Dal DNA alle proteine: l espressione genica

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1 Dal DNA alle proteine: l espressione genica La terapia genica costituisce una frontiera per la medicina moderna. Grazie a questa tecnica in futuro si potranno curare più efficacemente molte malattie. Per terapia genica si intende il trasferimento di materiale genetico allo scopo di prevenire o curare una malattia. Nel caso di malattie genetiche consiste essenzialmente nel trasferire la versione funzionante del gene in modo da rimediare al difetto. Può essere applicata a cellule somatiche, nel qual caso il difetto viene curato esclusivamente nel paziente soggetto alla terapia, e a cellule germinali, rendendo possibile la trasmissione alle generazioni successive. Per comprendere come si è arrivati a sviluppare tecniche di terapia genica serve sapere cosa è un gene e come viene espresso.

2 Espressione genica: serie di eventi con cui l informazione contenuta nel DNA è decodificata e utilizzata per la sintesi delle proteine cellulari - Trascrizione: sintesi di molecole di RNA complementari al DNA - Traduzione: l RNA è utilizzato come stampo per la sintesi delle proteine Le proteine influiscono sul fenotipo in diversi modi

3 Il DNA è trascritto in diversi tipi di RNA (mrna, trna, rrna) (ruolo nella sintesi proteica) Struttura dell RNA

4 Con la trascrizione viene sintetizzato un mrna, copia complementare di un filamento stampo di DNA. L mrna porta l informazione sottoforma di gruppi di 3 basi (codoni) I codoni sono specifici per gli aminoacidi e vengono tradotti in una sequenza lineare di aminoacidi catena polipeptidica La traduzione richiede anche trna e ribosomi (rrna) Nelle cellule eucariotiche la trascrizione avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma

5 La traduzione dell RNA porta alla sintesi di un polipeptide grazie al codice genetico L informazione trascritta nell mrna è utilizzata per specificare una sequenza di aminoacidi Sequenza di 3 basi sul mrna (codone) specifica per 1 aminoacido Codice a triplette Codice genetico: l insieme dei codoni che specificano per tutti gli aminoacidi, i segnali di inizio e di terminazione

6 Il riconoscimento del codone è possibile grazie ai trna Ciascun trna ha una sequenza specifica di 3 basi (anticodone) complementare ai codoni Ciascun trna si lega a un aminoacido specifico

7 I ribosomi intervengono nella traduzione - accoppiando gli anticodoni dei trna e i codoni degli mrna - Unendo gli aminoacidi portati dai trna nell ordine specificato dagli mrna Il codice genetico viene letto come sequenza di triplette partendo da un punto di inizio ben preciso, che determina la sequenza di lettura (reading frame) del messaggio genetico

8 La trascrizione Formazione di una sequenza specifica di RNA da una sequenza specifica di DNA Richiede: Uno dei due filamenti di DNA come stampo I 4 ribonucleosidi trifosfato (ATP, GTP, CTP, UTP) L enzima RNA polimerasi Sali e tamponi appropriati per l attività dell enzima Oltre a mrna, la traduzione è responsabile della sintesi di trna, rrna e altri tipi di piccoli RNA

9 RNA polimerasi - Avanza lungo il DNA svolgendo l elica del DNA quel tanto che basta per esporre una regione del filamento stampo -catalizza aggiunta di 1 nucleotide in direzione 5-3 facendo legami fosfodiesterici e utilizzando energia di legame dei nucleosidi trifosfati -Riconosce e si lega a una sequenza (promotore) e vi si lega per iniziare trascrizione - A differenza della DNA polimerasi, non necessita di un primer Nei procarioti 1 RNA polimerasi Negli eucarioti 3 RNA polimerasi

10 Il filamento di DNA trascritto e il filamento di RNA complementare sono antiparalleli RNA è sintetizzato in direzione 5-3 DNA è letto in direzione 3-5 Terminologia: «A monte» (upstream) verso l estremità 5 della sequenza di mrna o la 3 del filamento stampo di DNA «A valle» (downstream) verso l estremità 3 della sequenza di mrna o la 5 del filamento stampo di DNA A monte A valle

11 Un solo filamento di DNA è trascritto per un dato gene, ma il filamento opposto può essere trascritto per un altro gene Molte copie dello stesso gene possono essere sintetizzate in tempi molto brevi (un gene di 1500 bp trascritto in 50 sec) Possono essere trascritti più geni contemporaneamente

12 Promotore contiene informazioni che determinano quale dei due filamenti di DNA deve essere trascritto e il sito da cui iniziare la trascrizione e la direzione da prendere Esiste almeno un promotore per ogni gene. L RNA polimerasi ha elevata affinità per i promotori L RNA polimerasi riconosce il promotore anche se il DNA si trova nella conformazione a doppia elica Un pezzo di DNA può essere trascritto solo se a valle di un promotore

13 La trascrizione si può suddividere in tre fasi Negli eucarioti ogni gene ha un promotore. Durante l inizio della trascrizione, alcune proteine che possono legare specifiche sequenze di DNA e l RNA polimerasi, direzionano la RNA polimerasi verso uno specifico promotore, determinando quindi l espressione di specifici geni (fattori sigma e fattori di trascrizione) Le RNA polimerasi non sono in grado di correggere errori di trascrizione. Siccome vengono prodotti molti RNA, che hanno vita breve, gli errori sono meno dannosi delle mutazioni

14 Differenza tra gene batterico e gene eucariotico

15 Nei batteri trascrizione e traduzione sono accoppiate La vita media degli mrna è molto bassa (pochi minuti) e più ribosomi possono attaccarsi al mrna nella traduzione Negli eucarioti l mrna sintetizzato nel nucleo deve «maturare» e essere trasportato nel citoplasma per la traduzione

16 I geni eucariotici sono interrotti da sequenze non codificanti I trascritti vengono processati prima della traduzione (maturazione e modificazione post-trascrizionale) (nel nucleo) - Il trascritto originale RNA precursore (o pre-mrna) - Aggiunta in 5 di un cappuccio di 7-metilguanosina (5 cap) (appena iniziata trascrizione) - Aggiunta di coda di poli-a in 3 (poliadenilazione) -Splicing: rimozione degli introni (sequenze non codificanti all interno del gene) e unione degli esoni (sequenza codificanti) -mrna maturo esce dal nucleo, nel citosol

17 Il meccanismo dello splicing Lo splicing avviene ad opera di complessi di ribonucleoproteine (snrnp), che formano una grossa particella (spliceosoma) Riconoscono sequenza consenso nel pre-mrna al confine I-E; tagliano e ricuciono

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19 Le cellule eucariotiche contengono vari tipi di RNA con un ruolo importante nell espressione genica Con le ricerche sul genoma umano, si è capito che solo il 2% ca dell intero genoma codifica per polipeptidi, nonostante ca l 80% possa produrre prodotti di espressione. Sono quindi molto numerosi i geni che codificano per vari altri tipi di molecole di RNA

20 nuova definizione di gene Un gene è una sequenza di nucleotidi che porta l informazione necessaria per produrre uno specifico RNA o un polipeptide

21 La traduzione e le modificazioni post-traduzionali

22 I virus I virus sono la frontiera della vita Sono agenti infettivi molto piccoli ( nm) costituti da un core di acido nucleico e da un rivestimento proteico (capside) Un virus può contenere DNA o RNA (a singolo o doppio filamento) virus a DNA e virus a RNA Non posseggono le tipiche strutture cellulari Sono parassiti intracellulari obbligati anche i virus si evolvono e molto velocemente! Sono responsabili di molte malattie. Es. influenza, vaiolo, rosolia, poliomielite, morbilli, herpes, rabbia, AIDS (Sindrome da immunodeficienza acquisita)

23 La forma dei virus è determinata dall organizzazione dei capsomeri (subunità proteiche dei capsidi) In genere la forma è elicoidale o poliedrica I batteriofagi (o fagi) hanno una testa poliedrica e una coda elicoidale

24 I virus Sono acellulari Non svolgono attività metaboliche Non sintetizzano proteine Si riproducono utilizzando il meccanismo replicativo delle cellule infettate Fagi che infettano un batterio di E. coli Due tipologie di riproduzione virale: ciclo litico e ciclo lisogenico

25 I virus infettano una cellula e prendono il controllo del suo apparato di trascrizione e traduzione per moltiplicarsi. In un ciclo litico, la cellula ospite muore I virus caratterizzati da ciclo litico sono detti virulenti e causano malattie e spesso la morte

26 Nel ciclo lisogenico i fagi temperati integrano il loro acido nucleico nel genoma della cellula ospite, senza distruggerla. Cellule batteriche contenenti alcuni virus temperati possono manifestare nuove proprietà (conversione lisogenica). Es. Clostridium botulinum è dannoso e provoca gravi intossicazioni alimentari solo quando contiene DNA di uno spedicifo profago, responsabile della produzione della tossina botulinica

27 I retrovirus sono virus a RNA che utilizzano uno speciale enzima trascrittasi inversa per convertire il proprio genoma da RNA a DNA durante il loro ciclo di replicazione Trascrittasi inversa (retrovirus)

28 L AIDS è causata dal virus HIV (Human Immunodeficency virus), che distrugge il sistema immunitario L AIDS, o sindrome da immunodeficienza acquisita, è una malattia virale che distrugge i linfociti T helper, compromettendo in definitiva la capacità del nostro sistema immunitario di combattere anche le malattie più banali. Non si muore infatti di AIDS, ma di altre malattie, definite opportuniste, che non vengono più risolte dall immunità specifica, e che quindi portano alla morte dell organismo. Fu all inizio degli anni 80 del secolo scorso che si iniziarono a registrare incidenze significative di un raro tumore che colpisce gli endoteli vascolari, noto come sarcoma di Kaposi, ma anche di polmoniti e infezioni al tratto respiratorio e digerente che portavano sempre più frequentemente alla morte. Si notò che in passato queste patologie erano per lo più ricorrenti in pazienti che erano stati immunodepressi a seguito ad esempio di trapianti, o in soggetti affetti da cancro. In quegli anni, invece, le persone che si ammalavano e morivano di queste malattie, erano sempre più frequentemente persone trasfuse o emofiliache che ricevevano sangue, omosessuali, e tossicodipendenti. Questi elementi fecero pensare che queste malattie dovessero essere provocate da un microrganismo estraneo in grado di trasmettersi attraverso rapporti sessuali o scambi di sangue. Il virus dell AIDS è un retrovirus HIV è un retrovirus, quindi un virus il cui materiale genetico è RNA. HIV è un virus molto complesso e consiste di un involucro esterno ricavata dalla membrana plasmatica infettata e da due strati proteici. Il più interno contiene, oltre all RNA, l enzima trascrittasi inversa, che consente appunto la trascrizione al contrario, ovvero di copiare l RNA in DNA. Tramite l involucro, il virus si lega alla membrana di un linfocita T helper, consentendo al virus di invadere la cellula. A questo punto, grazie alla trascrittasi inversa, il virus crea una copia di DNA che si integra con il genoma della cellula ospite. Il DNA virale così integrato nel genoma dei linfociti T helper, può rimanere silente anche per anni, ma ad un certo punto viene attivato e, utilizzando gli stessi apparati metabolici della cellula, può produrre numerosissime copie del virus che gemmano dal linfocita, uccidendolo, e, rivestiti da una porzione di membrana della stessa cellula appena lasciata, danno inizio all infezione di nuovi linfociti T helper. Questi continui cicli di invasione dei linfociti T helper, di integrazione e replicazione al loro interno, di uccisione della stessa cellula dopo aver gemmato, comporta in un tempo relativamente breve, m che può essere anche di alcuni anni, una drastica diminuzione della popolazione di linfociti T helper del nostro organismo, compromettendo appunto l intero sistema immunitario. Le prime fasi dell infezione e della malattia sono generalmente asintomatiche, ma quando la diminuzione dei linfociti T helper diventa drastica (minore di 200 cellule per mm3 di sangue), gli effetti della malattia iniziano a farsi evidenti, ed in genere corrispondono all insorgenza sempre più frequente di infezioni anche molto comuni e all incapacità dell organismo di risolverle. In questo caso si parla di AIDS conclamata.

29 Il virus HIV è molto complesso; virus HIV che gemmano da un linfocita T helper dopo averlo infettato e dopo essersi replicati. L immagine è realizzata al microscopio elettronico ed è colorata artificialmente.

30 Come si trasmette il virus Nonostante l elevata virulenza dell HIV, e le gravi conseguenze che provoca, questo virus non si trasmette molto facilmente. Il virus non sopravvive infatti all esterno dell organismo infettato e può trasmettersi quindi solo per contatto diretto con i fluidi corporei di una persona infetta. Il sangue e lo sperma (il liquido seminale contenente gli spermatozoi) sono stati riconosciuti come sicuri mezzi di trasmissione dell HIV, per cui tutti i comportamenti e le azioni che implichino contatto con il sangue o lo sperma di persone infette sono ad elevato rischio di trasmissione di AIDS. Le trasfusioni di sangue costituiscono quindi un potenziale veicolo di contagio per l AIDS. Tuttavia, a pare rarissimi casi di errori, i nostri sistemi sanitari garantiscono controlli e procedure molto rigidi che impediscono la diffusione di sangue contaminato da HIV. I casi più diffusi, invece, in cui il sangue riesce a veicolare il virus, è tra i soggetti tossicodipendenti. L utilizzo di materiali non perfettamente sterili, e che possono essere entrati in contatto con sangue di sieropositivi all HIV, costituisce un importante meccanismo di diffusione dell AIDS nei Paesi occidentali. Sono i rapporti sessuali non protetti, tuttavia, a costituire la causa più frequente di trasmissione del virus. È durante l attività sessuale, infatti, che il possibile contatto con sangue e/o sperma di un partner infetto aumentano notevolmente. Questo vale sia per i rapporti di tipo etero che omosessuale, anche se in questi ultimi la possibilità di contagio sembra ulteriormente aumentare. La psicosi da AIDS, negli anni passati, aveva portato a far credere che il virus potesse essere trasmesso anche attraverso il semplice contatto con una persona infetta, piuttosto che attraverso uno starnuto o un bacio. Niente di tutto ciò si è però rivelato veritiero. Dopo circa 30 anni di storia di questa malattia, nessuna persona si può affermare sia stata infettata attraverso queste vie. Gli unici casi di persone che si sono infettate in seguito al contatto con malati di AIDS, si sono registrati tra personale medico-infermieristico che, accidentalmente, è venuto a contatto con il sangue infetto. È sicuro invece che il virus si trasmette da madre a figlio durante la vita intrauterina del feto. Attenzione quindi alle gravidanze, perché da madre sieropositiva è pressoché sicuro che nasca un figlio sieropositivo. La presenza di HIV deve essere verificata nelle madri con le prime analisi del sangue che una donna gravida effettua durante il primo trimestre di gestazione.

31 Come si combatte la trasmissione Il contrasto alla trasmissione dell HIV, ovvero la prevenzione, è l unica arma sicura attualmente a disposizione con cui cercare di combattere l AIDS. Dovremmo aver capito, dalle righe sopra, che, per evitare il rischio di contagio, non si deve entrare in contatto con sangue e sperma infetti. Nella pratica questo si traduce con l adozione di comportamenti personali volti ad evitare questo contatto. Ogni qual volta ci sia quindi il rischio di contatto con sangue di persone non conosciute, è opportuno utilizzare dispositivi di protezione personale, come ad esempio i guanti monouso in lattice (o altri materiali) che utilizzano i medici, gli infermieri, o gli analisti di laboratorio, ma anche i soccorritori del 118. Per quanto riguarda i rapporti sessuali, che, come abbiamo visto, più di tutto contribuiscono alla diffusione della malattia, la scelta di un partner sicuro è il mezzo assolutamente più efficace per evitare l infezione. In caso di rapporti occasionali, o comunque con partner poco conosciuti, l unico mezzo sufficientemente sicuro per evitare il rischio di contagio è l utilizzo del profilattico. Nessun altro mezzo naturale, o meno, di contraccezione (per tentare di evitare il contatto con lo sperma), sia da parte dell uomo che della donna, consentono di prevenire l infezione. (i metodi contraccettivi saranno studiati nel capitolo sulla riproduzione). È utile sottolineare che un partner sicuro, non corrisponde ad una persona che non presenta i segni della malattia. Abbiamo visto che il virus dell AIDS può rimanere silente anche per anni, per cui un sieropositivo all HIV può benissimo apparire come una persona perfettamente sana. È per questo che l AIDS è una malattia subdola, soprattutto per i giovani che quindi devono prestare molta, moltissima attenzione ai loro comportamenti sessuali, utilizzando tutte le precauzioni necessarie. Non solo per tutelare la propria salute (ricordatevi che l AIDS è una malattia attualmente a prognosi infausta), ma anche quella dei partner con cui un giorno, presto o tardi, si verrà in contatto.

32 Attualità e prospettive per la cura dell AIDS Quando la prevenzione ha fallito il suo compito e una persona è stata contagiata, oggi si hanno a disposizione un certo numero di farmaci per la cura dell AIDS. Nonostante che anche le terapie più moderne non siano in grado di guarire da questa malattia, esse sono in grado di rallentarne notevolmente gli effetti, con la conseguenza di aver aumentato considerevolmente l aspettative di vita delle persone sieropositive che si sottopongono alle cure opportune. Le terapie più comuni si basano sull utilizzo di farmaci antivirali, in grado in particolare di inibire la proliferazione di un retrovirus come l HIV. L AZT è il farmaco più diffuso per la sua capacità di interferire con il lavoro della trascrittasi inversa del retrovirus, impedendo quindi al virus di inserire il proprio DNA in quello del linfocita T helper, e quindi in ultima analisi la sua replicazione. Generalmente i trattamenti per l AIDS utilizzano cocktails di farmaci che agiscono quindi su vari fronti. Delle proteasi, ad esempio, possono coadiuvare l azione di altri farmaci specifici, distruggendo il rivestimento dei virus. Questi trattamenti farmacologici risultano però spesso produrre effetti collaterali anche importanti, ed anche molto costosi, per cui sono spesso improponibili nei Paesi a basso reddito, dove normalmente le persone non hanno accesso a cure anche più banali. Per questo il lavoro dei ricercatori rivolto alla scoperta di cure per l AIDS è ancora fervente. Se da un lato si sperimentano nuovi farmaci per il trattamento e la distruzione del virus una volta all interno dell organismo, dall altro si sta cercando di trovare un vaccino per l HIV, più accessibile e meno costoso rispetto ai farmaci attuali, che un giorno possa consentire campagne di vaccinazioni diffuse in grado di debellare la malattia. Tuttavia su quest ultima strada si incontrano numerosi problemi. Primo fra tutti è il fatto che HIV presenta una frequenza elevatissima di mutazioni. Individui diversi sono portatori di ceppi diversi di HIV, ma anche in uno stesso individuo il ceppo di HIV può modificarsi con il tempo. Un giorno, probabilmente, anche l HIV sarà sconfitto, ma questo giorno non è ancora così vicino. Per il momento quindi non resta che tenersi ben saldi ai principi di cautela e prevenzione che possono impedire la trasmissione del virus. Le campagne di prevenzione, la cultura sanitaria e la possibilità di accesso alle cure hanno fatto in modo che finora nella società Occidentale, il numero di malati e di morti di AIDS sia rimasto abbastanza contenuto. Storia del tutto differente è purtroppo quella delle popolazioni dei Paesi poveri, soprattutto dell Africa sub-sahariana. Qui la malattia è in continua diffusione e miete milioni di vite all anno, soprattutto tra i giovani. La scarsa conoscenza della malattia e dei rischi, le precarie condizioni sanitarie, la cultura di quelle popolazioni, in particolare in ambito sessuale, non facilitano il controllo della malattia. Se a questo, si aggiunge lo scarso, se non nullo, accesso alle terapie oggi disponibili, dato il costo inaccessibile dei farmaci, ecco spiegato il perché l AIDS è considerato un vero e proprio flagello in questo continente