ISTITUTO TECNICO PER ATTIVITÀ SOCIALI GIORDANO BRUNO PERUGIA LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

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1 ISTITUTO TECNICO PER ATTIVITÀ SOCIALI GIORDANO BRUNO PERUGIA LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni Febbraio 2008

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3 REPERTORIO DEI MODULI E DELLE UNITÀ DIDATTICHE 1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA pag L UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI pag OSSERVARE I MICRORGANISMI 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE pag COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA pag COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE pag COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA pag COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM pag LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI 3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE TECNICHE DI SEMINA pag I BATTERI DELLO YOGURT pag EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI pag CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA pag CONTA SU TERRENO LIQUIDO pag CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA pag ANALISI MICROBIOLOGICA DELL ACQUA POTABILE pag VALUTAZIONE DELL AZIONE INIBENTE DI ALCUNI DISINFETTANTI DI USO COMUNE pag ANTIBIOGRAMMA pag CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI MICRORGANISMI 5.1 UTILIZZAZIONE DELL AMIDO pag UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSI pag OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONE pag UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDI pag ENTEROTUBE pag INTERAZIONE MICRORGANISMI/UOMO 6.1 PROTEINA C REATTIVA pag TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICO pag. 79 APPENDICE TERRENI DI COLTURA pag. 81 BIBLIOGRAFIA pag. 90 1

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5 1. ALLA SCOPERTA DEI MICRORGANISMI U.D. 1.1 IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennarelli), non mangiare, bere e fumare in laboratorio. Non sedersi sopra i banconi e non appoggiarsi i agli strumenti. ti Indossare il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose. E compito di ciascuno mantenere i camici puliti e in buone condizioni. I capelli devono essere raccolti in modo da evitare contatti con superfici sporche o con la fiamma del bunsen. Non lasciare mai senza controllo reazioni in corso o apparecchi in funzione. Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone. Non portare in tasca forbici, tubi di vetro o oggetti taglienti e appuntiti. Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e, in particolare, alla fine dell attività lavorativa dopo la manipolazione di materiale biologico. Le apparecchiature di laboratorio devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo l uso. Sull etichetta dei reagenti sono riportati: nome del prodotto composizione chimica simboli di pericolosità frasi di rischio e sicurezza SIMBOLI DI PERICOLO Tossico: sostanza chimica che può causare danni acuti o cronici all organismo Infiammabile: qualsiasi sostanza liquida, solida, vapore o gas che si infiammi facilmente e bruci rapidamente. Materiale ossidante: sostanza in grado di rilasciare ossigeno che può incrementare o accellerare la combustione. Corrosivo: sostanza chimica che provoca distruzione visibile o alterazione irreversibile dei tessuti organici nel punto di contatto. Esplosivo: materiale che produce un istantaneo e improvviso rilascio di pressione, gas o calore quando sottoposto ad un brusco shock, pressione o temperatura. Irritante: materiale non corrosivo che causa effetti infiammatori reversibili sui tessuti viventi attraverso l azione chimica nel punto di contatto in funzione della concentrazione e del tempo di esposizione. 3

6 TECNICHE DI ASETTICITA Le finalità di queste tecniche sono: a) ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi b) svolgere il lavoro in laboratorio di microbiologia con sicurezza Una coltura pura è costituita solo da una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla pelle, nell aria, sulle superfici dei piani di lavoro. Le regole fondamentali delle tecniche di asetticità sono: - usare terreni e attrezzature sterili - lavorare vicini alla fiamma del bunsen - sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente - tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone - flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo - arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l intera lunghezza dell astina metallica, sia prima che dopo i prelievi - la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm - quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente - sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati, dopo l uso dentro apposite buste autoclavabili - disinfettare il bancone di lavoro accuratamente - sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto INCUBAZIONE DELLE COLTURE Scrivere sulla base della piastra Petri prima dell inoculo indicando il nome dell operatore, la data, il nome del microrganismo, in modo da riconoscere la piastra e sapere ciò che contiene. Le colture pure in piastra devono essere sigillate con nastro adesivo. 4

7 TECNICHE DI STERILIZZAZIONE Sterilizzazione: trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita. Può essere realizzata con: a- calore secco b- calore umido c- filtrazione CALORE SECCO a) aria calda La stufa a secco, utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio. I parametri d uso della stufa sono: 160 per per per 180 b) flambatura Alla fiamma del bunsen, si può sterilizzare la superficie esterna delle provette, o delle beute. La fiamma del bunsen esercita un azione germicida nell aria intorno alla fiamma per un raggio di circa 10 cm, creando una zona sterile. c) arroventamento Alla fiamma del bunsen, è anche possibile sterilizzare l ansa o l ago prima e dopo i prelievi. Pinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla fiamma. TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN 5

8 CALORE UMIDO a) tindallizzazione La soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100 C con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento è indicato per terreni nei quali possono crescere spore, le quali sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con il secondo e il terzo. b) vapore sotto pressione Per questa tecnica si usa l autoclave che unisce l azione del calore alla pressione. Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato. La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121 per 15. Tabella di sterilizzazione in autoclave: Temperatura Pressione (atm) tempo (minuti) 110 0, , ,35 6,5 FILTRAZIONE a) filtri millipore Si utilizza per le sostanze che non possono essere sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di grandezza superiore ai loro pori. b) membrane filtranti Per filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in esso presenti, si utilizzano opportune membrane con l apposito apparato di filtrazione. c) cappa a flusso laminare Serve per eseguire al suo interno manipolazioni microbiologiche per eliminare la contaminazione dei prodotti ma anche dell operatore e dell ambiente. 6

9 APPARECCHIATURA DA LABORATORIO MICROSCOPIO Strumento capace di fornire un'immagine ingrandita di un piccolo oggetto osservato attraverso di esso. Il microscopio è composto di: - una parte meccanica detta stativo - una parte ottica USO DEL MICROSCOPIO - accendere la luce - porre il vetrino sul tavolino traslatore, sistemare il preparato rivolto verso l alto e in prossimità dell apertura centrale del tavolino - avvicinare il tavolino all obiettivo più piccolo (4x) mediante la vite macrometrica - mettere a fuoco con la vite micrometrica i - regolare l intensità della luce - regolare l apertura del diaframma considerando che con l obiettivo 100x il diaframma deve avere la massima apertura - spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso - individuare un buon campo e quindi ruotare l obiettivo successivo (10x) e passare poi al 40x mantenendo sempre il fuoco -abbassare leggermente il tavolino traslatore, mettere una goccia di olio da immersionei al centro dl del vetrino, abbassare l obiettivo 100x con cautela verso la goccia e mettere a fuoco - descrivere quanto osservato PRECAUZIONI D USO DEL MICROSCOPIO - non lasciare i vetrini sul tavolino traslatore - togliere l olio li dall obiettivo 100X dopo averlo usato utilizzando la carta imbevuta di alcool l - non far toccare gli obiettivi al preparato - non forzare alcuna manopola e non svitare gli obiettivi o gli oculari CAPPA A FLUSSO LAMINARE La cappa consente la protezione dell operatore e dell ambiente dal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare in condizioni di sterilità. Il flusso continuo di aria sterile, all interno della cabina, impedisce la fuoriuscita verso l esterno, di microbi. La sterilizzazione viene realizzata facendo passare l aria attraverso dei filtri. E opportuno accendere la cappa circa 20 prima di iniziare a lavorare per assicurare una completa sterilità all interno della stessa. 7

10 AUTOCLAVE L autoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose e colture di rifiuto. Nel processo di sterilizzazione, i viene usato il vapore ad alta pressione, di solito 121 C. I microbi si eliminano meglio con il caldo umido che con quello secco della stufa, perché il vapore denatura le loro proteine. Assicurarsi prima di tutto che ci sia acqua sufficiente che copra la serpentina di rame in modo che non scaldi a secco durante il processo. Il coperchio deve essere perfettamente chiuso prima di iniziare il ciclo di sterilizzazione, quando questo è completato, si attende che l autoclave sia raffreddata prima di aprirla. L apertura anticipata del coperchio può causare l ebollizione dei liquidi nei recipienti. PRECAUZIONI D USO DELL AUTOCLAVE Esistono due fattori critici per la riuscita del processo: - tutta l aria deve fuoriuscire dall autoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con la superficie di ciò che deve essere sterilizzato. In caso contrario la temperatura resterebbe più bassa. - i materiali non devono essere sigillati, ill tappi e coperchi devono essere appena avvitati. ti In tal modo l aria contenuta al loro interno può uscire liberamente. - il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei contenitori. TERMOSTATO Apparecchio a circolazione d aria calda, termoregolato, che permette di mantenere costante la temperatura. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 20 e 80 C. Internamente ci sono dei ripiani forati per favorire la circolazione dell aria. Le colture batteriche, dopo la semina nei terreni appositi, vengono poste ad incubare nei termostati dove la temperatura è impostata a 37 in quanto ottimale per il loro sviluppo. BAGNOMARIA Apparecchio che consente di mantenere terreni di colture a temperatura costante in bagni di acqua. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 25 e 98 C. All interno contiene di dei portaprovette, tt il coperchio è a timpano per permettere all acqua di condensazione di ricadere all interno. Il bagnomaria si usa per tenere in incubazione test sierologici a 37 C e per l agar fuso pronto per l uso per le semine in dispersione. BILANCIA TECNICA Strumento destinato alla misura dei pesi. Permette di pesare quantità fino a 2000 g circa, con sensibilità di 0.01 g. 8

11 CENTRIFUGA La centrifugazione è un metodo di separzione della fase liquida nelle sospensioni, per mezzo della forza centrifuga. La centrifuga è costituita da un rotore parte mobile e girevole, con logge fisse per la collocazione delle provette. Sul pannello frontale sono inseriti un orologio per regolare la durata della centrifugazione, una manopola per regolare la velocità, un freno automatico per abbreviare i tempi di arresto. Prima di centrifugare è necessario che le provette nel rotore siano equilibrati. Il rotore deve poi essere portato progressivamente alla velocità desiderata. CONTACOLONIE DIGITALE QUEBEC Apparecchio per l osservazione e il conteggio delle colonie cresciute in piastra attraverso l impiego di una lente di ingrandimento (x1,5), un piano d appoggio centimetrato e illuminato. Un contatore digitale registra automaticamente i dati ottenuti esercitando una lieve pressione, con una penna, sulla superficie della piastra, in corrispondenza di ogni colonia. STUFA Apparecchio a circolazione d aria calda utilizzabile sia per asciugare che per sterilizzare la vetreria. La temperatura di esercizio è compresa tra +50 e +290 C. PHMETRO Strumento che consente di misurare il valore del ph delle soluzioni acide o basiche. Si basa sulla misura della differenza di potenziale che si istaura fra due elettrodi immersi nella soluzione da saggiare. FRIGORIFERO Apparecchio che serve a incubare a basse temperature e per la conservazione di campioni iemateriale. Il fi frigoriferoif infatti permette la btt batteriostasi, t icioè l assenza di crescita o di riproduzione della coltura. Gli aerobi possono essere conservati per mesi in agar inclinato, gli anaerobi infissi in agar. La conservazione in frigo ha degli svantaggi quali la breve durata di immagazzinamento, quindi l obbligo di trapianti frequenti e la facile inquinabilità delle colture. 9

12 U.D. 1.2 UBIQUITÀ DEI MICRORGANISMI OBIETTIVO: Scoprire che i microrganismi hanno la capacità di popolare qualsiasi ambiente ed osservare i caratteri morfologici delle colonie che si sono sviluppate. PRINCIPIO: L ubiquità dei microrganismi può essere messa in evidenza contaminando con diversi ambienti (acqua, latte, polpastrelli, aria, terriccio ) piastre di Petri riempite con Nutrient agar per contatto diretto o per esposizione. Poiché il terreno Nutrient agar possiede i nutrienti capaci di far crescere un gran numero di microrganismi, i i la loro presenza in ambienti diversii sarà evidenziata i dll dallo sviluppo di colonie visibili ad occhio nudo. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Acqua di pozzo (lago o fiume), latte fresco o pastorizzato, yogurt, polpastrelli delle dita, aria di una stanza, terriccio o torba. TERRENI DI COLTURA Nutrient agar VETRERIA,... Piastre sterili monouso, contenitori sterili, spatole sterili monouso, pipette pasteur monouso, beuta, provette, bacchette vetro STRUMENTI Bilancia, autoclave, bunsen, termostato, contacolonie o lente di ingrandimento 10

13 METODICA (1 a FASE) A CURA DELL INSEGANTE 1 Preparare il terreno. 2 Distribuire in provettoni con tappo metallico (18-20 ml per provettone). 3 Sterilizzare in autoclave a 121 C per Piastrare in ambiente sterile. (2 a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI Seminare: 1 a) una piastra con 0,1ml di acqua, una con 0,1ml di latte ed una con 0,1ml di yogurt yg per spatolamento b) una piastra appoggiando delicatamente i polpastrelli sul terreno per qualche secondo c) una piastra lasciandola aperta per circa nella stanza prescelta d) una piastra con 0,1 ml di sospensione di terriccio preparata prelevando 2/3 spatolate di terriccio, sciolto in 50 ml di acqua distillata sterile - lasciare una piastra senza seminarla come prova in bianco - siglare le piastre con il proprio nome e il tipo di batteri seminati 2 Incubare le piastre capovolte a 37 C per 48 h. 11

14 (3 a FASE) A CURA DEGLI STUDENTI 1 Osservare le colonie formatesi e descriverle in relazione a: a) numero b) forma puntiforme rotonda lenticolare irregolare rizoide filamentosa c) margine intero ondulato d) profilo piatto convesso umbonato e) superficie liscia rugosa lucida opaca f) consistenza compatta sfaldabile pastosa mucosa g) colore Disegna ciò che hai osservato 12

15 2. OSSERVARE I MICRORGANISMI U.D. 2.1 COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice. PRINCIPIO: I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali detti cromofori associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con l ambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il Blu di metilene. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli e Staphilococcus epidermidis MATERIALI CHIMICI Blu di metilene, olio da immersione VETRERIA,... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen Blu di metilene 1%: aggiungere, in una bottiglia con contagocce, ad 1 g di blu di metilene 99 ml di acqua distillata. Agitare fino a completa dissoluzione. 13

16 METODICA (1 a FASE) fissazione 1 Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. 2 Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata. 3 Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dell acqua. Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto con una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco bunsen, per almeno tre volte. (2 a FASE) colorazione 1 Dopo aver appoggiato il vetrino su una vaschetta per la colorazione, aggiungere qualche goccia di blu di metilene. Attendere circa 3 minuti, quindi lavare con acqua mediante una spruzzetta. Eliminare buona parte dell acqua di lavaggio inclinando il vetrino; asciugare delicatamente, prima con carta da filtro, poi all aria. 14

17 METODICA (1 a FASE) osservazione al microscopio 1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. I più comuni tipi morfologici dei batteri cocchi streptococchi stafilococchi diplococchi bastoncelli vibrioni spirilli 15

18 U.D. 2.2 COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINA OBIETTIVO: Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica. PRINCIPIO: La Nigrosina è un colorante acido che non è in grado di penetrare all interno dei batteri e forma dunque un deposito scuro attorno alle cellule che vengono evidenziate per contrasto. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus MATERIALI CHIMICI Nigrosina, olio da immersione VETRERIA,... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen Nigrosina 2%: aggiungere, in una bottiglia con contagocce, a 2 g di nigrosina 99 ml di acqua distillata. Agitare fino a completa dissoluzione. 16

19 METODICA (1 a FASE) colorazione 1 Deporre una goccia di nigrosina su un vetrino portaoggetti. 2 Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata e miscelarla con la nigrosina. 3 Distendere uniformemente il materiale sul vetrino asciugare all aria non scaldare e non fissare alla fiamma. (2 a FASE) osservazione al microscopio 1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. 17

20 U.D. 2.3 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPORE (secondo Shaeffer e Fulton) OBIETTIVO: Osservare la presenza di endospore e spore libere. PRINCIPIO: Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il colorante anche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore del colorante di contrasto (safranina). MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Bacillus subtilis MATERIALI CHIMICI Verde malachite 5%, safranina, olio da immersione TERRENI DI COLTURA Agar al manganese VETRERIA,... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno, piastre sterili, beuta, provette STRUMENTI Microscopio, autoclave, termostato, bilancia, bunsen Agar al manganese: - Nutrient broth 8 g - Agar 20 g - MnCl 2 1% 0,5 ml - Acqua 1000 ml Unire al brodo l agar e scaldare, aggiungere poi 0,5 ml di MnCl 2 1% in acqua. Preparazione soluzione di safranina: 1 g di safranina sciolta in 10 cc di alcool, aggiungere acqua fino a 100 cc. 18

21 METODICA (1 a FASE) a cura dell insegnante 1 Preparare delle provette con ml di agar al manganese. 2 Sterilizzare in autoclave a 121 C per Piastrare in ambiente sterile e lasciar solidificare. 4 Seminare per striscio i un ansata della coltura in esame. 5 Incubare a 35 per h. 19

22 METODICA (2 a FASE) a cura dello studente 1 Allestire e fissare un vetrino con una delle colonie ottenute nella 1 a FASE. 2 Appoggiare il vetrino ti su un sostegno sopra una vaschetta contenente acqua la quale verrà portata all ebollizione. Colorare abbondantemente con verde malachite, lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa per 3-5 e aggiungere ancora il colorante facendo attenzione che il vetrino non rimanga a secco. (per evitare che il vetrino cada nella vaschetta trattenerlo con una pinza di legno) 3 Lavare con acqua e colorare con safranina per 5. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente. (2 a FASE) osservazione al microscopio 1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. 20

23 U.D. 2.4 COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA OBIETTIVO: Osservare la presenza di batteri capsulati utilizzando una colorazione che, non richiedendo fissazione, permette una visione senza artefatti della morfologia batterica. PRINCIPIO: La capsula dei batteri non ha alcuna affinità per i coloranti perciò per metterla in evidenza si fa ricorso a colorazioni negative. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Sospensione batterica (inoculo di terra) MATERIALI CHIMICI Inchiostro di china al 10% VETRERIA,... Vti Vetrinii portaoggetto, tt vetrini ti icoprioggetto, ansa, vaschetta htt per colorazione, spruzzetta, pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen 21

24 METODICA (1 a FASE) 1 Deporre una goccia di inchiostro di china diluito al 10% su un vetrino portaoggetti. 2 Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. 3 Sospendere il materiale sull inchiostro di china e coprire con un vetrino coprioggetto. (2 a FASE) osservazione al microscopio 1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. 22

25 U.D. 2.5 COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM OBIETTIVO: Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram + eigram -. PRINCIPIO: La diversa colorazione che assumono i batteri con questa tecnica dipended dalle differenze esistenti nella loro parete cellulare. La parete dei Gram + è costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che non permette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante basico cristal violetto) da parte del decolorante. I Gram + rimangono dunque colorati in violetto. I Gram - hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risulta permeabile all agente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante di contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus e Escherichia Coli MATERIALI CHIMICI Cristal violetto, liquido di Lugol, safranina, decolorante alcool-acetone, olio da immersione VETRERIA,... Vetrini portaoggetto, ansa, vaschetta per colorazione, spruzzetta, pinza di legno STRUMENTI Microscopio, bunsen Le soluzioni coloranti vengono preparate come soluzioni idroalcooliche che si allestiscono sciogliendo nell alcool l l il colorante: Sostanza colorante in polvere g 10 Alcool etilico assoluto ml 100 Si lascia a contatto per qualche giorno ottenendo una soluzione satura. Queste soluzioni necessarie a mantenere a lungo i coloranti, non sono adatte ad essere usate direttamente nelle colorazioni. Pertanto, con una diluizione in acqua, si ottengono soluzioni idroalcooliche: Soluzione alcoolica madre del colorante ml 10 Acqua distillata ml 90 23

26 METODICA (1 a FASE) fissazione e colorazione 1 Prelevare con un ansa sterile un po di materiale batterico da una colonia isolata. 2 Distendere il materiale su un vetrino dove era stata precedentemente messa una goccia di acqua distillata. Essiccamento: lasciare asciugare a temperatura ambiente fino a completa evaporazione dell acqua. Fissazione: passare velocemente il vetrino, tenuto 3 con una pinza, sulla zona più calda della fiamma del becco bunsen, per almeno tre volte. 4 con acqua (2 a FASE) osservazione al microscopio a) colorare il preparato depositando, mediante una pipetta qualche goccia del 1 colorante (cristal violetto), lasciare agire per 1 b) lavare con acqua distillata e poi coprire con il liquido di Lugol e lasciare agire per 1, lavare ancora con acqua c) decolorare con soluzione alcool-acetone e sciacquare immediatamente d) colorare con la soluzione di contrasto (safranina) per 1, sciacquare accuratamente e asciugare il vetrino. Dopo aver lavato abbondantemente con acqua asciugare delicatamente 1 Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo, procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a piccolo ingrandimento, fino all obiettivo ad immersione e registrare i risultati ottenuti anche mediante un disegno. 24

27 3. LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI U.D. 3.1 ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE TECNICHE DI SEMINA OBIETTIVO: Acquisire la corretta manualità nelle varie tecniche di semina e la consapevolezza degli scopi per i quali la semina viene effettuata. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche TERRENI DI COLTURA Terreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina) VETRERIA,... Piastre Petri sterili, pipette graduate sterili, provettoni, provette, tamponi faringei sterili, spatole sterili, anse, aghi, cilindri STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, bunsen UTILIZZO DEI TERRENI DI COLTURA DISIDRATATI Solubilizzazione: pesare il terreno e porlo in una beuta e aggiungere la metà del volume di acqua distillata richiesta. Agitare per solubilizzare poi aggiungere l acqua rimanente lavando le pareti della beuta. Utilizzare sempre beute di volume almeno 2 volte e mezzo quello della sospensione. Riscaldare per ottenere una completa solubilizzazione agitando continuamente fino ad arrivare all ebollizione. La completa solubilizzazione dopo alcuni minuti di ebollizione, è indicata dalla trasparenza della soluzione. 25

28 SEMINA IN TERRENO SOLIDO 1 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (a) Operare in ambiente sterile, passare l ansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po di patina batterica da una piastra o da una provetta. Trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando l ansa con movimenti ampi a zig-zag senza incidere il terreno, non tornare sui punti già seminati. Sterilizzare l ansa dopo l uso. La crescita si manifesta con formazione di colonie confluenti e isolate presenti sulla superficie dell agar. 2 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (b) Sempre operando in ambiente sterile, passare l ansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po di patina batterica. Trasferire il materiale su una piastra sterile 3 strisciando l ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il 2 terreno solo su metà piastra (1). Sterilizzare e raffreddare l ansa, ruotare la piastra e riprendendo dal punto interrotto, 1 strisciare l altra metà della piastra (2); ripetere l operazione un altra volta in modo da ottenere tre strisci in tre diverse direzioni (3). La crescita si manifesta con formazione di colonie confluenti nella prima metà e isolate nella seconda metà dll della piastra, presenti sulla superficie i dell agar. 26

29 SEMINA IN TERRENO SOLIDO 1 Tecnica di trasferimento per striscio su piastra (c) Nel caso in cui si voglia ottenere una crescita compatta, si può effettuare lo striscio con tamponi sterili che vengono passati più volte e in più direzioni sul terreno. Immergere un tampone in un brodo e trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando più volte sulla superficie. Ruotare la piastra e strisciare ancora; sterilizzare il tampone dopo l uso. La crescita si manifesta con formazione di una patina più o meno omogenea. 2 Tecnica dello spatolamento in piastra (d) Operando sotto una cappa sterile o accanto alla fiamma del bunsen, prelevare con una pipetta sterile 0,1 ml di brodocoltura e trasferirlo al centro di una piastra con agar nutrient. Con una spatola sterile distribuire l inoculo sulla superficie dell agar in tutte le direzioni. Rovesciare la piastra ed incubarla a per 24-48h. Deporre la spatola nell apposito sacchetto per la sterilizzazione. La crescita si manifesta con lo sviluppo di una patina presente sulla superficie dell agar. 27

30 SEMINA IN TERRENO SOLIDO 1 Tecnica della inclusione o diffusione in piastra (e) Nell inclusione usiamo pipette sterili graduate per trasferire volumi precisi di inoculi nelle piastre. Successivamente si riempie la piastra con terreno di coltura sterile mantenuto fuso a b.m. a 45 C. Se la sospensione da seminare è concentrata, si procede ad una diluizione come nella sezione 4.1. La crescita si manifesta con lo sviluppo di colonie isolate presenti sulla superficie dell agar ma soprattutto in profondità. 2 Diluizione i i ed inclusione i (f) Diluire la brodocoltura quando è particolarmente concentrata procedendo ad una diluizione come nella sezione 4.1. Predisporre 4 piastre nelle quali verserete 1 ml di ogni diluizione preparata mettendo nella prima piastra l inoculo concentrato (conc ). Versare il terreno sterile, mantenuto fuso a b.m., nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con un movimento rotatorio, lasciar solidificare. Le colonie crescono sia in superficie che in profondità e se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno in progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e più piccole dove il numero è maggiore. Contaminazione Bassa (+) Media (++) Alta (+++) Altissima (++++) 28

31 SEMINA IN TERRENO SOLIDO 1 Tecnica di isolamento e striscio su slant Operare in ambiente sterile, passare l ansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po di patina batterica da una piastra. Aprire e flambare la provetta, trasferire il materiale strisciando l ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della provetta. Sterilizzare l ansa dopo l uso. La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o patina di consistenza cremosa o secca. 2 Tecnica di trasferimento per striscio da slant a slant (o becco di clarino ) Sempre operando in ambiente sterile, passare l ansa alla fiamma e raffreddarla. Impugnare le due provette con una mano, togliere i tappi e flambare l imboccatura alla fiamma. Prelevare un po di patina batterica dalla prima provetta, trasferire il materiale strisciando l ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della seconda provetta. Flambare e tappare le due provette. Sterilizzare l ansa dopo l uso. Anche qui la crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o patina di consistenza cremosa o secca. 3 Tecnica per infissione in agar o gelatina Si utilizza questa semina con un ago per inoculare terreni solidificati in provetta. L ago consente di inserire le cellule lungo una linea verticale e in profondità, per permettere lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorire l osservazione di forme mobili che si diffondono a partire dalla linea dell inoculo. l 29

32 SEMINA IN TERRENO LIQUIDO 1 Tecnica di trasferimento da slant a brodo Disporre le provette con il ceppo di Escherichia Coli e il brodo sterile da seminare vicino alla fiamma. Sterilizzare e raffreddare l ansa, togliere i tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con l ansa un po di patina batterica dallo slant, inserire l ansa con l inoculo nel brodo sterile e stemperare. Flambare e tappare le provette. Sterilizzare l ansa dopo l uso. 2 Tecnica di trasferimento mediante pipetta Disporre le provette con l inoculo in brodo e il brodo sterile da seminare vicino alla fiamma, togliere i tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di inoculo dalla prima provetta e trasferirla nella seconda. Flambare e tappare le provette. Deporre la pipetta nell apposito sacchetto per la sterilizzazione. La crescita in brodo si evidenzia a occhio nudo attraverso: - intorbidamento del terreno; - formazione di un sedimento sul fondo della provetta che agitato sale verso l alto; - formazione di fiocchi o granuli in sospensione. 3 Incubare i terreni seminati insieme ad alcuni non seminari, come controllo, a 37 per 24-48h 30

33 U.D. 3.2 I BATTERI DELLO YOGURT OBIETTIVO: Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurt PRINCIPIO: Nello yogurt sono generalmente presenti due gruppi batterici: il Lactobacillus bulgaricus elo Streptococcus thermophilus, che trasformano il lattosio presente nel latte in acido lattico. Lo striscio, in MRS agar, permette l isolamento dei lattobacilli, mentre l M17 favorisce la crescita degli streptococchi lattici e inibisce quella del Lactobacillus bulgaricus. Pur essendo improbabile, per l acidità dello yogurt e per le norme igieniche di produzione e conservazione, la presenza di microrganismi contaminananti, è tuttavia possibile verificare l eventuale presenza di batteri coliformi Gram - seminando in Levine EMB Blue agar che consente di differenziare le colonie di E. coli in base alla presenza di riflessi verdi metallici e alla colorazione violacea con centro nero. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Yogurt MATERIALI CHIMICI Sol. di Ringer, reattivi per anaerobiosi, cartina indicatrice TERRENI DI COLTURA MRS agar, M17 agar, EMB blue agar VETRERIA,... Beute, cilindri, bacchette, provette, beuta da 100 ml, piastre sterili, ansa STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, bunsen Soluzione di Ringer Sodio cloruro 9 g, Potassio cloruro 0,42 g, Calcio cloruro anidro 0,24 g, Sodio bicarbonato 0,2 g, acqua distillata 1 litro. Viene impiegata nella diluizione di 1:4 con acqua distillata. In alternativa soluzione di Ringer in tavolette Sciogliere 1 tavoletta in 500 ml di acqua distillata sterile. 31

34 METODICA 1 Preparere i terreni e la sol. di Ringer, sterilizzare dopo aver controllato il ph dei terreni (ph 6,2) con la cartina indicatrice. 2 Piastrare i tre diversi terreni e raffreddare. 3 Prelevare 10 g di yogurt sterilmente, diluirlo in 100 ml di Ringer sterile omogenizzando bene. 4 Per striscio seminare 3 piastre dei terreni diversi. Poiché i lattobacilli crescono bene in anaerobiosi, aggiungere sopra lo striscio un altro strato di MRS e solidificare. In alternativa usare la giara come all unità Mettere in termostato a 37 per 2 o 3 giorni. Controllare la crescita e la presenza di colonie isolate, confermare il tipo di microrganismo per mezzo della colorazione di gram. 32 Coltura mista di Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus dello yogurt al microscopio elettronico

35 U.D. 3.3 EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI OBIETTIVO: Verificare l adattamento di alcune specie microbiche a condizioni differenti di ossigenazione e di ph del mezzo di crescita. PRINCIPIO: Ogni specie microbica presenta esigenze nutrizionali e colturali diverse. Variando in modo controllato alcuni fattori ambientali si può valutare la risposta di ciascuna specie microbica in esame attraverso l osservazione della crescita in coltura. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Brodocolture di Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae MATERIALI CHIMICI Reattivi per anaerobiosi (catalizzatori, indicatori), cartina indicatrice (test a) Soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) (test b) TERRENI DI COLTURA Glucose agar (test a) TSB (test b) VETRERIA,... Beute, cilindri, bacchette, provette, beker 100 ml, piastre sterili con setto, ansa, piastre sterili, pipette sterili da 1 ml STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, giara per anaerobiosi, phmetro, bunsen 33

36 METODICA test a) Influenza dell ossigeno atmosferico sulla crescita Ricerca di aerobi, anaerobi e anaerobi facoltativi ti i (1 a FASE 1 parte) 1 Sciogliere il terreno per una prova in doppio, più il controllo. 2 Distribuire in provette, controllare il ph con la cartina indicatrice e autoclavare. 3 Piastrare e raffreddare il terreno. (1 a FASE 2 parte) 1 Seminare in ciascuna metà della piastra, in maniera sterile, mediante striscio, l inoculo dei due ceppi batterici. Una piastra va messa in termostato e l altra in giara. 34

37 Giara: sistemare le piastre capovolte nella giara, inserire l indicatore per anaerobiosi e il reattivo per eliminare l ossigeno (il reattivo va attivato aggiungendo 10 ml di acqua nella bustina operando lontano dalla fiamma per la presenza di idrogeno altamente infiammabile); la reazione viene portata tt a termine in circa 60, dopodiché controllare la pressione nel manometro (1 atm. circa). Dopo 2-3 ore controllare se l indicatore per l anaerobiosi è virato al rosso. Riporre la giara e la seconda serie di piastre in termostato a 37 per 48 h. Dopo incubazione aprire la giara sotto cappa, controllare la crescita nelle piastre e registrare i risultati secondo la seguente scala: - = assenza di crescita + = crescita scarsa ++ = crescita normale +++ = crescita abbondante NB: il catalizzatore è situato nell apposita sede posta sotto il coperchio della giara; tra un impiego e l altro va asciugato riscaldandolo in stufa a 160 per

38 METODICA test b) Influenza del ph del mezzo sulla crescita Si verifica l influenza del ph sulla crescita coltivando i batteri in terreni in cui viene variato il ph per aggiunta di acidi o di basi. (1 a FASE 1 parte) 1 Sciogliere il terreno, distribuirlo in 4 beute. 2 Preparare le soluzioni di HCl 1 M (100 ml), HCl 0,1 M (100 ml), NaOH 1 M (100 ml) e NaOH 0,1 M (100 ml) e correggere il ph in ognuna delle beute con i valori 3,0-4,5-7,0-9,0 controllandole con il phmetro. METODICA PHMETRO Accendere il phmetro almeno 10 prima dell uso ed effettuare la calibrazione. Selezionare il tasto ph e automatico, inserire l elettrodo nel campione a ph 7. Pigiare il tasto cal e attendere che lo strumento si stabilizzi. Lavare e asciugare l elettrodo e ripetere l operazione con il campione a ph 4 o 10. Effettuare la lettura dei vari campioni pigiando il tasto read o = lavando accuratamente l elettrodo tra una lettura e l altra. 3 Distribuire 10 ml in ogni provetta in modo da ottenere 4 provette per ogni prova. Sterilizzare a 121 per 15 e ricontrollare infine il ph. (1 a FASE 2 parte) 4 Seminare 1 ml delle due brodocolture in ogni provetta, incubare sia i tubi seminati che quelli non seminati a 36 per h. Controllare la crescita nei tubi e registrare i risultati secondo la seguente scala: - = assenza di crescita + = crescita scarsa ++ = crescita normale +++ = crescita abbondante 36

39 4. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI U.D. 4.1 CONTA MICROBICA IN PIASTRA OBIETTIVO: Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. PRINCIPIO: Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione e incubata, si riproduce formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si può risalire al numero di microrganismi presenti in un volume noto del campione. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture batteriche TERRENI DI COLTURA Nti Nutrient tagar VETRERIA,... Beute, cilindri, bacchette, provette, piastre sterili, ansa, pipette sterili da 1 ml STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, bunsen 37

40 METODICA Conta dei batteri mediante semina per inclusione in piastra (previa diluizione in serie) 1 Preparare il terreno agar nutrient e sterilizzarlo. 2 Partendo dalla sospensione in esame, preparare diluizioni scalari 1:10, 1:100, 1:1000 come segue: prelevare, con una pipetta sterile, 1 ml del campione in esame e porlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologicai i sterile. Ripetere l operazione per le successive diluizioni cambiando opportunamente la pipetta ogni volta. 3 Numerare 4 piastre 10 campione non diluito 10-1 ftt fattore didilii diluizione 1: fattore di diluizione 1: fattore di diluizione 1:1000 quindi seminarci 0,1 ml di ogni diluizione. 4 Versare il terreno sterile mantenuto fuso a b.m. nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con un movimento rotatorio, lasciar solidificare. 5 Incubare a 37 per 48h poi contare al contacolonie, le colonie ben isolate quando sono comprese tra 100 e 300. Le colonie crescono sia in superficie che in profondità e se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno in progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e più piccole dove il numero è maggiore. 38

41 Predisporre una tabella per i risultati n. colonie n. colonie n. colonie n. colonie Campione 1 Campione 2 Campione 3 Dalla conta si risale al numero di batteri/ml nelle sospensione in esame mediante la seguente formula: N= n*1/d*1/v N= numero di germi/ml del campione puro n= numero di colonie nella piastra 1/d= reciproco della diluizione dell inoculo in quella piastra 1/V= reciproco della frazione di volume considerato (1ml) utilizzato per l inoculo1/10 di ml 39

42 U.D. 4.2 CONTA SU TERRENO LIQUIDO OBIETTIVO: Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica classica) PRINCIPIO: La crescita in terreni liquidi viene rivelata dall intorbidamento del terreno e/o sviluppo di gas. Il numero dei batteri presenti nel campione viene calcolato mediante una stima su base probabilistica basata sulla determinazione dell indice MPN (Most probable number) che rappresenta il numero più probabile di microrganismi presenti in un volume noto di campione di acqua. MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture batteriche TERRENI DI COLTURA Brodo lattosato VETRERIA,... Beuta, cilindri, bacchette, provettoni, pipette sterili da 10, 1, 0,1 ml STRUMENTI Bilancia, autoclave, termostato, bunsen 40

43 METODICA Conta dei batteri su terreno liquido (es: ricerca dei batteri coliformi) 1 Preparare e sterilizzare 3 serie di 3 provettoni con 10 ml di terreno ml di Brodo lattosato concentrazione doppia con campanella di durham Seminare. 10 ml di Brodo lattosato concentrazione normale con campanella di durham 10 ml di Brodo lattosato concentrazione normale con campanella di durham Campione 10 ml 1 ml 0,1 ml 3 Incubare a 37 per ore. Prova negativa RISULTATI Prova positiva Assenza di gas nella campanella Presenza di gas nella campanella Per il calcolo dell MPN si rileva il numero di prove positive per ogni serie di provette seminate (3 per serie) e, sulla base della sequenza ottenuta, si risale al numero più probabile tramite apposita tabella (vedi tabella su U.D. 4.4) 41

44 U.D. 4.3 CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANA OBIETTIVO: Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un determinato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. (Tecnica delle membrane filtranti) PRINCIPIO: Filtrando volumi determinati di liquidi attraverso membrane sterili, con una porosità inferiore a 1 μm, e ponendo tali filtri sulla superficie di terreni agarizzati in piastra, dopo incubazione, si otterranno colonie isolate che possono venire contate. MATERIALI E STRUMENTI: TERRENI DI COLTURA PCA, ENDO broth MF, Faecal coliform broth, Azide maltose agar VETRERIA,... Pipette sterili da 1-10ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre sterili, filtri sterili con membrana da 0,2 μm STRUMENTI Apparato per la filtrazione, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, cappa sterile, pompa da vuoto, bunsen 42

45 METODICA Procedimento A (Conta batterica totale) (1 a FASE) 1 Sterilizzare dentro una busta per autoclave l apparato di filtrazione (composto dall imbuto, il porta filtro, la beuta codata), pinze di metallo, un cilindro da 100 ml, 5 matracci da 100 ml, pipette graduate da 10 ml. 2 Sterilizzare e piastrare 6 piastre con il terreno PCA. Sterilizzare una beuta contenente 500 ml di acqua distillata per le diluizioni del campione. 3 Sotto la cappa sterile preparare le diluizioni del campione di acqua. (2 campioni 1:10) Prelevare 10 ml di campione e metterlo in tre matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile. Un matraccio servirà per la diluizione successiva. (2 campioni 1:100) Prelevare 10 ml di campione dal matraccio 1:10 e metterlo in due matracci da 100 ml, portare a volume con acqua sterile. 4 Montare l apparato di filtrazione inserendo tra l imbuto e il porta filtro l apposito filtro sterile, collegarlo ad una pompa da vuoto e filtrare i campioni di acqua partendo da quelli più diluiti. Dopo la prima filtrazione si toglie il filtro e lo si depone sulla superficie della piastra di PCA. Si procede così per tutti e sei i campioni (campioni ). 5 Mettere le piastre capovolte in termostato per 24h; una piastra a 22 e l altra a 37 per ogni diluizione. 43

46 METODICA Procedimento B (Individuazione coliformi totali) 1 Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Endo broth agarizzato. Incubare a 36 per 24h. Procedimento C (Identificazione coliformi fecali) 1 Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Faecal coliform broth agarizzato. Incubare a 44 per 24h. Procedimento D (Individuazione Streptococchi fecali) 1 Filtrare 100 ml di campione e seminarlo in piastre con Azide maltose agar. Incubare a 36 per 48h. Valutazione: a) Per la conta batterica totale si prendono in considerazione tutte le colonie presenti sulla membrana dopo incubazione. Riportare il valore alle diluizioni eseguite. (valori guida: 10 colonie a 36 C, 100 colonie a 22 C/1 ml) b) Per i coliformi totali contare le colonie rosse e tutte le colonie che presentano riflesso metallico (fucsina); queste ultime possono essere presumibilmente classificate come colonie di Escherichia coli. Altre colonie eventualmente presenti non vanno conteggiate. Riportare il valore a 100 ml di campione. c) Per i coliformi fecali contare le colonie in grigio, grigio-blu e blu. Altri tipi di colonie eventualmente presenti non si contano. Riportare il valore a 100 ml di campione. d) Per gli streptococchi fecali contare solo le colonie rosso, rosso-scuro, puntiformi (diametro max 1 mm) con contorni netti e cupoliformi. Ogni altro tipo di colonia non deve essere conteggiato. Riportare il valore a 100 ml di campione. 44

47 METODICA Risultati: 22 C 36 C 44 C Carica batterica totale 10 0./ml./ml 10-2./ml./ml 10-1./ml./ml Coliformi i totali t./100ml Coliformi fecali Streptococchi fecali./100ml./100ml 45

48 U.D. 4.4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL ACQUA POTABILE OBIETTIVO: Valutare se il campione in esame corrisponde ai requisiti di potabilità dal punto di vista microbiologico. PRINCIPIO: Ricerca e quantificazione delle varie specie che rappresentano indicatori batterici di inquinamento e più precisamente: carica microbica totale coliformi i totalit e fecali streptococchi fecali MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI CHIMICI Cartine indicatrici TERRENI DI COLTURA PCA, Lactose broth, Brillant green bile broth, Azide dextrose broth, Ethyl violet azide broth VETRERIA,... Pipette sterili da ,1 ml, provette, provettoni, beute, campanelle di Durham, piastre sterili STRUMENTI Centrifuga, bagnomaria, autoclave, contacolonie, bilancia, termostato, bunsen PRELIEVO DEI CAMPIONI Il prelievo viene effettuato con bottiglie sterili in vetro o in plastica con tappo a vite, chiusi da fogli di carta di alluminio. Il prelievo sarà effettuato dopo aver fatto defluire l acqua per alcuni minuti. I campioni vanno sottoposti all esame quanto prima, in ogni caso l intervallo di tempo fra il prelievo e l analisi non dovrà superare le 24h. 46

49 ANALISI MICROBIOLOGICA ACQUA POTABILE CARICA MICROBICA TOTALE Semina in PCA per inclusione con eventuali diluizioni scalari Incubare a 36 C per 48h Incubare a 22 C per 72h Osservare e contare le colonie, ricavare il valore medio delle piastre alla stessa diluizione Osservare e contare le colonie, ricavare il valore medio delle piastre alla stessa diluizione COLIFORMI TOTALI E FECALI STREPTOCOCCHI Test presuntivo in Lactose broth Test presuntivo in Azide dextrose broth Incubare a 36 C per 24/48h Incubare a 37 C per 48h Test negativo no Produzione di gas? SCHEMA DI LAVORO Intorbidamento del brodo? no Test negativo si si Test positivo Test positivo Inoculo in Brillant green Bile broth Inoculo in EVA broth Incubare a 36 C per 24/48h Incubare a 44 C per 24h Incubare a 37 C per 48h Test negativo no Produzione di gas? Produzione di gas? no Test negativo Intorbidamento e precipitato color porpora? no Test negativo si si si Test positivo Test positivo Test positivo Conta con metodo MPN dei coliformi totali Conta con metodo MPN dei coliformi fecali Conta con metodo MPN degli streptococchi 47

50 METODICA (1 a FASE) a) CARICA MICROBICA TOTALE a 36 e 22 1 Trasferire con pipette sterili, 1 ml del campione di acqua in 4 piastre, se il campione è molto contaminato procedere a diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000) con acqua dist. sterile (vedi modulo 4.1/4.2). 2 Piastrare con PCA mantenuto fuso in b.m. ruotare delicatamente le piastre per omogenizzare il campione nel terreno. 3 Incubare 2 piastre a 36 per 48h e le altre 2 a 22 per 72h. Osservare le colonie cresciute con il contacolonie, ricavare il valore medio su ogni coppia di piastre, esprimere il risultato come colonie su agar/ml a 36 e 22 C. 48