Caratterizzazione biologica del tessuto cutaneo in seguito ad omogeneizzazione

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1 Caratterizzazione biologica del tessuto cutaneo in seguito ad omogeneizzazione V. Purpura 1, M. Ghetti 1, E. Bondioli 1, P. Minghetti 1, D. Melandri 1, M. Riccio 2 Accademia del Lipofilling Centro Studi di Ricerca e Formazione in Chirurgia Rigenerativa 1 U.O. Centro Grandi Ustionati e Banca regionale della Cute Emilia Romagna, Ospedale M. Bufalini di Cesena Azienda USL della Romagna, distretto di Cesena 2 U.O. Chirurgia Plastica e Ricostruttiva della mano, AOU Ospedali Riuniti, Ancona, Italia Questo studio è stato condotto con la partecipazione dell Azienda Fidia Farmaceutici S.p.a. Introduzione Gli esperimenti di seguito descritti sono volti alla caratterizzazione biologica del tessuto cutaneo omologo (Cute, Derma de-epidermizzato ovvero Ded e Derma) in seguito ad omogeneizzazione con il sistema Rigenera. L omogeneizzazione del tessuto cutaneo potrebbe infatti consentire l ottenimento di una sospensione cellulare autologa da utilizzare nella guarigione delle ferite cutanee acute e/o croniche a varia eziologia (ulcere cutanee). Piano sperimentale Ogni campione è stato diviso in due parti. Una parte è stata sottoposta ad omogeneizzazione mediante l utilizzo dello strumento Rigenera, mentre l altra parte è stata mantenuta integra (controllo). I campioni omogeneizzati sono stati poi sottoposti a: Test di vitalità cellulare con Sali di tetrazolio (MTT test) Valutazione della morfologia cellulare al microscopio ottico Controlli microbiologici di sterilità Campioni I risultati di seguito descritti sono stati ottenuti in seguito all omogeneizzazione di 4 tessuti cutanei ottenuti da 4 differenti donatori compresi in un range d età da 40 a 55 anni in cui il tessuto cutaneo prelevato risultava dello stesso spessore. In particolare: Cute Ded Derma CAMPIONE 1,6 mm 1 mm 2 mm SPESSORE La sperimentazione è stata documentata da foto esplicative.

2 Campioni di Cute, Ded e Derma delle stesse dimensioni sono stati ottenuti utilizzando punch da 5mm. In particolare, dato il diverso spessore delle tre tipologie di tessuto cutaneo omologo, abbiamo processato per ogni punto sperimentale rispettivamente n.8 punch di Cute, n.4 punch di Ded e n.3 punch di Derma secondo lo schema previsto per l utilizzo di Rigenera (Fig 1). I campioni utilizzati per ogni punto sperimentale sono stati inoltre pesati prima dell omogeneizzazione per identificarne il peso totale (gr). FIG 1

3 Test di vitalità cellulare con Sali di tetrazolio (MTT test) I campioni di Cute, Ded e Derma sono stati omogeneizzati per tempi differenti in modo tale da identificare il tempo di omogeneizzazione più idoneo a mantenere la vitalità cellulare del tessuto in esame. In particolare sono stati scelti i seguenti tempi di omogeneizzazione: CAMPIONE Cute Ded Derma TEMPO I campioni omogeneizzati ed i corrispondenti controlli sono stati incubati con i sali di tetrazolio per 3h in incubatore 5% CO 2 a 37 C. Il formazano formatosi nei tessuti vitali è stato successivamente dissolto in dimetil solfossido (DMSO) e la vitalità cellulare dei campioni è stata identificata mediante analisi allo spettrofotometro alla lunghezza d onda standardizzata di 570 nm. I grafici di seguito riportati indicano il valore medio della vitalità cellulare dei diversi tessuti integri (Fig 2) o omogeneizzati (Fig 3) espresso come valore percentuale.

4 FIG 2 FIG 3

5 Inoltre, per valutare il mantenimento della vitalità cellulare nel tempo in seguito ad omogeneizzazione, è stato effettuato il test di vitalità cellulare MTT su Cute, Ded e Derma di uno stesso donatore anche 24h e 7gg dopo l omogeneizzazione (Fig 4-5-6). FIG 4 FIG 5

6 FIG 6

7 Valutazione della morfologia cellulare al microscopio ottico Infine, la vitalità cellulare dei campioni analizzati a 24h e 7gg è stata valutata anche mediante analisi al microscopio ottico (Fig. 7-8). In particolare, è stata effettuata l omogeneizzazione di n.8 punch di Cute o di n.3 punch di Derma ed il tessuto omogenato corrispondente è stato messo in coltura (flasca T25) in terreno RPMI + 1% antibiotico (PSA) + siero fetale bovino (FBS). Sono state quindi fotografate le cellule dopo 24h di coltura (Fig. 7-8). Successivamente, vista la mancata adesione alla flasca di coltura, la sospensione cellulare è stata trasferita in flasca T75 ed è stato aggiunto nuovo terreno di coltura RPMI + 1% PSA+ FBS. Sono state quindi fotografate le cellule dopo 7gg di coltura (Fig. 7-8). FIG 7 CUTE

8 FIG 8 DERMA Controlli microbiologici di sterilità Per valutare infine se il processo di omogeneizzazione potesse essere svolto mantenendo la sterilità dei tessuti, sono stati incubati su piastra microbiologica Agar Sangue (COS- Biomerieux) i punch dei tessuti sottoposti ad omogeneizzazione sotto cappa a flusso laminare (Fig 9). L analisi della sterilità su tessuto dopo 3 giorni di incubazione delle piastre in condizioni standard (Incubatore 37 C) ha dimostrato una assenza di crescita batterica su tutti i punch di tessuto analizzati.

9 FIG 9 Osservazioni pratiche La nostra esperienza preliminare suggerisce alcune osservazioni pratiche: Adagiare il tessuto all interno della capsula mediante l uso di pinze sterili avendo cura che aderisca omogeneamente sulla lastra Aggiungere la soluzione fisiologica (1,5 ml) nel foro presente nella capsula mediante l uso di siringa senza ago Aspirare la sospensione cellulare dopo omogeneizzazione mantenendo la capsula in posizione verticale Al fine di preservare la sterilità del prodotto, se non si lavora sotto cappa a flusso laminare, non aprire mai la capsula se non per inserirvi al suo interno il tessuto Conclusioni Il processo di omogeneizzazione con il sistema Rigenera, nonostante riduca notevolmente i livelli di vitalità cellulare rispetto al campione integro, è in grado di mantenere la vitalità cellulare del tessuto cutaneo anche per tempi prolungati. Nonostante ciò, la presenza di singole cellule in coltura è identificabile solo dopo periodi brevi di omogeneizzazione (24h). Sulla base dei dati preliminari condotti su 4 differenti donatori, è ipotizzabile, come più idoneo al mantenimento della vitalità cellulare, il seguente tempo di omogeneizzazione nelle tre tipologie di tessuto cutaneo analizzate: CAMPIONI Cute 5 Ded 1 Derma 2 TEMPO

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