Estrazione acidi nucleici. Dott.ssa Concetta Quintarelli

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1 Estrazione acidi nucleici Dott.ssa Concetta Quintarelli

2 Materiale Biologico di partenza Campione Biologico Sangue -Periferico - Midollare Tessuti Paraffinati Ossa e Denti Bulbi capilliferi Villi coriali Liquidi Liquor Saliva L. cavitari Amniociti Modalità di prelievo Prelievo venoso Biopsia midollare Biopsia Villocentesi Amniocentesi

3 Fase di preparazione del campione Scopo: ottenere materiale in condizioni ottimali per indagini di tipo molecolare Requisiti: - Non danneggiare: non introdurre errori - Rilasciare ac. nucleici - Concentrare: ottenere una quantità adeguata di a. nucleici - Eliminare inibitori PCR - Stabilizzare: tempo, temperatura, luce deteriorano

4 Inibitori della reazione della PCR In quasi tutti i campioni biologi sono presenti sostanze con azione inibitoria sulla PCR che devono essere eliminate nella fase di preparazione del campione. Hb e suoi prodotti di degradazione Metalli pesanti (Fe ++ ) Proteine Lactoferrina Complessi polisaccaridici Eparina 4

5 IL PRELIEVO VENOSO Accesso alle vene attraverso un ago o un catetere per prelevare sangue È una procedura sterile fin quando la cute non è lesa Nessuna interferenza con gli acidi nucleici!!!

6 Precauzioni dell operatore NON svitare l ago dal supporto con le mani NON reincappucciare l ago Non buttare l ago nel bidone dei rifiuti speciali ma nel contenitore dei taglienti Contenitore dei taglienti

7 Manipolazione del campione Sangue periferico Sangue midollare Cellule mononucleate Buffy-coat Ficoll

8 Ficoll Hypaque Miscela costituita da un destrano ad alto peso molecolare (400 KD) e da un mezzo di contrasto iodato (Na metrizoato) Il destrano ha la capacità di dare una pseudoagglutinazione degli eritrociti per modificazioni della carica elettrica di superficie Il Na metrizoato consente di ottenere delle soluzioni ad alta densità

9 Metodica Ficoll -Diluizione del campioni 1:3 con soluzione salina neutra PBS. - Trasferire il Ficoll sul fondo della provetta in un rapporto 3:7 con il sangue diluito. - Il sangue diluito è stratificato sulla soluzione del Ficoll. Sangue diluito Ficoll-Hypaque (peso specifico = 1,.078) Centrifugazione (1500 RPM per 25 minuti)

10 Stratificazione delle componenti cellulari mediante metodica Ficoll Plasma Cellule mononucleate Ficoll-hypaque Eritrociti e granulociti Con questo metodo si ottengono sospensioni cellulari contenenti circa il 70% di linfociti e il 30% di monociti

11 Metodica Buffy-coat Direttiva 2004/33/CE Il Buffy-coat è costituito dai componenti del sangue ottenuti mediante centrifugazione di un unità di sangue intero e contenente una notevole quantità di leucociti e piastrine.

12 Purificazione del Buffy-coat Sangue intero Sangue dopo centrifugazione WBCs e RBCs dopo rimozione del plasma WBCs (buffy-coat) visto dall alto Campione dopo la rimozione del buffy-coat

13 Fasi della metodica Buffy-coat Lisi RBC (1 ml ammonio cloruro, K bicarbonato, EDTA, ph 7.4) Centrifugazione dei campioni di sangue periferico (1000 RPM per 10 a temperatura ambiente) Rimozione del plasma nella parte superiore della provetta Trasferimento del sottile strato di bianchi (WBCs) posizionati tra il plasma e i globuli rossi sul fondo della provetta in una Falcon da 15 ml.

14 Separazione dei leucociti da sangue (buffy coat) - Sangue in EDTA (5 ml) - Centrifugazione (1000 g, 10 min, temp ambiente) - Prelievo buffy coat - Lisi RBC (1 ml ammonio cloruro, K bicarbonato, EDTA, ph 7.4) - Centrifugazione, scartare il surnatante - Lavaggi con PBS - Pellet di leucociti - Conservare a -20 C

15 Preparazione altri tipi di campione Urina, liquidi cavitari: - centrifugazione (separazione componente cellulare e frazione liquida) Liquor: - concentrazione (molecole PM>100 dalton) Campioni delle vie respiratorie (BAL, espettorato): - fluidificazione con enzimi mucolitici - concentrazione delle cellule (centrifugazione) Campioni da biopsie: - disgregazione tessuto (bisturi, omogenizzatore) - eventuale lisi RBC presenti 15

16 La Villocentesi È il prelievo dei villi coriali (tra settimana) Permette di diagnosticare anomalie cromosomiche e genetiche, nonchè di stabilire su richiesta la paternità del feto. Comporta un rischio di aborto dell'1% (dipendente dalla manualità dell'operatore ) Rispetto all amniocentesi, fornisce una risposta più rapida (5 giorni dal prelievo) e più precoce (entro 13 settimane di gravidanza).

17 Principali malattie genetiche diagnosticabili con l analisi del DNA estratto dai villi coriali Tali malattie sono diagnosticabili nelle gravidanze a rischio specifico, cioè quando sussiste una familiarità o quando si sono rivelate in una gravidanza precedente. Distrofia muscolare Fibrosi cistica Talassemie Emofilia A e B Fenilchetonuria Corea di Huntington Sindrome adrenogenitale S. di Werdning Hoffman Immagine al microscopio di alcuni villi coriali (5 mg)

18 Liquido Amniotico Contiene cellule di origine fetale che possono essere messe in coltura per i successivi test diagnostici Viene prelevato mediante l amniocentesi (15-17 settimana). La principale complicanza è un aumento dell 0,5-1% al di sopra del normale rischio di aborto (2-3%).

19 Tessuto Per un campione di tessuto è necessaria un iniziale omogenizzazione che è realizzata mediante: Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter). Vibrazioni ultrasoniche Congelamento/scongelamento

20 Sonicatore Onde ultrasoniche nei liquidi producono il fenomeno della cavitazione (bolle) Durante la fase di pressione negativa si formano milioni di bolle che nella fase di compressione implodono con un drastico cambiamento della T e della pressione.

21 Frammentazione del DNA/RNA Danneggiamento a causa sollecitazioni meccaniche - maneggiare con delicatezza - no vortex a velocità elevata - no pipettamento eccessivo e vigoroso Digestione da parte di nucleasi cellulari - lavorare con i guanti - soluzioni e materiali sterili - soluzioni contenenti EDTA Azione metalli pesanti (rottura legami fosfodiesterici) - soluzioni contenenti EDTA 21

22 Estrazione Acidi Nucleici É il primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare. La metodica di estrazione è scelta in base: Materiale di partenza: organo intero, tessuto, coltura cellulare, sangue, liquido biologico. Tipo di a. nucleico di interesse: ssdna, dsdna, RNA. Applicazione post-estrazione: PCR, sequenziamento, clonaggio, restrizione enzimatica. Qualità dell a. nucleico: quantità, purezza.

23 Isolamento e Purificazione Di DNA E RNA Acidi nucleici Gli acidi nucleici sono una famiglia eterogenea di macromolecole distribuite all interno di tutte le cellule degli organismi viventi. DNA Nucleare (contenuto DNA/cellula mammifero) Organelli: mitocondri e cloroplasti (contenuto mtdna cellula eucariotica: <0.1% di tutto il DNA cellulare) RNA Nucleare (precursore: hnrna e snrna, snorna) Citoplasmatico (contenuto medio RNA/cellula) -rrna (75% dell RNA cellulare) -mrna -trna -scrna

24 Le Nucleasi Si trovano sulla pelle, per cui si devono evitare I contatti diretti o indiretti tra mani e a. nucleici. Le DNasi (enzimi che degradano il DNA): richiedono ioni metallici per l attività sono termolabili (autoclave) sono facilmente inattivabili da agenti chelanti Le RNasi (enzimi che degradano RNA): non richiedono cofattori possono adsorbirsi a vetro e plastica e rimanere attivi. sono attive in un ampio range di ph resistono alla sterilizzazione in autoclave

25 Fasi Della Purificazione Di DNA e RNA Anche se i protocolli sperimentali variano come già specificato, in tutti i casi dovremo: 1. Rompere la parete e/o la membrana cellulare: Lisi cellulare 2. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari: Deproteinizzazione 3. Separare gli acidi nucleici tra loro (per es. il DNA dal RNA): Precipitazione a. nucleico

26 Lisi Cellulare La procedura di lisi è spesso un compromesso: Abbastanza aggressiva da frammentare il materiale di partenza Abbastanza delicata da preservare l integrità dell acido nucleico Le tecniche di lisi si distinguono: Distruzione meccanica (lisi ipotonica o tramite sonicatore) Trattamenti chimici (lisi con detergenti) Digestione enzimatica (lisi con enzimi)

27 Reagenti utilizzati per la Lisi Detergenti Promuovono la rottura della membrana cellulare e dissociano le proteine dagli acidi nucleici (Tween20, Sodium Dodecyl Sulfate) Enzimi Degradano le proteine di membrana e anche le nucleasi cellulari (Proteinase K, Proteasi) Le moderne soluzioni di lisi utilizzano una combinazione di reagenti.

28 Precauzioni da adottare nella fase di Lisi cellulare Il lisato cellulare è esposto all attività di enzimi endonucleasici sia di derivazione esogena che endogena Inattivazione proteica

29 Agenti Denaturanti (Estrazione RNA) Sali di guanidinio (guanidinio cloruro, guanidinio tiocianato) Il guanidinio cloruro è un elettrolita forte; le proteine si dissolvono in soluzioni concentrate (4M e non 2M) perdendo la loro struttura secondaria e attività biologica. 2-mercaptoetanolo, un agente riducente in grado di rompere i ponti disolfuro delle proteine. Temperatura: lavorare mantenendo le provette in ghiaccio è un modo di inibire le ribonucleasi

30 Deproteinizzazione Lisato cellulare DNA RNA Lipidi Monosacc. Polisacc Sali Proteine Per evitare la degradazione degli a. nucleici Per favorirne la purificazione

31 Deproteinizzazione Estr. DNA/RNA - Utilizzo di solventi organici Fenolo (denatura le proteine) Cloroformio (solubilizza i lipidi) Isobutanolo - Metodo del salting out Utilizza alte concentrazioni saline per rimuovere le proteine (NaCl 6M) - Cromatografia A scambio anionico (matrice carica positivamente) Per adsorbimento (matrice di silice) - Sistema automatizzato

32 Metodica Fenolo/Cloroformio!! Procedimento da compiere sotto cappa aspirante

33 Estrazioni differenziali in Fenolo/Cloroformio ph neutro o alcalino ph acido Fase acquosa (DNA e RNA) Interfaccia (proteine denaturate) Fase fenolica (proteine solubili) Fase acquosa (RNA) Interfaccia (proteine denaturate) Fase fenolica (proteine solubili e DNA) Se si effettua un estrazione con fenolo, equilibrato con un tampone acido o con acqua, l RNA si ripartirà nella fase acquosa superiore mentre il DNA nella fase organica inferiore (o fase fenolica).

34 Estrazione del DNA precipitare gli acidi nucleici dalla fase acquosa La precipitazione degli acidi nucleici si ottiene usando varie combinazioni di sali ed alcool (es. NH4OAc 2M ed etanolo %) I sali si complessano con gli acidi nucleici, riducendone fortemente la solubilità in etanolo o isopropanolo Se la quantità di acido nucleico è bassa un carrier inerte (es. trna) può essere aggiunto per migliorare la resa Se si estrae da una bassa quantità di cellule la precipitazione è favorita dalla centrifugazione

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36 Fasi della Metodica Fenolo/Cloroformio (1) 1) Passare le cellule mononucleate conservate in GTC (guanidinio isotiocianato) con una siringa da tubercolina almeno 20 volte in modo che il campione sia completamente sospeso e fluidificato. 2) Prelevare 200 μl del campione e traferirlo in una provetta da 1.5 ml. 3) Aggiungere 20 μl di sodio acetato 2M, ph 4.0 ( 1.0), conservato a temperatura ambiente. 4) Aggiungere 200 μl di fenolo acido, tamponato con H 2 O distillata, ph 4 ( 1) e conservato a 4 C. 5) Agitare per almeno 15 secondi.

37 Fenolo/Cloroformio (2) 6) Aggiungere 40 μl di cloroformio conservato a 4 C 7) Agitare per 15 secondi. 8) Mettere il campione in ghiaccio per 15 minuti; nel frattempo impostare la centrifuga a 4 C 9) Centrifugare a r.p.m. per 15 minuti a 4 C. 10) Al termine della centrifugazione lasciare il campione a riposo altri 10 minuti.

38 Fenolo/Cloroformio (3) 11)Prelevare la fase acquosa facendo molta attenzione a non mescolare le due fasi. 12)Mettere il materiale prelevato in una nuova provetta. 13)Aggiungere un uguale volume di isopropanolo ( 200μl). 14)Agitare e porre il campione a -20 C over-night; in caso di massima urgenza porre il campione a - 80 C per 3 ore. 15)Centrifugare a r.p.m. per 15 minuti a 4 C. 16)Eliminare il sovranatante. 17)Aggiungere al pellet 800 μl di alcool etilico al 70%, conservato a -20 C. 18)Centrifugare a r.p.m. per 15 minuti a 4 C.

39 Fenolo/Cloroformio (4) 19) Eliminare il sovranatante e asciugare molto bene le pareti della provetta cercando di eliminare tutto il residuo dell alcool etilico (essiccatore o cappa aspirante). 20) Aggiungere al pellet μl di H 2 O RNAsi-free per eluire l RNA. 21) Incubare il campione a 50 C per 5 minuti per favorire il dissolvimento del pellet di RNA. 22) Al termine dell incubazione centrifugare le provette. 23) Aggiungere 1 μl di RNAsin (40 U/μl). 24) Conservare l RNA a -80 C fino all utilizzo.

40 Svantaggi delle metodiche convenzionali Tempi di estrazione molto lunghi Utilizzo di reagenti caustici e/o tossici Possibile perdita di DNA o contaminazione da proteine negli strati interfasici Possibile frammentazione meccanica del DNA

41 Estrazione su Membrana di silice

42 Membrana di silice Il metodo è basato sulla proprietà degli a. nucleici di adsorbirsi alla silice, a differenza delle proteine e di altri composti organici RNeasy Mini Procedure RNeasy Plant Mini Procedure

43 Estrazione di DNA su colonnina piccole quantità di campione di partenza Campioni biologici: sangue fresco o congelato (1 100 µl), campioni prelevati a scopo forense/tessuto (<10 mg tissue), sangue su cartoncino (~3 mm diametro) Rapido (30 minuti) Elevata qualità di DNA ad alto peso molecolare ( µl)

44 Il sangue intero viene incubato con una soluzione di lisi. Lisi delle membrane cellulari e degradazione delle proteine con Cloruro di Guanidinio e Proteinasi K DNA si lega ad una membrana di gel e silicone, mentre i contaminanti passano attraversano Alcune sostanze che potrebbero inibire la PCR (cationi divalenti e proteine) sono completamente rimosse in due step di lavaggio Il DNA purificato può essere eluito in acqua distillata e autoclavata *I passaggi si eseguono per centrifugazione

45 Sistema automatico di estrazione - Magnetic Nucleic Acid Purification - Sistema automatico che consente di estrarre gli a. nucleici da Sangue Plasma Siero Tessuti Riduzione degli errori legati all operatore Capacità di processare 32 campioni in 3 ore. Possibilità di preparare aliquote per le fasi successive riducendo i rischi di contaminazione.

46 Sistema di separazione magnetica Basato sull utilizzo di biglie di vetro magnetiche opportumante trattate per adsorbire a. nucleici di interesse: Ossido di ferro (Fe 3 O 4 )=Magnetite hanno la capacità di adsorbire il DNA/RNA, ma con alto ingombro sterico. Composti di silice accoppiati a magnetite modificata con gruppi carbossilici adsorbono il DNA/RNA in soluzioni contenenti PEG.

47 Sistema di separazione magnetica Sia il DNA che RNA sono separati dalle stesse biglie magnetiche. Allo scopo di eliminare RNA dal DNA, l RNA è distrutto prima della separazione del DNA, aggiungendo RNAse o alcali come NaOH. Allo scopo di eliminare DNA dal RNA, il DNA è degradato usando DNAse.

48 Magnetic Nucleic Acid Purification A B C D E F G H A) Aggiungere le cellule al sample cartridge. B/C) Aggiungere buffer di lisi per lisare le cellule e degradare il DNA/RNA D) Aggiungere le biglie di vetro magnetiche capaci di legare DNA/RNA in superficie. E) Le biglie leganti DNA/RNA sono intrappolate nella punta grazie all applicazione di un campo magnetico. F-H) DNA/RNA è sottoposto a lavaggi ed eluito dalle biglie ad una temperatura di 70 C mentre le biglie sono eliminate con il puntale. DNA/RNA è conservato a 4 C fino alla rimozione.

49 MagNA Pure LC Instrument Work Station Reaction tubs Sample cartridge L and S tips Processing cartridges Elution cartridge (70 C) Storage cartridge (4 C) Post elution preparation of PCR vials

50 MagNA Pure LC Instrument Controllo del processo Quando l estrazione è terminata il software mostra un pannello di controllo: In verde sono indicati tutti i campioni che non hanno incontrato problemi durante il processo; In rosso sono indicati possibili errori. In questo caso lo strumento identifica il possibile errore con un codice.

51 Valutazione qualitativa e quantitativa dell acido nucleico Per dosaggio di acidi nucleici si intende la determinazione della quantità di un acido nucleico in un determinato materiale biologico. E' possibile dosare gli A.N. essenzialmente con tre metodiche: 1) METODO SPETTROFOTOMETRICO 2) METODO COLORIMETRICO 3) METODO FLUORIMETRICO

52 METODO SPETTROFOTOMETRICO

53 METODO SPETTROFOTOMETRICO Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 260 nm, lo spettro di assorbimento varia da 230nm a 280 nm. D.O nm Gli A.N. hanno il massimo di assorbimento a 260 nm

54 METODO SPETTROFOTOMETRICO

55 LEGGE DI LAMBERT e BEER I Log = ε L c I Dove I = luce incidente I = luce trasmessa ε = coefficiente di estinzione molare L = cammino ottico c = concentrazione I L I

56 LEGGE DI LAMBERT e BEER Assorbanza= log I /I Assorbanza= densità ottica (D.O.) A= D.O. = l c L Assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce.

57 Dalla legge di Lambert e Beer A= D.O. = l c Se l= 1cm e c = 1M Allora la D.O. = Il coefficiente di estinzione molare rappresenta L Assorbanza (o densità ottica) di una soluzione a concentrazione 1M e a cammino ottico unitario Per gli acidi nucleici non è possibile stabilire a priori il loro peso molecolare dopo la estrazione e purificazione! Per gli acidi nucleici si usa il coefficiente di estinzione specifico (K), che rappresenta L Assorbanza (o densità ottica) di una soluzione a concentrazione 1mg/1ml alla lunghezza d onda di 260 nm. Quindi a 260 nm la C= D.O./K K = 21 per il DNA nativo a doppio filamento K = 23 per il DNA denaturato a singolo filamento K = 25 per l RNA C (mg/ml) = A / K

58 Coefficiente di estinzione molare medio Oppure: Il coefficiente di estinzione molare degli acidi è la somma dei coefficienti di estinzione molare di ciascun nucleotide. È impossibile calcolare questa somma per tutti i nucleotidi, quindi è usato un coefficiente di estinzione molare medio che è: 50 (mg/ml)-1 cm-1 per il DNA a doppio filamento 40 (mg/ml)-1 cm-1 per l RNA Quindi: C= A 260 x k x Fdiluizione 1A 260 di dsdna = 50 µg/ml 1A 260 di RNA = 40 µg/ml

59 Determinazione purezza Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza degli acidi nucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm. Rapporto A260/A280 = indice della contaminazione da proteine. DNA = RNA= proteine=0.6 Rapporti superiori indicano una contaminazione da proteine. L assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campione dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici. Rapporto A260/A230 = indice della contaminazione da carboidrati e fenoli (solventi) il valore ottimale di questo rapporto e di circa 2.2 Rapporti inferiori indicano contaminazione da solventi

60 Controllo Qualitativo dell RNA Spettrofotometro Spettrofotometro di nuova generazione, capace di un analisi accurata su un volume molto piccolo di campione (1 L). Il sistema brevettato non prevede l utilizzo di cuvetta o capillari, diminuendo i tempi della misurazione. Il sistema di lettura di un ampio range di assorbanza elimina la fase di diluizione.

61 Quantità di campione: 1 ul Determinazione: 10 secondi Size: 20 x 14cm

62 Campione di DNA concentrazione

63 Campione bianco

64 Campione di DNA frammentato

65 Spettri appartenenti a diversi campioni possono essere visualizzati contemporaneamente

66 Metodo Fluorimetrico In questo caso la concentrazione può essere stimata in base alla fluorescenza emessa dall Etidio Bromuro. Quantità crescenti e a concentrazione nota di acido nucleico vengono poste su gel accanto al nostro campione a concentrazione incognita. Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso in una soluzione di Etidio Bromuro che si intercala tra le basi dell'acido nucleico rendendolo fluorescente alla luce UV.

67 Metodo Fluorimetrico Controllo Qualitativo dell RNA Visualizzazione su gel Tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, ph 8.0) Gel di agarosio Generatore di corrente 100 V 0,2 A Scatola elettroforetica - +

68 Controllo Qualitativo dell RNA Visualizzazione su gel La qualità e la quantità dell RNA ottenuto possono essere verificate mediante dosaggio allo spettrofotometro ed elettroforesi su gel di agarosio al 2%.

69 Fase pre-analitica La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo, trasporto, trattamento e conservazione del campione è condizione preliminare ed essenziale per garantire l attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare. Percorso pre-analitico del campione - prelievo - conservazione (temperatura, tempo) - trasporto - trattamento del campione (estrazione acidi nucleici) - conservazione acidi nucleici

70 Errore pre-analitico Errore introdotto: - contaminazione crociata (falsi positivi) - frammentazione DNA per errata manipolazione Errore non eliminato: - inibitori della reazione di amplificazione

71 Prevenzione contaminazione Suddivisione fisica aree di lavoro 1. Area di preparazione del campione (isolamento cellule, estrazione a. nucleici) 2. Area di preparazione della reazione della PCR (preparazione soluzioni, aliquote, mix reazione) 3. Area di amplificazione e analisi degli amplificati (PCR, EF, tecniche ibridazione, sequenziamento) Comportamenti operatore - muoversi secondo il flusso area1--->area2--->area3 - mai entrare nell area 1 o 2 con prodotti amplificati - lavorare con i guanti (che vanno cambiati quando si cambia area)

72 Prevenzione contaminazione Organizzazione del lavoro - distribuzione materiale in funzione del tipo di lavoro (pipette, puntali, accessori differenti per ogni area) - strumentazione dedicata per ogni area - vetreria sterilizzata, materiale usa e getta - puntali con filtro (contaminazione canale pipette con aerosol contenenti a. nucleici) - soluzioni suddivise in piccole aliquote - pulizia superfici lavoro e apparecchiature con soluzioni decontaminanti (ipoclorito 2%)

73 Controllo di Qualità Interno Procedure per la realizzazione della qualità - Organizzazione del lab (aree pre- e post-amplificazione separate) - Controllo delle contaminazioni (guanti, materiali monouso) - Strumentazione (manutenzione periodica) - Reagenti (per biologia molecolare, piccole aliquote, data scadenza) - Metodiche (protocollo di lavoro scritto e dettagliato) Strumenti per la verifica della qualità (controlli) - Controlli positivi - Controlli negativi - Bianco di PCR - Controlli di estrazione (campione da paziente noto) - Controlli di amplificazione (a. nucleico già estratto)