9,1), ottenuto mediante l aggiunta di idrossido di sodio. Temperatura e salinità vengono lasciate invariate rispetto alle condizioni di mantenimento (30±1 ; 18±1 C). Dopo i 15 minuti di esposizione al perossido d idrogeno in ambiente basico, si provvede al lavaggio dei molluschi e al loro trasferimento in acqua di stabulazione a ph non modificato. Nei minuti successivi al trattamento, vengono prontamente rimossi tutti gli organismi emittenti per essere posti singolarmente in beaker da 250 ml per continuare l emissione. I gameti emessi durante i 15 minuti di trattamento con perossido di idrogeno devono essere scartati e, pertanto, non vengono utilizzati per l esecuzione dei test di embriotossicità. I due metodi di stimolazione descritti non sempre risultano di necessaria applicazione. Nella presente sperimentazione, ad esempio, sono state ottenute abbondanti emissioni di gameti talvolta in poche decine di minuti, utilizzando mitili maturi che erano stati stabulati alcune settimane a 4-10 C: è stato sufficiente effettuare un pretrattamento di 3-4 ore (mitili a secco) e porre successivamente i molluschi in acqua marina artificiale a 20 C. 19

20 La fecondazione dei gameti: Una volta conclusa l emissione gli organismi sono stati allontanati dalle camere test. Le uova (figura 7) sono state filtrate con un setaccio di maglia pari a 100 μm così da eliminare eventuali impurità, e trasferite in un cilindro portando il volume della sospensione a 500 ml con acqua pulita alla temperatura di 18±1 C. In seguito, mantenendo in agitazione la sospensione di uova con l aiuto di uno stantuffo (costituito da un bastone cui viene inserito ad una estremità un disco perforato), sono stati prelevati quattro campioni di 100 μl, e il numero di uova è stato contato al microscopio ottico utilizzando camere di sedimentazione. Si sono preparati poi 300 ml complessivi di soluzione di spermi, ottenuti da almeno due maschi diversi, ed è stata osservata la mobilità dei gameti maschili al microscopio ottico (figura 8). Si è proceduto quindi alla fecondazione unendo al beaker contenente le uova pochi millilitri di sospensione di spermi (2-3 ml di sospensione di spermi sono sufficienti a fecondare 3-4 milioni di uova), in modo da contare spermi attorno alla membrana di ciascun uovo (His et al., 1997). Figura 7: (ingrandimento 40x) M. galloprovincialis: uova. Figura 8: (ingrandimento 100x) M. galloprovincialis: spermatozoi. Dopo circa 15 minuti si è verificato al microscopio il successo della fecondazione: la quasi totalità delle uova (più del 90%) aveva forma rotondeggiante, mostrava la membrana di fertilizzazione e l emissione del globulo polare (figura 9). 20

21 L incubazione degli embrioni Volumi corrispondenti a uova (100 μl) sono stati poi distribuiti in camere di incubazione (vials) contenenti 10 ml di soluzione test e incubati per 48 ore in termostato a 18±1 C, al fotoperiodo di 16 h luce: 8 h buio. Le diverse diluizioni delle sostanze saggiate ed il controllo sono stati preparati con lo stesso tipo di acqua utilizzata per la stimolazione, filtrata con un filtro a porosità di 0,45 μm. I valori delle concentrazioni di trattamento di nitrato di rame e di glicol dietilenico a cui gli embrioni di M. galloprovincialis sono stati esposti, sono state scelte sulla base dei risultati ottenuti da test preliminari. Figura 9: M. galloprovincialis: uovo fecondato, si noti la presenza del globulo polare. Tali concentrazioni erano: 5,01-7,94 μg/l - 12,6 μg/l - 19,9 μg/l e 31,6 μg/l di Cu 2+ 7,94 g/l - 12,6 g/l - 19,9 g/l - 31,6 g/l e 50,1 g/l di DEG Ogni concentrazione ed il controllo sono stati saggiati in 4 repliche. Al termine del periodo di incubazione i campioni sono stati fissati con 200 µl di formalina tamponata al 40%. 21

22 Lettura dei campioni La lettura dei campioni è stata eseguita al microscopio ottico utilizzando camere di sedimentazione, e consisteva nel conteggio, per ogni camera test, dei primi 100 organismi, segnando il numero di larve che aveva raggiunto un corretto e completo sviluppo dopo le 48 ore di incubazione (larve normali). La categoria di larve anormali include: le uova segmentate, gli embrioni normali o malformati che non hanno raggiunto lo stadio di veliger, le trocofore ed i pre-veliger (figure 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19 e 20); i veliger con mantello che protrude dalla conchiglia, i veliger con conchiglia incompleta, con incisioni nel margine, o con cerniera convessa (figura 17 e 18). La categoria di larve normali, invece, comprende i veliger vivi con completo e normale sviluppo della conchiglia (larve-d) (figura 21). Figura 10: M. galloprovincialis: prima divisione, stadio 2 cellule. Figura 11: M. galloprovincialis: seconda e terza divisione, stadi 4 e 8 cellule. 22

23 Figura 12: M. galloprovincialis: stadio successivo di divisione cellulare. Figura 13: M. galloprovincialis: formazione della morula. Figura 14: M. galloprovincialis: trocofora. 23

24 Figura 15: M. galloprovincialis: trocofora, inizio formazione della conchiglia. Figura 16: M. galloprovincialis: trocofora, formazione della conchiglia. Figura 17: M. galloprovincialis: veliger deforme, valva incompleta, incisione nella conchiglia e cerniera convessa. 24

25 Figura 18: M. galloprovincialis: veliger deforme, mantello che protrude dalla conchiglia e incisioni nel margine della conchiglia. Figura 19: M. galloprovincialis: organismo deforme. Figura 20: M. galloprovincialis: pre-veliger. 25

26 Figura 21: M. galloprovincialis: veliger. Analisi dei dati Il valore di EC50 è stato calcolato sulla base del numero di embrioni che dopo 48 ore dava origine a larve vive con completo e normale sviluppo della conchiglia (larve-d). Come end-point, pertanto, sono stati utilizzati la mortalità, il rallentamento dello sviluppo (presenza di stadi embrionali, trocofore e preveliger) e la formazione di veliger deformi (con conchiglia incompleta, cerniera convessa, mantello che protrude dalla conchiglia, ecc.). La conta è stata effettuata per osservazione diretta di 100 individui in ogni camera test, utilizzando un microscopio rovesciato (100 x). Il valore di EC50 è stato calcolato applicando il metodo statistico Trimmed Spearman- Karber ai dati raccolti nel corso delle prove, mentre NOEC e LOEC sono state definite mediante ANOVA e test di Dunnet (previa trasformazione in arcsin dei dati e verifica della omogeneità delle varianze). Accettabilità del test Le condizioni di accettabilità di questo tipo di test sono le seguenti (ASTM, E ): Al termine del test più del 70% degli embrioni del controllo deve aver raggiunto uno sviluppo corretto e completo; Tutti gli animali inclusi nella camere test devono essere stati prodotti dagli stessi riproduttori nella medesima emissione; Tutte le camere test devono essere identiche; Devono essere fatte più repliche per ogni trattamento; Nelle camere test non devono essere aggiunte sostanze non contemplate nel saggio; Il test deve avere inizio entro 4 ore dalla fecondazione degli embrioni; 26

27 Le camere test devono essere incubate tutte alla stessa temperatura e per il medesimo tempo; La saturazione dell ossigeno disciolto nelle soluzioni delle camere test deve essere compresa tra il 60 e il 100%; La differenza di temperatura tra inizio e fine test non deve essere superiore ad 1 C. TABELLA RIASSUNTIVA: CONDIZIONI APPLICATE PER L ESECUZIONE DEI SAGGI EMBRIOTOSSICOLOGICI CON Mytilus galloprovincialis Tipo di saggio: Statico N embrioni per camera: Tossico: Rame - Cu (NO 3 ) 2 Glicol dietilenico Concentrazioni tossico: 5 + controllo Temperatura: 18 ± 1 C Repliche per concentrazione: 4 ph: 8.0 ± 0.5 Acqua diluizione: Acqua marina artificiale filtrata (impianto di stabulazione) Salinità: 30 ± 1 Alimentazione: Assente Fotoperiodo: 16 h L/8 h B Durata del saggio: 48 ore Contenitori per il saggio: Vials da 20 ml Effetti valutati: Sopravvivenza e normale sviluppo della conchiglia Volume di soluzione: 10 ml (USEPA, 1995; His et al., 1997; ASTM, 1998) 27

28 Saggio embriotossicologico con Crassostrea gigas La produzione dei gameti Le prove di stimolazione sono state eseguite su lotti di ostriche selvatiche, provenienti dalla Sacca di Goro. Dopo la raccolta, i riproduttori sono stati mantenuti in schiuditoio con acqua marina artificiale per almeno 3-4 giorni alle stesse condizioni rispetto al luogo di prelievo (salinità al 25±1 e temperatura di 24±1 C). Prima di procedere alla fase di stimolazione chimica, i molluschi sono stati mantenuti a secco per alcune ore (pretrattamento). Come stimolante è stato impiegato il perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) secondo la metodica descritta da Morse et al. (1977) e modificata da Turolla et al. (2002a, 2002b). Il protocollo di stimolazione differiva da quello proposto da Morse et al. (1977) per alcuni elementi fondamentali: i riproduttori sono stati stimolati in massa e non singolarmente e il tempo di esposizione al perossido d idrogeno è stato ridotto da 2,5 ore a 15 minuti. È stata invece mantenuta uguale la concentrazione iniziale dello stimolante (5 mm). Ogni partita di riproduttori è stata stimolata in ambiente basico (ph 9,1). L aumento della basicità dell acqua è stata prodotta prima dell avvio delle prove mediante l aggiunta di idrossido di sodio. Temperatura e salinità sono rimaste invariate rispetto alle condizioni di mantenimento (25±1 ; 24±1 C). Dopo i 15 minuti di esposizione al perossido d idrogeno in ambiente basico, si è provveduto al lavaggio dei molluschi e al loro trasferimento in acqua di stabulazione a ph non modificato. Nei minuti successivi al trattamento, sono stati prontamente rimossi tutti gli organismi emittenti (figure 22 e 23) per essere posti singolarmente in vaschette contenenti 200 ml di acqua marina artificiale (la stessa impiegata per la stabulazione, ma filtrata nei giorni precedenti la sperimentazione con filtro a porosità di 0,45 m), aerata per 24 ore prima dell utilizzo e portata alla temperatura di 24 C. I gameti emessi durante i 15 minuti di trattamento con perossido di idrogeno sono stati scartati e, pertanto, non sono stati utilizzati per l esecuzione dei test di embriotossicità. 28

29 Figura 22: C. gigas: femmina in emissione. Figura 23: C. gigas: maschio in emissione. 29

30 La fecondazione dei gameti Una volta conclusa l emissione gli organismi sono stati allontanati dalle camere test. Le uova (figura 24) sono state filtrate con un setaccio di maglia pari a 100 μm così da eliminare eventuali impurità, e trasferite in un cilindro portando il volume della sospensione a 500 ml con acqua pulita sempre alla temperatura di 22 C. In seguito, mantenendo in agitazione la sospensione di uova con l aiuto di uno stantuffo (costituito da un bastone cui viene inserito ad una estremità un disco perforato), sono stati prelevati quattro campioni di 100 μl, e il numero di uova è stato contato al microscopio ottico utilizzando camere di sedimentazione. Si sono preparati poi 300 ml complessivi di soluzione di spermi, ottenuti da almeno due maschi diversi, ed è stata osservata la mobilità dei gameti maschili al microscopio ottico. Si è proceduto quindi alla fecondazione unendo al beaker contenente le uova pochi millilitri di sospensione di spermi (2-3 ml di sospensione di spermi sono sufficienti a fecondare 3-4 milioni di uova), in modo da contare spermi attorno alla membrana di ciascun uovo (His et al., 1997). Figura 24: C. gigas: uova prima della fecondazione. 30

31 Dopo circa 15 minuti si è verificato al microscopio il successo della fecondazione: la quasi totalità delle uova (più del 90%) aveva forma rotondeggiante, mostrava la membrana di fertilizzazione e l emissione del globulo polare. L incubazione degli embrioni Volumi corrispondenti a uova (100 μl) sono stati poi distribuiti in camere di incubazione (vials) contenenti 10 ml di soluzione test e incubati per 24 ore in termostato a 24±1 C, al fotoperiodo di 16 h luce: 8 h buio. Le diverse diluizioni delle sostanze saggiate ed il controllo sono stati preparati con lo stesso tipo di acqua utilizzata per la stimolazione, filtrata con un filtro a porosità di 0,45 μm. I valori delle concentrazioni di trattamento di nitrato di rame e di glicol dietilenico a cui gli embrioni di Crassostrea gigas sono stati esposti, sono state scelte sulla base dei risultati ottenuti da test preliminari. Tali concentrazioni erano: 7,94 μg/l - 12,6 μg/l - 19,9 μg/l - 31,6 μg/l e 50,1 μg/l di Cu 2+ 12,6 g/l - 19,9 g/l - 31,6 g/l - 50,1 g/l e 79,4 g/l di DEG Ogni concentrazione ed il controllo sono stati saggiati in 4 repliche. Al termine del periodo di incubazione i campioni sono stati fissati con 200 µl di formalina tamponata al 40%. Lettura dei campioni La lettura dei campioni è stata eseguita al microscopio ottico utilizzando camere di sedimentazione, e consisteva nel conteggio, per ogni camera test, dei primi 100 organismi, segnando il numero di larve che aveva raggiunto un corretto e completo sviluppo dopo le 24 ore di incubazione (larve normali). La categoria di larve anormali include: uova segmentate, embrioni normali o malformati che non hanno raggiunto lo stadio di veliger, trocofore e pre-veliger; veliger con mantello che protrude dalla conchiglia, veliger con conchiglia incompleta, con incisioni nel margine, o con cerniera convessa. La categoria di larve normali, invece, comprende i veliger vivi con completo e normale sviluppo della conchiglia (larve-d) (figura 25). 31

32 Figura 25: C. gigas: veliger (larve-d). Analisi dei dati Il valore di EC50 è stato calcolato sulla base del numero di embrioni che dopo 24 ore dava origine a larve vive con completo e normale sviluppo della conchiglia (larve-d). Come end-point, pertanto, sono stati utilizzati la mortalità, il rallentamento dello sviluppo (presenza di stadi embrionali, trocofore e preveliger) e la formazione di veliger deformi (con conchiglia incompleta, cerniera convessa, mantello che protrude dalla conchiglia, ecc.). La conta è stata effettuata per osservazione diretta di 100 individui in ogni camera test, utilizzando un microscopio rovesciato (100 x). Il valore di EC50 è stato calcolato applicando il metodo statistico Trimmed Spearman- Karber ai dati raccolti nel corso delle prove, mentre NOEC e LOEC sono state definite mediante ANOVA e test di Dunnet (previa trasformazione in arcsin dei dati e verifica della omogeneità delle varianze). Accettabilità del test Le condizioni di accettabilità di questo tipo di test sono le seguenti (ASTM, E ): Al termine del test più del 70% degli embrioni del controllo deve aver raggiunto uno sviluppo corretto e completo; 32

33 Tutti gli animali inclusi nella camere test devono essere stati prodotti dagli stessi riproduttori nella medesima emissione; Tutte le camere test devono essere identiche; Devono essere fatte più repliche per ogni trattamento; Nelle camere test non devono essere aggiunte sostanze non contemplate nel saggio; Il test deve avere inizio entro 4 ore dalla fecondazione degli embrioni; Le camere test devono essere incubate tutte alla stessa temperatura e per il medesimo tempo; La saturazione dell ossigeno disciolto nelle soluzioni delle camere test deve essere compresa tra il 60 e il 100%; La differenza di temperatura tra inizio e fine test non deve essere superiore ad 1 C. TABELLA RIASSUNTIVA: CONDIZIONI APPLICATE PER L ESECUZIONE DEI SAGGI EMBRIOTOSSICOLOGICI CON Crassostrea gigas Tipo di saggio: Statico N embrioni per camera: Tossico: Rame - Cu (NO 3 ) 2 Glicol dietilenico Concentrazioni tossico: 5 + controllo Temperatura: 24 ± 1 C Repliche per concentrazione: 4 ph: 8.0 ± 0.5 Acqua diluizione: Acqua marina artificiale filtrata (impianto di stabulazione) Salinità: 25 ± 1 Alimentazione: Assente Fotoperiodo: 16 h L/8 h B Durata del saggio: 24 ore Contenitori per il saggio: Vials da 20 ml Effetti valutati: Sopravvivenza e normale sviluppo della conchiglia Volume di soluzione: 10 ml (USEPA, 1995; His et al., 1997; ASTM, 1998) 33

34 Saggio embriotossicologico con Tapes philippinarum La produzione dei gameti I riproduttori di Tapes philippinarum dello stock selezionato (30 organismi), dopo alcuni giorni di condizionamento nell impianto di stabulazione (acqua marina artificiale al 30±1 di salinità e temperatura di 22±1 C), sono stati indotti all emissione di uova e spermi applicando un protocollo di stimolazione termica. Il metodo non prevedeva pretrattamenti, ma l applicazione di un ciclo termico consistente nell esporre le vongole per 30 minuti ad acqua marina artificiale a 28 C (riscaldata utilizzando due riscaldatori elettrici ed un aeratore per favorirne il movimento). L acqua utilizzata per la stimolazione era acqua marina artificiale, a salinità 30±1 e ph 8,3, preparata con una miscela di sali già pronta in commercio (Instant Ocean ), fatta girare per diversi giorni attraverso un sistema di filtrazione meccanico-biologico, e filtrata con un setaccio di maglia corrispondente a 25 μm. Dal momento in cui la quasi totalità degli organismi ha aperto le valve e ha ripreso la filtrazione si sono attesi 30 minuti, quindi li si è trasferiti in una seconda vasca contenente acqua alla temperatura di 22 C (figura 26). Anche in questo caso si è potuta osservare la riapertura della valve e la ripresa della filtrazione. In caso di mancata emissione, dopo un ora sono stati somministrati uova e spermi, ottenuti da alcuni organismi sacrificati, ed sono stati applicati ulteriori cicli termici a 28 C e 22 C alternativamente, fino ad ottenere l emissione di almeno un paio di organismi di ambo i sessi. Figura 26: T. philippinarum: trasferimento dei riproduttori nella vasca con acqua alla temperatura di 22 C. 34

35 Gli organismi emittenti sono stati prontamente rimossi per essere posti singolarmente in vaschette contenenti 200 ml di acqua salata artificiale (la stessa impiegata per la stimolazione, ma filtrata nei giorni precedenti la sperimentazione con filtro a porosità di 0,45 μm), aerata per 24 ore prima dell utilizzo e portata alla temperatura di 22 C (figura 27). Figura 27: T. philippinarum: femmina in emissione. 35

36 La fecondazione dei gameti Una volta conclusa l emissione gli organismi sono stati allontanati dalle camere test. Le uova (figura 28) sono state filtrate con un setaccio di maglia pari a 100 μm così da eliminare eventuali impurità, e trasferite in un cilindro portando il volume della sospensione a 500 ml con acqua pulita alla temperatura di 22±1 C. In seguito, mantenendo in agitazione la sospensione di uova con l aiuto di uno stantuffo (costituito da un bastone cui viene inserito ad una estremità un disco perforato), sono stati prelevati quattro campioni di 100 μl, e il numero di uova è stato contato al microscopio ottico utilizzando camere di sedimentazione. Si sono preparati poi 300 ml complessivi di soluzione di spermi, ottenuti da almeno due maschi diversi, ed è stata osservata la mobilità dei gameti maschili al microscopio ottico (figura 29). Si è proceduto quindi alla fecondazione unendo al beaker contenente le uova pochi millilitri di sospensione di spermi (2-3 ml di sospensione di spermi sono sufficienti a fecondare 3-4 milioni di uova), in modo da contare spermi attorno alla membrana di ciascun uovo (His et al., 1997). Figura 28: T. philippinarum: uovo. 36

37 Figura 29: T. philippinarum: spermatozoi. Dopo circa 15 minuti si è verificato al microscopio il successo della fecondazione: la quasi totalità delle uova (più del 90%) avevaforma rotondeggiante, mostrava la membrana di fertilizzazione e l emissione del globulo polare (figura 30). L incubazione degli embrioni Volumi corrispondenti a uova (100 μl) sono stati poi distribuiti in camere di incubazione (vials) contenenti 10 ml di soluzione test e incubati per 24 ore in termostato a 24 ± 1 C, al fotoperiodo di 16 h luce: 8 h buio. Le diverse diluizioni delle sostanze saggiate ed il controllo sono stati preparati con lo stesso tipo di acqua utilizzata per la stimolazione, filtrata con un filtro a porosità di 0,45 μm. I valori delle concentrazioni di trattamento di nitrato di rame e di glicol dietilenico a cui gli embrioni di Tapes philippinarum sono stati esposti, sono state scelte sulla base dei risultati ottenuti da test preliminari. 37

38 Figura 30: T. philippinarum: uovo fecondato; si noti la presenza del globulo polare. Tali concentrazioni erano: 7,94 μg/l - 12,6 μg/l - 19,9 μg/l - 31,6 μg/l e 50,1 μg/l di Cu 2+ 7,94 g/l - 12,6 g/l - 19,9 g/l - 31,6 g/l e 50,1 g/l di DEG Ogni concentrazione ed il controllo sono stati saggiati in 4 repliche. Al termine del periodo di incubazione i campioni sono stati fissati con 200 µl di formalina tamponata al 40%. Lettura dei campioni La lettura dei campioni è stata eseguita al microscopio ottico utilizzando camere di sedimentazione, e consisteva nel conteggio, per ogni camera test, dei primi 100 organismi, segnando il numero di larve che aveva raggiunto un corretto e completo sviluppo dopo le 24 ore di incubazione (larve normali). La categoria di larve anormali include: le uova segmentate, gli embrioni normali o malformati che non hanno raggiunto lo stadio di veliger, le trocofore ed i pre-veliger (figure 31, 32, 33 e 34); i veliger con mantello che protrude dalla conchiglia, veliger con conchiglia incompleta, con incisioni nel margine, o con cerniera convessa. La categoria di larve normali, invece, comprende i veliger vivi con completo e normale sviluppo della conchiglia (larve-d) (figura 35). 38

39 Figura 31: T. philippinarum: prima divisione, stadio a 2 cellule. Figura 32: T. philippinarum: stadi successivi di divisione cellulare, formazione della morula. 39

40 Figura 33: T. philippinarum: trocofora. Figura 34: T. philippinarum: pre-veliger. 40

41 Figura 35: T. philippinarum: veliger. Analisi dei dati Il valore di EC50 è stato calcolato sulla base del numero di embrioni che dopo 24 ore dava origine a larve vive con completo e normale sviluppo della conchiglia (larve-d). Come end-point, pertanto, sono stati utilizzati la mortalità, il rallentamento dello sviluppo (presenza di stadi embrionali, trocofore e preveliger) e la formazione di veliger deformi (con conchiglia incompleta, cerniera convessa, mantello che protrude dalla conchiglia, ecc.). La conta è stata effettuata per osservazione diretta di 100 individui in ogni camera test, utilizzando un microscopio rovesciato (100 x). Il valore di EC50 è stato calcolato applicando il metodo statistico Trimmed Spearman-Karber ai dati raccolti nel corso delle prove, mentre NOEC e LOEC sono state definite mediante ANOVA e test di Dunnet (previa trasformazione in arcsin dei dati e verifica della omogeneità delle varianze). Accettabilità del test Le condizioni di accettabilità di questo tipo di test sono le seguenti (ASTM, E ): Al termine del test più del 70% degli embrioni del controllo deve aver raggiunto uno sviluppo corretto e completo; Tutti gli animali inclusi nella camere test devono essere stati prodotti dagli stessi riproduttori nella medesima emissione; 41