Scuola SuperioreMedico Tecnica Formazione Tecnico in Analisi Biomediche Anno:

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1 Scuola SuperioreMedico Tecnica Formazione Tecnico in Analisi Biomediche Anno: Nuovo test di screening rapido per la messa in evidenza dei micobatteri del complesso tubercolare e della resistenza alla rifampicina nell espettorato tramite GeneXpert Autore: Cuccu Luciana Maria Sede: Ospedale Regionale di Mendrisio Referenti: Dr.ssa Franca Baggi Dr.Franco Keller

2 Abstract Introduzione: La tubercolosi si sta ripresentando interessando anche la Svizzera. Per i casi registrati in Ticino si tratta per lo più di immigranti soggiornanti nel Centro Asilanti di Chiasso la cui gestione è presa a carico dall Ospedale Beata Vergine Mendrisio. Lo scopo di questo lavoro di diploma è rispondere all esigenza di una diagnostica più veloce che migliori la gestione dei casi e aiuti il contenimento delle spese sanitarie, introducendo un nuovo test di screening rapido per la messa in evidenza dei micobatteri del complesso tubercolare, agenti eziologici della malattia. Materiale e metodi: Sono stati analizzati 18 campioni tra: sedimenti di espettorato, lavaggi e aspirati, forniti dal Servizio di Microbiologia Eolab(SMIC), con GenExpert Dx System utilizzando il kit MTBRif Xpert. Il principio utilizzato dall analisi è una PCR realtime che permette la detezione dei micobatteri del complesso tubercolare e la resistenza alla rifampicina. I risultati ottenuti sono stati paragonati con i precedenti della microscopia diretta, della coltura e dove disponibile della PCR realtime Roche utilizzati presso lo SMIC Risultati Dal paragone dei risultati emerge che il nuovo test di screening rapido MTBRif Xpert è in grado dettetare la presenza del micobatteri del complesso tubercolare in tutti i casi con microscopia e coltura positiva costituendo un analisi con elevata sensibilità diagnostica. Rispetto alla PCR Roche è invece leggermente meno sensibile per via della soglia di detezione più alta. Non si presentano casi di falsi positivi. Conclusioni Il test MTBRif Xpert proposto come screening rapido presenta un ottima sensibilità diagnostica presentandosi adatto allo scopo diagnostico per cui era previsto,fornendo un primo risultato in meno di due ore. La validazione è riuscita e l obiettivo è stato raggiunto. Introduction: Tuberculosis disease is coming back, also in Switzerland. In Ticino the majority of registered cases are found among immigrants that stay in the center for asylum seekers in Chiasso. These tuberculosis cases are principally treated by the Regional Hospital of Mendrisio. The purpose of this Diploma Work is improve the management of these disease cases and help to contain the healthcare costs, by introducing a new rapid screening test that can detect the m. tuberculosis complex and also the Rifampicina resistance. Materials and methods 18 different samples of: sputum sediment, washing and aspirations, supplied by the microbiology service of Eolab,were analyzed with GenExpert Dx System using the kit MTB Rif Xpert. Employing PCR realtime, this test detected the presence of m. tuberculosis complex and also mutations that cause a Rifampicina resistance. Rifampicina is an antibiotic used in the treatment of tuberculosis disease. The results obtained with this new test were finally compared with the previous results from direct microscopy, culture and Roche PCR made use of by the microbiology service of Eolab. Results By comparing the results it can be seen that this new rapid screen test detected the presence of m. tuberculosis complex every time that is positive in microscopy and culture, showing an high diagnostic sensitivity. It is slightly less sensitive in comparison to PCR Roche because of the higher detection threshold. No false negative case were found. Conclusion The MTBRif Xpert test can well be used as a screening test because it has an high diagnostic sensitivity, demonstrating its suitability for the use for which it was planned. With this test it s now possible to have a first result in less than 2 hours and so the aim of the study was reached.

3 Sommario Abstract Introduzione: I micobatteri: agente eziologico della tubercolosi Classificazione dei micobatteri La Tubercolosi Scoperta Vie di trasmissione Fasi cliniche della malattia Complicazioni della tubercolosi Epidemiologia della tubercolosi Incidenza Mortalità Trattamento Resistenze antibiotiche della tubercolosi La tubercolosi nel territorio svizzero Rischio di contrarre la tubercolosi Diagnostica Biosicurezza Test diagnostici classici Altri test Test molecolari Motivazione della scelta del lavoro di diploma Obiettivo Test MTBRIF Genexpert Cappa a flusso laminare GeneXpert Descrizione dell analisi PCR realtime Regione di resistenza per la rifampicina Materiali e metodi Campioni clinici Materiali non forniti nel kit materiale del kit Controlli di qualità... 21

4 5.3 Principio della procedura Procedimento Lettura del risultato Limitazioni del metodo Sensibilità rispetto al Gold Standard Sensibilità analitica Validazione Risultati Discussione Conclusioni Bibliografia

5 1 Introduzione: 1.1 I micobatteri: agente eziologico della tubercolosi Il Mycobacterium è un microrganismo della famiglia delle Mycobateriacee. Esistono oltre 20 specie di micobatteri patogeni per l uomo; alcune sono considerate sempre patogene altre sono patogene opportunisticamente, spesso in pazienti immunocompromessi, ed infine specie saprofitiche che sono per lo più micobatteri ambientali, raramente patogene per l uomo. Questi microrganismi hanno una forma bacillare, sono lunghi da 2 a 4 µm e larghi da 0,2 a 0,4 µm. Si possono rilevare delle variazioni morfologiche dovute a influssi esterni come la coltura, dove i micobatteri hanno la tendenza ad accorciarsi ed assumere una forma piuttosto coccobacillare, mentre quelli estratti da pazienti con prolungato trattamento spesso si ritrovano frammentati come a formare delle catenelle di granuli. Hanno un metabolismo aerobio e microaerofilo, necessitano solo di piccole quantità di ossigeno per la sopravvivenza. Essendo batteri immobili non sono in grado di muoversi; sono anche sprovvisti di capsula e non sono in grado di produrre spore. Le caratteristiche principali che li distinguono sono: Lentezza replicativa: il loro ciclo replicativo ha la durata di circa 20 ore, tempo in cui un comune battere come l E.coli raggiunge 4000 copie circa. Questa sua caratteristica spiega quindi la tempistica molto lunga per la sua coltura. Bisogna comunque accennare l esistenza di alcuni micobatteri a crescita più rapida, che non hanno particolari esigenze nutritive e sono in grado di crescere anche su terreni aspecifici. Composizione ad alto contenuto lipidico: essi sono ricchi di fosfolipidi, acidi micolici e cere, quasi tutti legati a proteine e polisaccaridi. Lo strato di peptidoiglicano cui sono legati polisaccaridi a lunga catena può causare la formazione di granulomi. I fosfolipidi contribuiscono alla formazione di necrosi caseose ed il fattore cordale presente in alcuni micobatteri costituisce un fattore di virulenza che è in grado d inibire la migrazione dei neutrofili. L alcoolacido resistenza: questa caratteristica è dovuta all elevata quantità di lipidi della membrana batterica. I micobatteri non si colorano bene con la colorazione di Gram, mentre trattengono molto bene coloranti acquosi in soluzione di fenolo. Il fenolo ha la funzione di facilitare l entrata dei coloranti nella parete cellulare. Tali coloranti a base fenolica non vengono eliminati dal trattamento decolarante con miscela alcolacido. (1) 2

6 1.2 Classificazione dei micobatteri All interno della grande famiglia dei micobatteri si applica una principale distinzione che ha lo scopo di dividere i micobatteri in grado di causare una tubercolosi e quelli che non sono in grado di causare tale malattia. Si hanno quindi secondo la classificazione del Bergey s Manual due principali categorie: Micobatteri del complesso tubercolare (M.tubercolosis complex) M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis B.C.G.(ceppo vaccinale),m.caprae, M. africanum e M.pinnipedi. MOTT (Mycobacteria Other Than Tuberculosis) Anche chiamati atipici ovvero micobatteri diversi da quelli del complesso tubercolare. Fra i MOTT sono di particolare interesse clinico: il M. leprae che causa la lebbra; i M. avium complex responsabili d infezioni polmonari e linfoadeniti, il M. kansasii responsabile anch esso d infezioni con localizzazioni polmonari ed altre sedi, ed infine il M. marinum che crea ulcerazione e lesioni superficiali cutanee. Per i MOTT vi è un altra classificazione: la Runyon che fa capo a caratteristiche cromogene e di velocità di crescita. (1) 1.3 La Tubercolosi Scoperta Fu il biologo tedesco Robert Koch a scoprire la tubercolosi, da egli deriva anche la seconda nomina attribuita al M. tubercolosis: bacillo di Koch. Ne annunciò la scoperta il 24 marzo del Lo identificò, dopo diversi tentativi di colorazioni su un espettorato di un paziente affetto da tubercolosi e mediante osservazione al microscopio ne scopri la forma bacillare. Egli fu anche in grado di isolarlo e coltivarlo per estrarne successivamente la proteina della tubercolina. Fu così lui a scoprire che l agente eziologico della tubercolosi era il micobatterio Vie di trasmissione La trasmissione della tubercolosi avviene principalmente per via aerogena. Per infettarsi un individuo deve inalare particelle di aerosol contenti i bacilli tubercolari. La diffusione di tali particelle avviene attraverso colpi di tosse, starnuti emessi da una persona infetta ed infettiva, quindi portatrice di una tubercolosi aperta e perciò in grado di trasmetterla. La prova di una tubercolosi aperta è costituita dalla presenza di micobatteri nell espettorato. Ovviamente se i micobatteri presenti nell espettorato sono morti, come può capitare in pazienti già trattati e guariti, il pericolo d infettarsi venendo in contatto con essi è nullo. Le particelle tubercolari quindi, fluttuano sospese nell aria in goccioline di 15 µm e possono essere inalate da altri individui sani. Queste goccioline una volta inalate raggiungeranno gli alveoli del nuovo ospite. 3

7 La probabilità di essere infettati dipende principalmente dalla concentrazione di micobatteri nell aria dal tempo d esposizione e dalla situazione immunitaria della persona che viene in contatto con queste particelle. (2) Fasi cliniche della malattia Una volta che i micobatteri inalati raggiungono il parenchima alveolare danno una lesione di tipo essudativo dove i macrofagi alveolari fagociteranno i micobatteri(risposta immunitaria aspecifica). Se questo tipo di lesione non riesce ad evadere il sistema immunitario andrà incontro ad una guarigione spontanea senza conseguenze. L infezione primaria: si sviluppa invece quando la sola risposta immunitaria aspecifica non riesce a risolvere l infezione. Così raggiunto un certo numero di macrofagi infetti, in cui i micobatteri riescono a sopravvivere protetti dalla loro parete, tra la seconda ed ottava settimana dal contagio, entra in atto la risposta immunitaria cellulomediata che porta alla formazione del granuloma. Il granuloma è strutturato in: una parte centrale formata da cellule giganti polinucleate che contengono i micobatteri fagocitati, poi vi è una parte intermedia costituita da cellule epiteliodi disposte a raggiera che fungono da isolamento della parte centrale, ed infine il tutto è avvolto da uno strato periferico di fibroblasti, linfociti e monociti. Quando successivamente lo strato periferico viene avvolto da tessuto fibroso e la zona centrale incorre in necrosi caseosa, questa struttura prende il nome di tubercolo. A questo punto il tubercolo può rimanere circoscritto ed andare incontro a calcificazione, contenente ancora all interno micobatteri in grado di riattivarsi anche a distanza di anni; oppure la necrosi caseosa può fuoriuscire per via della rottura del tubercolo e dare luogo ad una cosi detta cavità tubercolare. Queste due strutture sono diagnosticabili con una radiografia toracica. L infezione postprimaria o riattivazione: può essere causa di reinfezione esogena da un nuovo ceppo, riattivazione di micobatteri tubercolari del complesso primario oppure riattivazione di granulomi formatisi nell infezione primaria. I sintomi sono una continua tosse per settimane o mesi, spesso nei fumatori passa inosservata. A livello di laboratorio segnali tipici che dovrebbero far pensare ad tubercolosi sono: un aumento della proteina Creattiva, una leucocitosi spesso accompagnata da monocitosi ed uno stato anemico. (2) Complicazioni della tubercolosi Le complicazioni che si possono verificare in seguito ad una tubercolosi sono: La tubercolosi extrapolmonare: ha una frequenza maggiore nei bambini piuttosto che negli adulti. Si tratta di una delocalizzazione dei batteri tubercolari, spesso per via ematica o linfatica, che raggiungendo altri organi possono dare luogo a queste forme particolari di tubercolosi. 4

8 Le tipiche forme di tubercolosi extrapolmonari sono: Linfadenite tubercolare caratterizzata da ingrossamento spesso indolore dei linfonodi. Si manifesta principalmente nei linfonodi cervicali e sottomandibolari e meno frequente quelli della zona mediastinica e retroperitoneale. Tubercolosi pleurica dovuta dalla diffusione d un infiltrato polmonare, a volte la diffusione raggiunge la pleure per via ematica. Tubercolosi urogenitale non sempre causa di una tubercolosi primaria. Infatti nel trattamento del carcinoma vescicale viene usato il M. B.C.G del ceppo vaccinale che favorisce la desquamazione dell epitelio vescicale riducendo l entità del tumore. In questo caso si tratta di una tubercolosi urogenitale terapeutica indotta e che non è conseguenza di una tubercolosi primaria con delocalizzazione. Tubercolosi ossea più frequente nei pazienti anziani Meningite tubercolare anch essa delocalizzazione del battere. Come sintomo della patologia si manifesta febbre ed alterazione rapida dello stato generale del paziente La tubercolosi miliare: è una forma di tubercolosi extrapolmonare molto particolare con prognosi negativa, con difficile risoluzione anche con trattamento. Colpisce soprattutto persone con un sistema immunitario indebolito. Prende il nome miliare perché la caratteristica di tale malattia è un polmone che nella radiografia si presenta tappezzato di numerosi piccoli granuli della grandezza di un chicco di miglio. A causa di una mancata risposta immunitaria efficiente i micobatteri riescono a raggiungere le vie linfatiche ed attraverso esse giungono nei linfonodi ed in tutto l organismo. Si può parlare di una sorta di setticemia tubercolare Figura 1: radiografia paziente con tubercolosi miliare con conseguenze gravissime per il paziente. Nella radiografia di fianco sono ben evidenziabili i numerosi focolai che si sono formati a causa di questa diffusione batterica. (2) 5

9 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria 1.4 Epidemiologia della tubercolosi SSMTTAB3 La tubercolosi rimane oggi giorno un problema d interesse mondiale, costituisce la seconda causa di morte nel mondoo subito dopoo l HIV. L Organizzazione Mondiale della Sanità(OMS) ha dichiarato l emergenza globale tubercolosi già nel Col programma DOTS( programm to stop tubercolosis diffusion), proposto dall OMS(sigla inglesee WHOWorld Health Organisation), il quale comprende delle linee guida per la gestione, la diagnosi, la cura e la registrazione dei casi,, ci furono già dei cospicui progressi con un successo di curaa del 85%. Ovviamente aumentano i casi dichiarati, che arrivano fino a cinque milioni quell anno, casi che senza queste nuove linee guida son sarebbero stati portati alla luce. Nel 2006 si sviluppa s un nuovo progetto the stopp TB strategy che per il 2015 prevede la riduzione del 50% della comparsa di nuovi casi e la diminuzione delle morti, in rapporto ai dati registrati nel L OMS, sempre inn prima linea nella lotta alla a tubercolosi, ha registrato tra il 2010 e il 2011 una diminuzione del 41% della mortalità, prospettando un buono scenario per il raggiungimento del traguardo prefissato entro il (3) Incidenza Stimare l incidenza della tubercolosi, cioè nuovi casi l anno, non è semplice, per via della concentrazione della malattia in certe aree geografiche. Nel 2011la stima è di 8,7 milioni di nuovi casi, quindii una frequenza di 125 casi su 100'000 abitanti: il 59% dei casi si registra in Asia, il 26% in Africa, mentre in Figura 2:incidenza TBC nel mondo anno 2011 Europa si ha il 4,3 % dei casi. Di questi 8,77 milioni di nuovi casi circa 1,2 milioni sono HIV positivi. (3) Mortalità Nel 2011 si stimano 1,4 milioni di morti l anno per tubercolosi, i dati mostrano una mortalità di 20 persone su 100' 000 abitanti, tenendo conto anche dei pazienti HIV H positivi. Rispetto al 1990 c è stata anche una riduzione della mortalità del 41%; in America la riduzione della mortalità ha raggiunto gli scopi prefissati per il 2015( mortalità<50% rispetto ai a dati registrati nel 1990).Il calcolo della mortalità equivale al numero di morti sul numero di malati l anno. (3) 6

10 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMTTAB Trattamento Il trattamento per la cura della tubercolosi prevede una fase inziale con utilizzo di una combinazioni con più farmaci tubercolari, con lo scopo di ridurre drasticamentee il numero di micobatteri presenti. Successivamente si attua un trattamento t a lungo termine per eliminare tutti i micobatterii residui. Prima di iniziare il trattamento si dovrà indentificare il microrganismo ed effettuare i test di sensibilità ai farmaci antitubercolari. Questi farmaci antitubercola ari di prima linea sono l isoniadzide e la rifampincina che hanno funzione battericida, uccidono il battere; l etambutolo che funziona come batteriostatico, contenendo la replicazione dei micobatteri presenti ed il piradzinamide che in associazione ai precedenti aiuta ad abbreviare i tempi della durata terapeutica. (2) Resistenze antibiotiche della tubercolosi Una delle problematiche che oggi interessa il trattamento delle tubercolosi è la resistenza antibiotica che certi ceppi tubercolari sviluppano nei confronti di medicamenti della prima linea. Si tratta di resistenze all isoniadzide, rifampicina, etambutolo e pirazinamide e. Queste resistenze vengono diagnosticate con test di sensibilità, che possono prevedere un ulteriore chiarimento con l utilizzo di analisi genetiche. Le resistenze si riscontrano maggiormente in pazienti: già trattati in precedenza, provenienti dall estero o con età superiore ai 65 anni. Le principali resistenze sono quella all isoniadzine ed alla rifampicina. Per questi pazienti andrà applicato un protocollo terapeutico differente che andrà scelto dii caso in caso. (2) La tubercolosi nel territorio t svizzero Sempre più bassi i numeri di casi c di tubercolosi in Svizzera, solo nel 2009 si riporta un lievee aumento con 556 casi di tubercolosi, da ricondurree ad un ondata migratoriaa proveniente dal corno dell Africa. Rimane comunque in calo il numero di tubercolosi tra gli originari della Svizzera, mentre dal 1996 le resistenze antibiotiche registrate rimangono pressoché invariantee con una prevalenza della resistenza all isoniadzine. Dai dati raccoltii tra il 2005 e il 2009 emerge che nel 71% dei casi di tubercolosi si tratta di persone nate all estero o di nazionalità straniera. (2) 7

11 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMTTAB3 È inoltre dimostrata una correlazione tra richieste d asilo e casi di tubercolosi, nel 2009 sii parla di 91 casi di tubercolosi su 159 richieste d asiloo e rifugiati. Confrontand o malati di tubercolosi svizzeri e quelli stranieri si delinea una discrepanza in base all età: 67 anni nei n casi d origine Svizzera e 33 nei casi di migranti. Questo è da ricondurre alle condizioni socioeconomiche differenti; oggi giorno in Svizzera il rischio di venire in contatto conn la tubercolosi è basso rispetto r a quello che si presenta nei paesi in via di sviluppo da dove provengono la maggioranza dei migranti. In svizzera sono piuttosto le persone anziane a presentaree tubercolosii poiché nella loro giovinezza erano decisamente più a rischio di contrarre la malattiaa infatti spesso si tratta di casi di riattivazione, tipici nelle condizioni in cui il sistema immunitario diventa meno efficiente come l avanzare dell età (2). Dal grafico sopra che riporta l età e l origine dei malati di tubercolosi tra il 2005 e il 2009 si s può vedere che nei casi di tubercolosi tra gli stranieri l età in cui si ha più p frequenza della malattia e nella giovinezza tra i 20 ed i 40 anni (2) Rischio di contrarre la tubercolosi Maggiormente infettivi sono i pazienti chee presentano un espettorato spontaneo o indotto positivo per la microscopia. Vivere in ambienti dove vi è una persona infettiva aumenta di molto la possibilità di contrarre la malattia per contagio. La probabilità di essere contagiati è proporzionale alla durata d esposizione ad ambienti con pazienti infetti. Tra tutti i tipi di tubercolosi soloo quella polmonare presenta la possibilità di contagio. Un altoo rischio di contrarre la malattia m è la condizione d immunosoppressione, tra questi casi sono molto noti quelli di pazienti HIV positivi, poiché nelle loro condizioni la malattia è in grado di progredire. Anche i bambini al di sottoo dei 5 anni sono s una categoria a rischio. (2) Rimane quindi importante l indagine ambientale, che indentifica i casi d infezione tubercolare. 8

12 1.5 Diagnostica Biosicurezza Prima di parlare concretamente dei vari test diagnostici è importante interrogarsi sulle misure di sicurezza da intraprendere all interno del laboratorio. Trattare materiale infetto da micobatteri del complesso tubercolare richiede l utilizzo di misure di sicurezza diverse rispetto al normale trattamento di materiale biologico per la determinazione indiretta della malattia tramite sierologia. I batteri vengono suddivisi in quattro classi di rischio: Agente biologico di gruppo 1 (nessuno o basso rischio individuale e collettivo) Agente biologico di gruppo 2 (moderato rischio individuale, limitato rischio collettivo) Un agente che con poca probabilità è causa di malattie nell uomo o negli animali. Un agente patogeno che può causare malattie nell uomo o negli animali, ma che è poco probabile che costituisca un serio pericolo per chi lavora in laboratorio, per la comunità, per il bestiame e per l ambiente. Le esposizioni in laboratorio possono causare patologie, ma sono disponibili trattamenti efficaci e misure preventive e il rischio di diffusione è limitato. Agente biologico di gruppo 3 (elevato rischio individuale, basso rischio collettivo) Un agente patogeno che usualmente causa gravi patologie nell uomo o negli animali e costituisce un serio rischio per i lavoratori. Difficilmente si propaga nella comunità e comunque sono disponibili efficaci misure terapeutiche e preventive. Agente biologico di gruppo 4 (elevato rischio individuale e collettivo) Un agente patogeno che normalmente provoca gravi patologie nell uomo e negli animali, costituisce un serio rischio per i lavoratori e può propagarsi rapidamente nella comunità. Non sono di norma disponibili efficaci misure terapeutiche e preventive. Il micobatterio fa parte della classe III della classificazione degli agenti biologici a rischio d infezione. Un battere di classe III può causare malattie gravi in soggetti umani e costituisce un serio rischio per i lavoratori; l agente biologico può propagarsi nella comunità, ma di norma sono disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche. Dopo questa classe ne segue solo una: la quarta con rischi maggiori, dove sono classificati microrganismi che causano malattie per cui odiernamente non sono disponibili cure, come ad esempio l HIV. Si deve quindi pensare al livello di biosicurezza d applicare nel laboratorio diagnostico. Per il trattamento di espettorati senza coltura basta un livello di biosicurezza 1 o 2, come sono attrezzati già il laboratori dell Ente, quindi anche quello dell Ospedale Regionale di Mendrisio. 9

13 Solo in caso di coltura sarà necessario avere un livello di biosicurezza 3 che prevede un aria dedita solo per tali manipolazioni con accesso controllato, ventilazione a pressione negativa senza riciclo d aria, cappe di sicurezza come il livello due. (4) Test diagnostici classici Di regola uno dei primi esami diagnostici che si esegue davanti ad un sospetto di tubercolosi è la radiografia polmonare accompagnata da esami di batteriologia. La radiografia polmonare permette di identificare alterazioni polmonari ed indurre quindi a proseguire l indagine medica. Generalmente l immagine radiologica positiva va di pari passo con la successiva identificazione della presenza di micobatteri tubercolari nella batteriologia. Le lesioni tipiche riscontrabili sono le caverne e le lesioni da tubercolosi miliare. A causa delle lesioni aspecifiche, che possono esserci anche se non si tratta di tubercolosi, essa non può costituire da sola un mezzo diagnostico. La batteriologia si base sull esaminazione di materiale clinico sospetto per presenza di micobatteri. I materiali indagati sono molteplici. Si tratta principalmente di espettorato spontaneo o indotto, ma si può eseguire una ricerca di micobatteri su liquido di lavaggio ed aspirato bronchiale, urina, puntati, secreti, pus, dializzato, linfonodi, liquor, succo gastrico (tipicamente nei bambini),biopsie, feci, sangue e midollo osseo. I materiali non sterili dovranno subire un processo di decontaminazione ed arricchimento prima di essere inseminati su terreni di cultura. I campioni dovranno subire dei pretrattamenti. Questi pretrattamenti sono: la decontaminazione e la digestione: La fluidificazione che consiste nel sciogliere lo sputo in modo da ottenere un campione più fluido e meglio maneggiabile. Generalmente si usa della sputolisina. La decontaminazione prevista per i materiali che in origine non sono sterili per la presenza della flora batterica residente. La risospensione dopo centrifugazione in tampone fosfato Il materiale può essere anche concentrato tramite centrifugazioni. Una volta fissato il materiale sul vetrino si potrà procedere con le colorazioni. (2) Microscopia delle colorazione dei micobatteri A causa dell alcolacido resistenza, non si utilizza la colorazione di Gram per identificare microscopicamente i micobatteri. Sono necessarie delle colorazioni speciali Attualmente al servizio di microbiologia Eolab sono utilizzate due colorazioni specifiche per questo tipo di batteri: Ziehl Nielsen ed auramina. 10

14 Colorazione ZiehlNielsen: mette in evidenza i bacilli alcolacido resistenti. Viene adagiata la soluzione di fucsina sul vetrino e successivamente scaldando a fiamma il preparato si creano dei pori nella parete dei micobatteri e il colorante riesce cosi a penetrare nella parete batterica. Segue una decolorazione con alcolacido e una colorazione di contrasto con blu di metilene. I batteri alcolacido resistenti risulteranno colorati di rosso, mentre i batteri che non possiedono tale resistenza assumeranno una colorazione blu come si vede dall immagine accanto. Figura3:http://www.oocities.org/gbruno _2000/mico.htm Colorazione fluorocromica con Auramina: questa è una colorazione in fluorescenza. I preparati andranno dunque osservati sotto microscopio a fluorescenza. Il limite questa tecnica è la rilevabilità a concentrazioni di almeno bacilli per millilitro. Con questa colorazione i bacilli risulteranno colorati di giallo su uno sfondo nero, mentre gli altri batteri non saranno visibili (microscopio a fluorescenza). Figura4:http://www.lung.ca/tb/images/full _archive/107_bacillus.jpg di Il vantaggio della colorazione ad auramina è che aumenta la possibilità di visualizzare anche pochi micobatteri poiché solo loro emettono fluorescenza mentre la flora residente,che è presente normalmente negli espettorati,non emettendo fluorescenza, non costituisce intralcio nella visualizzazione. Nell osservazione microscopica dei preparati colorati con le colorazioni sopracitate si darà un valore in base alla quantità di micobatteri riscontrabili: pochissimi, pochi, alcuni, numerosi e numerosissimi. Questo valore costituisce il risultato dell analisi microscopica. 11

15 Coltura: è complementare all osservazione microscopica sia perché la coltura permette la valutazione di vitalità dei micobatteri sia perché se la quantità di micobatteri presenti nell espettorato fosse cosi bassa da non essere visibile nella microscopia in coltura moltiplicandosi sarebbe evidenziabile la loro presenza. Si possono verificare casi in cui campioni con una microscopia negativa siano positivi per la coltura. Esistono terreni di coltura: Solidi: tubi contenti il terreno. Vengono utilizzati due tipi differenti di terreni: il Löwenstein Jensen ed il Colestos. Una volta inseminati i terreni vengono incubati a 37 per otto settimane in posizione orizzontale, per favorire l inseminazione dell intera superfici. I tappi a vite dei tubi vengono aperti leggermente per far entrare l anidride carbonica (che è presente tramite bombola nell incubatore) poiché ne favorisce la crescita dei micobatteri. Liquidi: contengono antibiotici con arricchimento di crescita. L antibiotico aiuterà a non far crescere rimasugli della flora residente. Questi tubi di terreno liquido vengono incubati in un apparecchio, il MGIT, il quale con lettura fotometrica segnalerà la presenza di una crescita nelle successive otto settimane d incubazione. Il MGIT viene utilizzato anche per testare le sensibilità antibiotiche dei micobatteri resistenti. Il principio di lettura è sempre fotometrico. La coltura può positivizzarsi anche dopo una settimana, tutto dipende dalla quantità di micobatteri inseminati e dalla loro vitalità e velocità di crescita. Per ogni coltura positiva viene poi effettuata una colorazione di Gram ed un ZiehlNielsen per essere certi di avere una crescita micobatterica ed escludere un eventuale crescita di altri batteri che si trovavano nel materiale, flora residente del luogo di prelievo del campione. Crescite aspecifiche saranno comunque di rilevanza clinica nel caso il materiale di partenza doveva presentarsi fisiologicamente sterile. I test di sensibilità agli antibiotici vengono effettuati sempre tramite MGIT. Il MGIT è un apparecchio che funziona come incubatore a 37 C per le provette contenti i campioni in coltura liquida; esso è in grado di rilevare l anidride carbonica prodotta dall utilizzo di ossigeno dei micobatteri poiché marcata radioattivamente. Quando si trova la coltura positiva si può procedere anche ai test di resistenza antibiotica sempre tramite MGIT. Questo consente di fornire al medico informazioni importanti per la scelta del trattamento farmacologico per la terapia di pazienti affetti da tubercolosi. La microscopia e la coltura costituiscono ancora oggi il GoldStandard per la ricerca dei micobatteri tubercolari. Come Gold Standard s intendono le analisi atte ad eliminare dubbi che possono sorgere 12

16 con altre analisi. Quindi per la rilevazione dei micobatteri l analisi più efficace ed efficiente è la microscopia con la coltura. (5) (6) Altri test oltre alla batteriologia classica sono disponibili: Test della tubercolina È un intracutaneo, viene iniettata della tubercolina, si formerà una bolla ed a seconda della presenza o meno di anticorpi contro questa proteina del micobatterio si svilupperà una zona indurità. La lettura del test avviene dopo 72 ore e si misura questo indurimento in termini di millimetri. Sono noti falsi positivi da infezione con micobatteri ambientali e precedente vaccino con ceppo BGC. Questo perché la positività al test indica solo che il paziente è venuto in contatto con il micobattere e che ne ha una memoria immunologica. IGRA (Interferon Gamma Release Assays) Questo test si basa sulla produzione di Interferone Gamma da parte dei linfociti T stimolati con dopo incubazione con tre antigeni di Mycobacterium tuberculosis: ESAT6, CFP10 e TB7.7. Il vantaggio di questi test è l assenza di falsi negativi da vaccino con BGC. o da infezioni con altri micobatteri non tubercolari. Attualmente i più comuni IGRA test sono: il QuantiFERONTB Gold InTube ed il TSPOT.TB (2) (5) Test molecolari I test di biologia molecolare con ricerca del materiale genetico tubercolare costituiscono oggi un complementare ai gold standard della batteriologia classica. Sono dei metodi PCR cioè di amplificazione genetica. Sono meno sensibili ma altamente specifici. Purtroppo con un analisi di questo tipo non si verifica la vitalità dei micobatteri, ciò significa che potrebbero essere trovati anche micobatteri morti. Questi utilizzano la tecinica PCR e Real Time PCR PCR e PCRrealtime. La tecnica PCR consiste nell utilizzare una coppia di primer ed una DNA polimerasi per amplificare un segmento specifico di DNA. Si susseguiranno dei cicli termici che consistono in una fase di denaturazione del DNA a temperatura elevata, una fase di appaiamento dei primer, a temperatura inferiore rispetto alla denaturazione ed una fase di estensione del filamento a singola catena del DNA con una temperatura intermedia. L amplificazione sarà esponenziale. La realtime PCR utilizza delle sonde a fluorescenza, rileva e quantifica un segnale di fluorescenza, che direttamente proporzionale alla quantità di materiale amplificato, ciò permette di monitorare l amplificazione durante i cicli. La quantità di target è inversamente proporzionale al numero di cicli necessari al rilevamento del 13

17 segnale fluorescente soglia definito anche C T (threshold cycle). Threshold Cycle è il numero del ciclo in cui la fluorescenza diventa positiva e quindi rilevabile. Poiché il C T viene determinato durante la fase esponenziale di amplificazione, il risultato è di gran lunga più affidabile di quello ottenibile in endpoint con la PCR tradizionale. Come End Point si intende un risultato disponibile solo alla fine dell amplificazione e non indica a che ciclo il materiale è messo in evidenza. Per la ricerca dei micobatteri tubercolari si possono utilizzare varie zone del DNA come target. Dovranno essere delle zone conservate in tutti i micobatteri del complesso tubercolare Le più note sono: il rdna 16S una fra le regione più conservate nei batteri IS6110 è una sequenza di basi in grado di duplicarsi e di spostarsi all interno del genoma di micobatteri del complesso tubercolare; di essa è possibile ritrovarne fino a 25 copie, anche se nella grande maggioranza dei ceppi il numero è compreso fra 5 e 20 (5). 14

18 2 Motivazione della scelta del lavoro di diploma La tubercolosi, malattia fino a poco tempo fa considerata debellata nei paesi occidentali, si sta ripresentando. La riemergenza sarebbe dovuta a flussi migratori, zone in gravi condizioni di povertà e casi d immunodepressione. Questa problematica interessa anche la Svizzera e la realtà ticinese. Nella maggior parte dei casi che si presentano in Ticino, si tratta di soggiornanti nel centro asilanti di Chiasso. La gestione di tali casi è presa principalmente in gestione dall Ospedale Regionale di Mendrisio (OBV). Introdurre una diagnostica rapida come quella del kit MTBRIF Xpert permetterebbe una diagnostica della tubercolosi in tempi brevi e consentirebbe d isolare precocemente il paziente, evitando cosi altri contatti e contaminazioni, nonché aiuterebbe a contenere parte delle spese sanitarie, particolarmente quelle generate dall isolamento del paziente. 3 Obiettivo Lo scopo di questo lavoro di diploma è quello di validare l analisi per la ricerca di micobatteri del complesso tubercolare con il kit MTBRIF GeneXpert della Cepheid. Kit che oltre a rilevare la presenza del M. tubercolosis Complex è in grado di rilevare la presenza delle resistenze alla Rifampicina, medicamento di prima linea per il trattamento delle tubercolosi. L introduzione in routine di tale analisi non andrebbe comunque a sostituire le attuali analisi di microscopia diretta e coltura dei micobatteri presso il servizio di microbiologia Eolab. Si tratterebbe di aver un primo risultato in due ore, che in caso di positività consentirebbe d isolare immediatamente il paziente aiutando quindi il trattamento di tali casi all interno dell equipe medica. In caso di rilevamento della resistenza alla rifampicina, si avrebbe una prima indicazione terapeutica. 15

19 4 Test MTBRIF Genexpert L Xpert MTBRIF è un sistema semiquantitativo per la messa in evidenza di DNA di micobatteri del complesso tubercolare (MTBC) e presenza delle mutazioni del gene rpob responsabili della resistenza alla rifampicina su campioni d espettorato, tramite realtime PCR utilizzando come apparecchio il Genexpert System. L integrazione in routine dell MTBRIF fornisce due informazioni importanti per il sospetto di tubercolosi: La detezione di genoma micobatterico del complesso tubercolare Un eventuale mutazione che porta alla resistenza alla rifampicina L esecuzione di questo test comporta la manipolazioni con campioni con potenziale presenza di micobatteri del complesso tubercolare. È necessarie quindi misure di sicurezza adeguate al trattamento di un battere di classe III. Il laboratorio dovrà perciò disporre di una cappa a flusso laminare dove poter effettuare le manipolazioni sul materiale clinico d analisi in totale sicurezza. 4.1 Cappa a flusso laminare Il primo passo per l introduzione di tale analisi è stato quindi l acquisto di una cappa a flusso laminare di cui il laboratorio dell Ospedale di Mendrisio non era a disposizione. La scelta è stata una cappa biologica a flusso laminare verticale di tipo due. La principale caratteristica è quella di proteggere l operatore grazie al flusso verticale ed allo schermo regolabile che separa l operatore dalla zona di lavoro. È dotata di: quattro filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air filter), d illuminazione, prese di corrente attivabili dai tasti esterni, lampada raggi UV con attacco a calamita e possibilità di regolazione timer. Funzionamento: l aria pressurizzata spinta nell aria di lavoro, attraverso motoventilatore, passa, insieme all aria proveniente dall esterno attraverso la griglia bucherellata,che costituisce la superficie del piano di lavoro. Da li viene aspirata nel canale che porterà l aria nel retro della cappa dove passa attraverso il filtro HEPA. Parte di essa viene rigettata all esterno nell ambiente e parte torna nella zona di lavoro. Il nome flusso laminare è dovuto proprio a quest unidirezionalità dell aria che crea una corrente d aria omogenea priva di turbolenze. Per assicurare il flusso laminare l operatore dovrà utilizzare la cappa nel modo corretto, cioè tenere l apertura al minimo indispensabile 20 cm circa e non coprire la Figura 5: movimento aria in una cappa a flusso laminare 16

20 superficie poiché interrompe il flusso omogeneo e causa il rigetto dell aria della zona di lavoro all esterno costituendo cosi un pericolo di contaminazione della zona circostante l aria di lavoro qualora si fosse creato dell aerosol durante la manipolazione di campioni infetti da TBC. Cura della cappa: terminate le manipolazioni si pulisce la cappa con disinfettanti appositi per i micobatteri, si chiude la cappa e si attiva la lampada raggi UV per circa tre ore per effettuare una sterilizzazione dell aria di lavoro, eliminando eventuali tracce di micobatteri che durante le manipolazioni possono essere stati sparsi nell aria di lavoro. (7) 4.2 GeneXpert GeneXpert della ditta Cepheid è un apparecchio di biologia molecolare automatizzato in grado di eseguire una PCR realtime e dei principiali processi associato ad esso cioè: l estrazione del DNA, l amplificazione del Target e il rilevamento; utilizzando delle cartucce fornite dai vari kit per le diverse analisi. I kit che siamo andati a utilizzare con il sistema GeneXpert è l Xpert MTBRIF, per la ricerca dei micobatteri del complesso tubercolare, fornito sempre dalla ditta Cepheid. 4.3 Descrizione dell analisi Prima di poter iniziare con l analisi, si deve pretrattare il campione. Il pretrattamento consiste nel fluidificare il campione utilizzando il reagente campione, che ha la funzione di omogenizzare il campione e ridurre la vitalità dei micobatteri per abbassare i rischi infettivi. La cartuccia utilizzata, fornita nel kit, è costituita da quattro aree di reazione un tubo di aspirazione centrale che comunica con il filtro sottostante e degli scompartimenti dove sono contenuti i reagenti, che contengono i tamponi con surfattanti, e le microsfere, che contengono i costituenti necessari per la PCR realtime (primer, sonde, KCl, MgCl₂, HEPES ph 8,BSA, HEPES ph 7,2, polimerasi, dntp). Una volta dispensato il campione nella camera del campione ed inserita la cartuccia nel modulo, l apparecchio introdurrà il pistone nella camera di aspirazione e procederà all aspirazione del campione nella zona attiva. Con un sistema di pressione spinge il campione sul filtro aspira i diversi reagenti contenti i tamponi e procede con la fase di estrazione del DNA,che avviene mediante un corno sonoro che causa la lisi dei bacilli tramite ultrasuoni. Il materiale genetico liberato passa oltre la membrana del filtro e viene spinto nelle camere di contenimento delle prime due microsfere. Tramite il controllo PCC l apparecchio verifica l idratazione delle sfere liofilizzate ed al momento opportuno inietta il campione con le sfere reidratate nella camera di reazione dove avverrà la prima reazione PCR. Terminata la prima reazione dispensa il materiale nella camera contente le altre sfere liofilizzate. Come prima appena l idratazione sarà completa ridispensa il campione nella camera di reazione e avviene un altro ciclo con l utilizzo della detezione della fluorescenza. 17

21 4.4 PCR realtime La PCR realtime viene utilizzata come applicazione in campo medico per determinare la presenza di DNA anche a concentrazioni molto basse. Costituisce cioè un metodo altamente sensibile. Utilizza dei cicli termici per le differenti fasi della PCR: Denaturazione (9496 ) In questa fase avviene l apertura della catena a doppia elica Ibridazione (5656 ) La temperatura dipende dai primer utilizzati. In questa fase i primer si legheranno al Dna Target single strand. Estensione del filamento Fase in cui la polimerasi andrà a costruire il filamento complementare al DNA target utilizzando i dntps. Nel susseguirsi di questi cicli, generalmente 30, le copie di filamento che verranno a formarsi saranno raddoppiate per ogni ciclo completato. Si ha quindi un amplificazione esponenziale dei filamenti di DNA target. L amplificazione non andrà avanti all infinito, è limitata dalla quantità dei dntps, dall attività della polimerasi e dall ibridazione dei filamenti del DNA target. Si raggiunge quindi una fase di plateau, dove il numero di copie rimane invariato. Il numero di copie ottenuto è proporzionale alla quantità di DNA templato inizialmente presente nel campione. La realtime PCR ha proprio il vantaggio di poter monitorare la crescita esponenziale, fornendo dei risultati semiquantitativi in tempo reale. Ciò avviene grazie all utilizzo della fluorescenza. Questa fluorescenza si ottiene o con l intercalare nel DNA di sostanze coloranti fluorescenti o con l ibridazione di sonde specifiche fluorescenti, come nel caso del kit MTBRIF. La lettura della fluorescenza avviene attraverso un light termocycler che nel caso del GeneXpert è contenuto nel modulo. 18

22 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMTTAB3 4.5 Regionee di resistenza per la rifampicina Nell analisi PCR realtime del Kit Xpert MTBRIF viene analizzato il gene rpob per la resistenza alla rifampicina. È noto che tutte le resistenzee alla rifampicina sono dovute a mutazioni del gene rpob. Il kit contiene cinque differenti sonde che possono ibridizzare coprendo l interaa zona di 81bp del gene. Figura 6: sequenza del gene di resistenza alla rifampicina In questo modo si riescono a metterein evidenza tutte le possibili mutazioni che avvengono del gene rpob. Quando non viene rilevata una fluorescenza delle cinque sonde che ibridizzano ciascuna zona del filamento di DNA del gene, vuol dire che nella zona identificata dalla sonda c è stata una mutazione per cui essa non riesce ad ibridizzare, ciò spiega la mancanza del segnale. (8) 19

23 5 Materiali e metodi Campioni clinici I campioni clinici su cui si può effettuare l analisi MTBRIF GeneXpert sono: Espettorato spontaneo o indotto Sedimento di espettorato dopo decontaminazione (forniti dal servizio di microbiologia) Tutti i materiali vanno considerati potenzialmente infetti Materiali non forniti nel kit Cappa a flusso laminare: ditta: EHRET modello: BIOSAFE numero di serie: 4574 Genexpert: ditta: Cepheid modello: numero di serie: analizzatore automatico di biologia molecolare, con computer, lettore cd, lettore codice a barre e manuale dell operatore non disponibile la stampante pipette sterili falcon per diluire il campione vortex guanti contenitore per smaltimento rifiuti disinfettante portaprovette per falcon 20

24 5.1.3 materiale del kit cd: file di definizione del saggio istruzioni per l importazione dellafd nel software GX foglio illustrativo pipette di trasferimento con tacca che segna il volume minimo di campione 10 cartucce Xpert MTB/RIF con provette di reazione integrate 10 flaconi da 8ml di Reagente del Campione(RC) :idrossido di sodio e isopropanolo In ogni cartuccia: Microsfera 1: primer, sonde, KCl, MgCl₂, HEPES Ph 8, BSA(sieroalbumina bovina) Microsfera2:sonda, polimerasi, KCL, MgCl₂, dntp, HEPES, ph 7,2,BSA Microsfera 3: circa 6000 spore di controllo non infette per la preparazione del campione Reagente 1: 4ml tampone Tris,EDTA e surfattanti Reagente 2: 4ml tampone Tris,EDTA e surfattanti (8) 5.2 Controlli di qualità Ogni analisi include: un controllo di elaborazione del campione (SPC) e un controllo per la sonda (PCC) L SPC contiene spore non infette mentre il PCC misura il segnale emesso dalle sonde per controllare la reidratazione delle sonde contenute nelle microsfere liofilizzate. (8) 5.3 Principio della procedura GeneXpert Dx System consente di integrare e automatizzare l analisi dei campioni, l amplificazione degli acidi nucleici e il rilevamento delle sequenze bersaglio in campioni semplici o complessi, utilizzando la PCR in tempo reale e trascrittasi inversa. Il kit non fornisce le temperature di denaturazione di ibridazione e di estensione del filamento. (8) 5.4 Procedimento Preparazione del campione di espettorato(lavoro sotto cappa a flusso laminare) Assicurarsi che il campione non contenga materiale alimentare. Etichettare le cartucce con l identità del paziente o scrivervi il nome ai lati 21

25 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMTTAB3 Sotto cappa aggiungere nel contenitore del campione il reagente campione in volume: 2:1(2 volumi di reagente per 1 volume di campione)per l espettorato 3:1(3 volumi di reagente per 1 volume di campione) per ill sedimento di espettorato Ritappare e assicurarsi che sia ben chiuso ermeticamente Mescolare vigorosamente per volte Incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente mescolando di tanto in tanto. I campionii devono risultare liquefatti e omogenei Aprire la cartuccia senza toccare la linguetta retrostante Porzionare con la pipetta all interno della cartuccia, aspirando fino alla prima tacca e trasferirla nell apertura aposita senza creare bolle. Richiudere bene la cassetta Precauzioni : il lavoro sotto cappa deve rispettaree le norme base di sicurezza del trattamento di materiale potenzialmentee infetto. Quindi utilizzo di guanti e modalità di lavoro accurato sotto cappa, cioè evitare la creazione di aerosol e non eseguire manovre che possano interrompere il flusso laminare della cappa. Esecuzione del test (all apparecchio GeneXpert) Andare all apparecchio GeneXpert, creare il test, Scansionare prima l etichetta a barcode del paziente o Inserire il numero del paziente a mano Scansionare il codice a barre dellaa cartuccia e cliccare su start s test. Attendere la luce verde lampeggiante Aprire il modulo segnalato dall apparecchio Inserire la cartuccia facendola scivolare dentro dolcemente Richiudere bene lo sportelletto del modulo La luce verde non dovrebbe più lampeggiare e il test è in esecuzione. Nella schermata del computer c è visualizzabile l icona test in esecuzione Al termine dell analisi la luce verde sopra il modulo si spegne e il test sarà visibile il risultato. Lo sportello del modulo si sarà aperto automaticamente Estrarre la cartuccia e gettarla nel bidone giallo per i materiali biologici contaminati (8) 22

26 Lavoro di diploma Lettura del risultato Cuccu Luciana Maria SSMTTAB3 Cliccando sul l ID del test sarà possibile visualizzare :la primary curve ed il testt report La primary curve È un diagramma che mostra il segnalee fluorescente delle variee sonde utilizzate nel kit fornendo come informazione a che ciclo la fluorescenza diventa positiva per la singola sonda che nel grafico è indentificata dall diverso colore. Di fianco al grafico è disponibile la didascaliaa delle sonde fluorescenti. (8) Il test report: Fornisce i dettagli della primary curve in termini numerici. Con il Ct sii sa a che ciclo la zona indentificata dalla sonda risulta positiva e l end point da il valore numerico finale ad analisi terminata. Le principali informazioni sono fornite dal test result: la detezione della presenza di micobatteri e l eventuale detezione della presenza di resistenza allaa rifampicina. 23

27 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMTTAB3 24

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