PROTOCOLLO D USO G6PD-BC GLUCOSIO-6-FOSFATO DEIDROGENASI (D-glucosio-6-fosfato: NADP ossidoreduttasi; G6PD, E.C )
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- Sabina Sole
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1 PROTOCOLLO D USO (D-glucosio-6-fosfato: NADP ossidoreduttasi; G6PD, E.C ) Strumenti AU480, AU680, AU5800 Beckman Coulter BCS BC BCS BC Pagina 1 di 6
2 Kit per la determinazione quantitativa dell'attività della G6PD su campione di sangue intero secondo la standardizzazione proposta dall' WHO (WHO-37) 1, con strumenti AU480, AU680, AU5800 Beckman Coulter. La carenza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi è un difetto enzimatico ereditario che colpisce oltre 200 milioni di persone in tutto il mondo: la principale manifestazione clinica è costituita da crisi emolitiche acute dovute ad ingestione di fave o di particolari farmaci, ma anche da infezioni batteriche o virali. La carenza dell enzima viene trasmessa come carattere legato al cromosoma X: i maschi esprimono interamente la mutazione, mentre le femmine possono risultare omozigoti o eterozigoti rispetto al difetto. PRINCIPIO L'attività della G6PD viene calcolata spettrofotometricamente in base ai valori di assorbanza a 340 nm del NADPH prodotto nel corso della reazione: G6P + NADP+ 6PGA + NADPH + H+ in cui: G6P = D-glucosio-6-fosfato; NADP+ = nicotinamide adenindinucleotide fosfato; 6PGA = 6-fosfogluconato. I risultati vengono espressi in rapporto alla concentrazione emoglobinica, riscontrabile nello stesso emolizzato dal quale si determina l'attività enzimatica. Il kit è costituito da tre soluzioni: REAGENTI FORNITI SOLN A (2) SOLN B (1) SOLN C (1) BCS BC 2 flaconi contenenti cadauno 19,5 ml di soluzione emolizzante 29 ml di reagente di Drabkin 29 ml di miscela di reazione per la G6PD SOLN A (1) SOLN B (1) SOLN C (1) BCS BC 19,5 ml di soluzione emolizzante 14,5 ml di reagente di Drabkin 14,5 ml di miscela di reazione per la G6PD1 MATERIALE CONSUMABILE NECESSARIO NON FORNITO PER L ESECUZIONE DEL TEST Puntali monouso con filtro per la manipolazione dei campioni STRUMENTAZIONE NECESSARIA NON FORNITA PER L ESECUZIONE DEL TEST Cappa a flusso laminare Pipette a volume variabile compreso tra 20 e 380 Frigorifero (temperatura 2 C 8 C) Freezer (temperatura -16 C -24 C) È necessario che tali dispositivi siano sottoposti ad un piano di manutenzione e verifica dello stato di taratura da parte del personale del laboratorio di utilizzo. Pagina 2 di 6
3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Il dispositivo va utilizzato per uso di diagnostica in vitro. 2. Il dispositivo va utilizzato secondo la procedura riportata nel protocollo senza effettuare alcuna modifica 3. Il dispositivo va utilizzato esclusivamente ad opera di personale qualificato in laboratori d analisi chimico-cliniche. 4. La manipolazione dei reagenti e dei campioni biologici non richiede particolari avvertenze se non quelle di attenersi alle comuni norme di buona pratica di laboratorio, (esempio: non mangiare, bere, fumare in laboratorio; utilizzare guanti monouso, camice e protezione per gli occhi; lavare le mani dopo aver manipolato reagenti e campioni). 5. La strumentazione necessaria ma non fornita va sottoposta ad un piano di manutenzione e verifica dello stato di taratura da parte del personale del laboratorio di utilizzo. 6. Non utilizzare reattivi provenienti da kit differenti e con diverso numero di lotto. 7. Non utilizzare il dispositivo oltre la data di scadenza riportata nella confezione. 8. Conservare il dispositivo secondo le indicazioni riportate nelle etichette. 9. Trattare come rifiuti ospedalieri i kit non utilizzati entro il periodo di vita utile, nonché i reagenti utilizzati ovvero miscelati con i campioni, nel rispetto della normativa in vigore. 10. Utilizzare puntali monouso con filtro per le micropipette per ciascun campione al fine di ridurre eventuali fenomeni di cross-reazione. 11. Utilizzare Controlli di Qualità (Normale, Intermedio, Carente) al fine di monitorare la funzionalità del sistema. 12. La diagnosi finale va, come per qualsiasi dispositivo IVD, elaborata esclusivamente da personale medico competente in seguito alla presa visione dell intero quadro clinico del paziente. 13. Su specifica richiesta al fornitore è possibile fruire di un training in affiancamento ad uno specialist. CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE Tutti i reagenti sono pronti all uso e vanno conservati a 2 C 8 C, al riparo dalla luce. Il kit G6PD (Cod. BCS180954/ Cod. BCS180955) è stabile entro la data di scadenza indicata sulla confezione se conservato in maniera adeguata. CAMPIONE Sangue intero reso incoagulabile con K3EDTA, ACD, eparina. Il campione contenente la G6PD "selvatica" (variante B) può essere conservato in frigorifero a 2 C 8 C per quattro giorni prima di effettuare l'analisi, senza che si verifichi qualche sostanziale perdita di attività; si ricorda tuttavia che la maggior parte delle varianti enzimatiche, quali la Mediterranea possiedono una minor sopravvivenza rispetto all'enzima selvatico; in tali casi si sconsiglia la conservazione in frigorifero del campione e si raccomanda di effettuare l'esame entro il giorno stesso del prelievo. PROCEDURA DI UTILIZZO CON STRUMENTI BECKMAN COULTER AU480, AU680, AU5800 Il sistema è da utilizzarsi sugli strumenti BECKMAN COULTER AU480, AU680, AU5800: per l utilizzo degli strumenti fare riferimento al Manuale d uso specifico. Impostare nello strumento le metodiche relative alla determinazione dell emoglobina e della attività enzimatica utilizzando i parametri sotto riportati Nome Test G6PD Tipo Siero Abilita SI Vol.camp. 10.0μl Diluiz. 0 μl Vol. Pre-diuz. 1 Volume reagente R1(R1-1) 125 μl Diluiz. 0 μl R2(R2-1) 0 μl Diluiz. 0 μl Lunghezza d onda Pri. 340nm Sec. 540nm Metodo Rate Slope reazione + Pagina 3 di 6
4 Punti di lettura Primo 11 Ultimo 16 Punti di lettura BC Primo Ultimo Linearità cin. 25% Lag time NO Limite OD OD Min OD Max 2.5 Limite OD reag. Pri Basso Alto 2.5 Ult Basso Alto 2.5 Linearità metodo Basso 0 Alto 120 Fattore correlaz. A 1 B 0 Fattore per maker A 1 B 0 Periodo stab. a bordo 90 giorni 0 ORA CALIBRAZIONE Tipo calibrazione MB Formula Y=Ax+B Fattore tipo MB 217 PARAMETRI APPLICATIVI Nome Test Hb Tipo Siero Abilita SI Vol.camp. 10.0μl Diluiz. 0 μl Vol. Pre-diuz. 1 Volume reagente R1(R1-1) 125 μl Diluiz. 0 μl R2(R2-1) 0 μl Diluiz. 0 μl Lunghezza Pri. 570nm Sec. 700nm d onda Metodo End Slope reazione + Punti di lettura Primo 0 Ultimo 5 Punti di lettura Primo Ultimo BC Linearità cin. Lag time Limite OD OD Min OD Max 2.5 Limite OD reag. Pri Basso Alto 2.5 Ult Basso Alto 2.5 Linearità metodo Basso 0 Alto 20 Fattore correlaz. A 1 B 0 Fattore per maker A 1 B 0 Periodo stab. a bordo 90 giorni CALIBRAZIONE Tipo calibrazione AB Formula Y=Ax+B Punto 1 Valore Emoglobina Factor /OD (L-H) Impostare nello strumento una metodica calcolata Attività enzimatica /Concentrazione emoglobinica (G6PD/Hb) Prima di effettuare la determinazione è necessario effettuare una calibrazione della metodica Emoglobina utilizzando un campione di sangue al 15% (valore 0,75), fare riferimento al Manuale d uso dello strumento. Pagina 4 di 6
5 Preparazione dell emolizzato: miscelare 10 l di sangue intero in 190 l di soluzione A; l'emolizzato in oggetto va utilizzato sia per la determinazione della concentrazione emoglobinica che per la determinazione dell'attività enzimatica. Caricare l emolizzato in macchina ed effettuare la determinazione della Metodica Emoglobina e della Metodica G6PD. PRESTAZIONI Dalle prove effettuate il kit (Cod. BCS BC/ Cod. BCS BC) ha dimostrato un Indice di Concordanza totale pari a 1 ed una Deviazione Standard calcolata su ripetizioni di Controlli Normali, Intermedi, Carenti pari a L Indice di Concordanza valutato utilizzando Campioni reali precedentemente testati è pari a 1 Campioni Test Normali Intermedi Carenti Normali Intermedi Carenti L Indice di Concordanza valutato utilizzando Controlli G6PD Normali, Intermedi, Carenti è pari a 1 Campioni Test Normali Intermedi Carenti Normali Intermedi Carenti Le ripetizioni intersaggio dei Controlli Normali, Intermedi, Carenti (3 differenti sedute, con ripetizioni dei controlli, realizzate in 3 giornate diverse, con strumenti diversi, utilizzando differenti confezioni del sistema G6PD di un unico lotto e diverse confezioni di controlli di un unico lotto) hanno fornito una Deviazione standard complessiva pari a 0.99 Controlli normali Valore medio 18.1 DS 1.99 Controlli intermedi Valore medio 6.81 DS 0.83 Controlli carenti Valore medio 1.07 DS 0.17 Dalle prove effettuate il kit G6PD BC (Cod. BCS BC/ Cod. BCS BC) risulta avere: una sensibilità diagnostica del 97.8%; una specificità diagnostica del 97.9%. FATTORI DI INTERFERENZA Il valore dell'enzima è sotto l'influenza della vita media dei globuli rossi: è possibile, in seguito anche a lievi modificazioni dell' indice reticolocitario, che vi sia anche un marcato aumento della G6PD, soprattutto con maggiore frequenza nelle donne che hanno lievi oscillazioni di questo indice durante il ciclo mestruale. Anche chi è portatore sano di beta o alfa microcitemia può avere un valore un pochino più elevato di G6PDH. Valori superiori a quelli di riferimento possono anche essere sintomo ittero neonatale, anemia perniciosa, traumi, malattia di Werlhof o di altre patologie. Valori inferiori rispetto a quelli di riferimento possono essere causati da anemia emolitica, infezioni, ipocromia, deficit marziali, microcitemie, leucocitosi di grado marcato, trombocitosi estreme, somministrazione di sulfamidici o altri farmaci. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I risultati vengono espressi sotto forma di rapporto fra attività enzimatica e concentrazione di emoglobina rilevabile dallo stesso campione (Ul/gHb) 1,2. Il risultato ottenuto va confrontato con la tabella sottoriportata per poter classificare ciascun campione come normale, intermedio o carente. Valori minimi Valori massimi Maschi normali 9,52 / Pagina 5 di 6
6 Maschi carenti 0,10 2,71 Femmine normali 10,22 / Femmine eterozigoti 3,55 10,22 Femmine carenti 0,10 2,95 L analisi dei risultati di una seduta G6PD permette facilmente ad un operatore esperto (anche in assenza di controlli) di verificare la razionalità dei risultati e la funzionalità del sistema, purchè tale seduta contenga più di un campione: nello specifico la presenza di campioni maschi refertati come intermedi o ad esempio la refertazione di 4 campioni su 4 come carenti (o anche 3 su 3) dovrebbe immediatamente far scattare un campanello d allarme CONFEZIONI E DETERMINAZIONI Il prodotto è in commercio nella confezione da: test (codice BCS BC); test (codice BCS BC) In presenza di risultati anomali si consiglia: 1 valutare il corretto inserimento dei parametri nello strumento; 2 valutare il corretto prelievo, stoccaggio e conservazione del campione; 3 valutare il corretto caricamento in macchina del campione e l assenza di bolle; 4 valutare che tutte le procedure siano state eseguite correttamente; 5 verificare che i reattivi siano stati conservati a temperatura adeguata (2 C 8 C) ed al riparo dalla luce. Nel caso in cui, conclusi tutti i controlli di routine, persista l anomalia di risultati, contattare la bcs Biotech S.r.l. 1. WHO Techn. Rep. Ser. 366, ICSH - Br. J. Haematol. 35: , 1977 Bibliografia - International Committee for Standardisation in Haematology: Recommended Methods fo Red-Cell Enzyme Analysis (E. Beutler; K. G. Blume, J.C.Kaplan, G.W.Lohr, B.Ramot and W.N.Valentine) - Normalisation des techniques d étude de la Glucose-6-phosphate-déshydrogénase (Organisation Mondiale de la Santé) - Standardization problems relevant to quantitative laboratory methods for glucose 6- phosphate- dehydrogenase e deficiency detection (R. Paleari, F. Ceriotti, P. A. Bonini, A. Mosca) - Preliminary experience with the differtial ph technique for glucose 6 phosphate dehydrogenase (G6PD) measurement in whole blood : application to an area with high prevalence of thalassaemia and G6PD deficiency (A. Mosca, M. Paderi, A. Sanna, R. Paleari, A. Cao, R. Galanello) - Deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi e farmaci, (Rapporto Istituto Superiore di Sanità), Rapporti ISTISAN 09/47, (D. Maffi et. Al) bcs Biotech S.r.l. Sede Legale:Via Bellini, Cagliari- Uffici e Lab.: Viale Monastir n. 112, Cagliari, Italia Tel Fax biocs@tin.it Indirizzo web: CCIAA di Cagliari N C.F. e P.I. N Capitale Sociale ,00 Interamente Versati UNI EN ISO 9001:2008-UNI EN ISO 13485:2012 CERTIFICATO N 671- N Pagina 6 di 6
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