BIO-FLASH. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n Lliçà d Amunt - Barcelona - SPAIN

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1 VEDI CAMBI RISALTATI BIO-FLASH anti-hiv tests BIO-FLASH anti-hiv 1+2 è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualititativa degli anticorpi contro il virus HIV-1 e HIV-2 nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è stato determinato essere l agente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) nel ,2 L AIDS è una condizione causata da due retrovirus correlati, denominati HIV-1 e HIV-2, i quali attaccano il sistema immunitario, riducendone le difese e consentendo la comparsa di infezioni opportunistiche, spesso gravi e mortali, nonché tumori. Il numero di persone affette da HIV a livello mondiale è in crescita e nel 2008 è stato stimato in circa 33 milioni. 3 Il numero di decessi dovuti a malattie correlate all AIDS è tuttavia in lenta diminuzione, grazie alle terapie antiretrovirali impiegate. L HIV si trasmette per contatto diretto di una mucosa o del flusso sanguigno con un fluido corporeo contenente il virus. Lo schema di trasmissione varia in base alla zona geografica: in Europa occidentale, Nord America ed Australia la trasmissione avviene maggiormente tra la popolazione ad alto rischio, quali ad esempio soggetti di sesso maschile che hanno rapporti omosessuali e consumatori di droghe iniettive, mentre nell Africa subsahariana è predominante la trasmissione eterosessuale e quella da madre a figlio. Il virus HIV-1 è la causa della maggior parte delle infezioni da HIV a livello mondiale, mentre il virus HIV-2, scoperto nel , è meno virulento ed infettivo rispetto all HIV-1 ed è principalmente limitato all Africa occidentale. La struttura del virus HIV-1 consiste in un nucleo contenente RNA, le proteine del nucleocapside e gli enzimi necessari per lo sviluppo del virione, avvolto da un capside composto dalla proteina virale p24. Il nucleo è rivestito da una matrice composta dalla proteina virale p17. L intera struttura è circondata dall'involucro virale, formato da un doppio strato lipidico composto da proteine delle cellula ospite e da una glicoproteina complessa. Il complesso è costituito da tre molecole esterne denominate glicoproteina gp120 e da una glicoproteina complessa transmembranica, formata da tre molecole gp41. Sebbene i virus HIV-1 e HIV-2 abbiano diversi epitopi comuni negli antigeni del nucleo, le glicoproteine del loro involucro mostrano una minore reattività crociata. L immunotest BIO-FLASH anti-hiv 1+2 sfrutta antigeni ricombinanti con sequenze appartenenti sia al virus HIV-1 che HIV-2. I due virus si differenziano l un l altro per l uso delle due proteine ricombinanti specifiche dell involucro, la gp41 e la gp36. La misurazione degli anticorpi anti-hiv viene utilizzata per l analisi del sangue o di prodotti ematici al fine di impedire la trasmissione del virus, oltre che per diagnosticare sospette infezioni da HIV. La diagnosi dell infezione da HIV è importante per motivi di sicurezza infettiva, prevenzione e prognosi individuale. Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH anti-hiv 1+2 si mescolano e si incubano con il campione. Se esso presenta anticorpi specifici anti-hiv, questi ultimi si combinano con gli antigeni dell HIV che ricoprono le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si aggiunge un tracciatore consistente in antigeni HIV marcati con isoluminolo, che si uniscono agli anticorpi anti-hiv catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di anticorpi anti-hiv del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori.

2 Schema della reazione: Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissión di luce Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH anti-hiv 1+2 contiene una cartuccia reagenti per 100 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565, 741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 3 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con antigeni ricombinanti HIV purificati (nucleo HIV-1 p24, involucro HIV-1 gp41 e involucro HIV-2 gp36). Contiene < 0,1% di sodio azide. B. Posizione vuota. C. 1 contenitore opaco di tracciatore, consistente in antigeni ricombinanti HIV purificati (nucleo HIV-1 p24, involucro HIV-1 gp41 e involucro HIV-2 gp36), marcati con isoluminolo. Contiene < 1,0 % di Triton-X 100 e < 0,1% di sodio azide. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.

3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (Li-eparina, Na-eparina, Na-citrato, EDTA e ACD). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. Gli anticoagulanti liquidi come il Na-citrato esercitano un effetto diluente e possono ridurre la concentrazione dei campioni dei pazienti. L uso di plasma EDTA può aumentare la concentrazionei dei campioni di singoli pazienti. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non presentino bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non presentino bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un'unica prova con BIO-FLASH anti-hiv 1+2 varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 125 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH anti-hiv 1+2 Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH anti-hiv 1+2 Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni.

4 Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH anti-hiv 1+2 sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560, 816 / Disegno CE ) REF REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema) Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano tre controlli. I controlli BIO-FLASH anti-hiv 1+2 negativo, positivo anti-hiv-1 e positivo anti-hiv-2 sono stati progettati per il suddetto programma. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Assicurarsi che i risultati dei controlli si trovino all interno del range di accettazione, perché in caso contrario si potranno avere risultati non validi e l utente dovrà adottare misure correttive. In questo caso esaminare tutti i risultati ottenuti dall ultima verifica positiva del controllo di qualità dell analita in questione. Può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l'individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 5 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C e in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 10 settimane. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del test BIO-FLASH anti-hiv 1+2 sono espressi in S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo del numero di anticorpi presenti. La determinazione degli anticorpi anti-hiv con il test BIO-FLASH anti-hiv 1+2 è interpretata come segue: I campioni con un risultato < 0,90 S/CO si considerano non reattivi (negativi). I campioni con un risultato 0,90 e < 1,00 S/CO si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni con un risultato 1,00 S/CO si considerano reattivi (positivi). I campioni con risultato inizialmente reattivo o indeterminato devono essere rianalizzati in duplicato. Se entrambi i valori della ripetizione sono inferiori a 0,90 l'interpretazione finale del test è negativa per gli anticorpi anti-hiv. Se uno dei risultati della ripetizione del duplicato è positivo o indeterminato, il campione deve essere ulteriormente analizzato con test supplementari per avere una conferma del risultato. Un risultato positivo ripetuto indica un infezione da HIV. I campioni con concentrazioni di anticorpi anti-hiv superiori a 100,00 S/CO sono indicati come > 100,00. Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione da HIV. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH anti-hiv 1+2, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HIV. Come in tutti i test immunologici sensibili vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili.

5 Risultati attesi La prevalenza dell infezione da HIV negli adulti (età anni) varia notevolmente in base all area geografica, da valori inferiori allo 0,1% in Asia orientale all 1,0% dei Caraibi, con l eccezione del 5,2% di prevalenza in Africa subsahariana, con picchi del 25% in determinati paesi. La prevalenza di HIV in Europa varia da valori inferiori allo 0,1% in zone dell Europa centrale fino a oltre 1,0% in aree apparteneti all ex Unione Sovietica. 3 Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati. Specificità La valutazione della specificità si basa sul test di campioni di siero da donatori di sangue non selezionati, inclusi coloro che donano per la prima volta, e da pazienti ospedalizzati. In totale sono stati testati 9994 campioni freschi di siero non selezionati di due banche del sangue, 5060 del Banc de Sang i de Teixits de Catalunya (Spagna) e 4934 del centro EFS Centre Atlantique di Tours (Francia). Inoltre sono stati valutati 499 campioni di siero non selezionati provenienti da pazienti ricoverati nell ospedale di Santa Creu i Sant Pau (Spagna). I campioni ripetutamente reattivi sono stati ritestati ricorrendo ad un test di riferimento. Quindi è stata calcolata la specificità, con i risultati illustrati nella seguente tabella. Donatori di sangue da due diverse banche del sangue Campioni testati Inizialmente reattivi (IR) Ripetutamente reattivi (RR) RR risultanti indeterminati RR risultanti positivi Specificità n n n n n % ,6% Pazienti ospedalizzati ,8% Sensibilità La sensibilità è stata valutata mediante l analisi di campioni dalla positività HIV accertata, alcuni dei quali presso il Prince Leopold Institute of Tropical Medicine di Anversa (Belgio). La sensibilità è stata quindi calcolata per ciascun gruppo di campioni, con i risultati riportati nella tabella seguente: Campioni Gruppo di campioni testati Reattivi Sensibilità n n % anti-hiv-1 sottotipo A (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo C (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo D (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo F (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo G (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo H (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo J (gruppo M) % anti-hiv-1 sottotipo K (gruppo M) % Sottotipi anti-hiv-1 miscelati (gruppo M) % anti-hiv-1 gruppo O % anti-hiv % anti-hiv % Stesso giorno ( 1 giorno dalla raccolta) % Sensibilità alla sieroconversione La sensibilità diagnostica durante il periodo di sieroconversione è stata determinata mediante l analisi di campioni di 30 pannelli commerciali di sieroconversione per l HIV, di cui 25 di BBI Diagnostics (SeraCare) e 5 di Zeptometrix. Rispetto alla maggioranza degli altri metodi disponibili in commercio, la reattività equivalente è stata osservata con 25 pannelli, mentre la reattività precoce con 5. Lo studio dei 30 pannelli di sieroconversione indica che i risultati sono conformi alle Specifiche tecniche comuni CE (2009/886/CE).

6 Precisione Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A2, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media (S/CO) Intra-test Totale Controllo negativo 0,27 0,039 SD 0,064 SD Controllo positivo anti-hiv-1 3,43 2,57% CV 4,42% CV Controllo positivo anti-hiv-2 3,42 3,52% CV 4,56% CV Intorno al valore di cut-off 1,06 5,13% CV 7,60% CV Riproducibilità È stata valutata la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti, utilizzando 55 campioni. I risultati si mostrano nella seguente tabella: n Co-negatività Co-positività Duplicato 2 vs. Duplicato % 100% Lotto 2 vs. Lotto % 100% Strumento 2 vs. Strumento % 100% Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del BIO-FLASH anti-hiv 1+2: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi mg/dl 10 Fattore reumatoide 800 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Reattività crociata Sono stati analizzati con BIO-FLASH HIV 1+2 un totale di 107 campioni positivi per una serie di cross-reagenti e campioni di donne in stato interessante. Si suppone che un potenziale cross-reagente provochi una reattività crociata, quando la diagnosi passa da negativa a positiva o viceversa. I campioni reattivi sono stati testati con un test di riferimento per il quale non è stata dimostrata alcuna reazione crociata con la sostanza potenzialmente interferente. È stato confermato un campione reattivo HIV. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Reattività crociata potenziale Concordanza ANA (anticorpi antinucleari) 7/7 anti-cmv IgG (anticorpi contro il virus citomegalovirus) 5/5 anti-cmv IgM (anticorpi contro il virus citomegalovirus) 4/4 anti-ebv (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 3/3 anti-e.coli 8/8 anti-hcv (anticorpi contro il virus dell'epatite C) 5/5 Anti-HSV 1 IgG (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 1) 5/5 Anti-HSV 2 IgG (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 2) 5/5 anti-rubella 5/5 anti-vzv IgG (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 3/3 anti-vzv IgM (anticorpi contro il virus della Varicela Zoster) 3/3 IgG elevate 4/4 IgM elevate 3/3 HBsAg (antigene di superficie dell Epatite B) 5/5 HTLV (virus T-linfotropico umano) 5/5 Mononucleosis 9/9 Donne in gravidanza (incluse multipare) 9/9 RF (fattore reumatoide) 4/4 RPR (Rapid Plasma Reagin) 5/5 anti-toxo IgG (Toxoplasma gondii) 5/5 anti-toxo IgM (Toxoplasma gondii) 5/5

7 Limite di rilevamento e sensibilità analitica In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si situa a 0,48 S/CO. L analisi dello Standard operativo britannico di lavoro per anti-hiv 1 (codice NIBSC 99/ ) con il test BIO-FLASH anti-hiv 1+2 ha dato come risultato 6,49 S/CO, mentre il risultato dello Standard operativo britannico di diluzione 1 a 5 per anti-hiv 1 (codice NIBSC 99/ ) è stato di 1,28 S/CO. Il campione di monitoraggio per anti-hiv 2 (codice NIBSC 99/ ) con il test BIO-FLASH anti-hiv 1+2 ha dato come risultato 5,44 S/CO. Effetto prozona BIO-FLASH anti-hiv 1+2 è un test a due step. Il protocollo di analisi comprende una fase di lavaggio dopo l'incubazione del campione, che elimina l'effetto prozona. Sperimentalmente, non è stato osservato alcun effetto prozona con un campione di S/CO.

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