Liquido salivare:utilità ai fini dell applicazione dell articolo 187 NCS

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1 IL RUOLO DELLA TOSSICOLOGIA FORENSE NELL APPLICAZIONE DI NORME DI RILEVANTE ATTUALITÀ IN AMBITO DI SICUREZZA DELLA COLLETTIVITÀ GTFI-SIMLA Liquido salivare:utilità ai fini dell applicazione dell articolo 187 NCS B.Lanzetta, A. Lopez FIRENZE, 17 NOVEMBRE 2008

2 Una collaborazione poliennale Direzione Centrale di Sanità del Dipartimento della Pubblica Sicurezza Tossicologia Forense della Facoltà di Medicina e Chirurgia della Università Sapienza di Roma focus on problemi correlati all uso-abuso di sostanze stupefacenti e psicotrope sicurezza stradale

3 Perché la saliva? dati letteratura, significativi per l utilizzol come matrice diagnostica in tossicologia forense sul mercato vi sono dispositivi idonei alla esecuzioni dei cosiddetti test precursori

4 Il Codice della Strada vieta la guida in condizioni di alterazione fisica o psichica correlate con l uso l di sostanze stupefacenti o psicotrope, impone l accertamento l dello stato di alterazione al fine di applicare le sanzioni previste dal dispositivo di legge

5 lo stato di alterazione da. matrice idonea è il sangue ma un prelievo ematico richiede necessariamente la presenza di personale sanitario ed è INVASIVO

6 Perché la saliva su strada?

7 Perché la saliva su strada? ha il vantaggio della non invasività non necessita, per il suo prelievo, di personale sanitario ha tempi di applicazione abbastanza veloci A.G. Verstraete Oral Fluid testing for driving under the influence of drugs:history, recent progress and remaining challenges Forensic Science International 150 (2005) F.M. Wylie, H. Torrance et al. Drugs in oral fluid Part II. Investigation of drugs in drivers Forensic Science International 150 (2005)

8 Modalità operative Pattuglie della Polizia Stradale ed equipe sanitarie della Polizia di Stato a bordo di strutture mobili 296 soggetti fermati casualmente Dalle ore 24 e sino alle ore 5.00 Strade della regione Lazio, in prevalenza nei dintorni di Roma, Latina, Frosinone, Viterbo, Rieti Nella notte tra il venerdì e il sabato, tra il sabato e la domenica, o durante i fine settimana dei lunghi ponti dall aprile del 2006 a metà settembre 2007

9 all interno delle strutture mobili Etilometro Arruolamento Richiesta di consenso scritto Esecuzione del test Cozart DDS panel 5 Prelievo del campione di saliva con cotton roll e trasferimento del campione in appositi vials. Prelievo del campione urinario ed esecuzione del Cozar- UC6THC Rapid Urine Drug Test. Trasferimento del residuo campione di urine in apposite provette di polipropilene. Prelievo del campione ematico in provette eparinizzate Drug Wipe su sudore Test EYE-CHECK valutatore della reattività pupillare ad uno stimolo luminoso

10 ACCERTAMENTI ON SITE Cozart DDS-801 Drug Detection System (Ltd( Abingdon,, UK) metodo immunochimico di screening per 5 classi di sostanze cannabis, cocaine, opiates, methamphetamine e amphetamine Kit per la raccolta del campione salivare Pad assorbente che, posizionato sotto la lingua, raccoglie un volume di saliva pari a ml 1 che viene segnalato da un indicatore di colore blu posto sul manico. Il pad imbevuto viene in seguito riposto all interno di una provetta in plastica, contenente un fluido di eluizione e da un kit portatile per l analisi l qualitativa costituito da una cartuccia di rilevamento Alcune gocce del campione di saliva raccolto vengono poste sulla cartuccia di rilevamento. Dopo pochi minuti si ha la comparsa sulla piastrina di alcune linee tali da consentire la lettura strumentale dei risultati. La piastrina inserita nel dispositivo di lettura fornisce il dato di positività o negatività per ciascuna delle classi testate; Sistema di lettura del test completo di stampante (DDS202S) dispositivo palmare per lettura, memorizzazione e stampa dei

11 Modalità di raccolta dei campioni salivari per il laboratorio Sono stati utilizzati dei tamponi cilindrici di cotone (cotton-roll*) per uso odontoiatrico della ditta Krugg (Germania), tipo misura 1 e diametro 8mm posizionati nel cavo orale per 3-5 min., tempo sufficiente per raccogliere un volume di circa 1ml. La saliva viene recuperata per mezzo di una comune siringa di plastica da 5 ml, comprimendo il rullo imbevuto con il pistone della siringa raccogliendo il liquido in una provetta di polipropilene. Il volume di saliva non recuperato dal cotto-roll è risultato pari a circa il 15%, valore ottenuto misurando il volume di saliva ottenuto da centrifugazione (4000 giri/min.) del cotton-roll dopo il passaggio nella siringa. La scelta del metodo è stata suggerita, oltre che dalla semplicità anche dalla possibilità di raccogliere un discreto volume di saliva non diluito (1-1,5 ml). *Lopez A. e coll.: La saliva: matrice alternativa in tossicologia forense. Med. Leg.Quad. Cam. 2003; XXV, n. 3:

12 i campioni biologici raccolti su strada, debitamente contrassegnati da un codice numerico, sono stati posti in appositi contenitori e trasferiti in laboratorio unitamente alla modulistica e conservati a -20 C C per le successive indagini in GC-MS e HPLC-MS/MS

13 IL CAMPIONE I soggetti fermati avevano un et età compresa tra i 18 ed i 54 anni ed erano costituiti per oltre il 90% da maschi. Non è stato possibile eseguire tutte le indagini sopra riportate a tutti i soggetti fermati Il numero di campioni sottoposti ad analisi on-site con il dispositivo Cozart DDS è stato pari a 252. Sono risultati positivi 74 soggetti che costituiscono il 29,4%.

14 Risultati test immunometrici su strada Distribuzione percentuale dei dati 70,6% 29,4% Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

15 ANALISI ESEGUITE CON DDS Distribuzione percentuale dei positivi Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

16 ANALISI ESEGUITE CON DDS Distribuzione percentuale dei positivi sul totale dei casi analizzati Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

17 ANALISI ESEGUITE CON DDS Distribuzione percentuale dei positivi sul totale dei casi positivi Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

18 GCMS e HPLC MS-MS Distribuzione percentuale dei positivi Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

19 GCMS e HPLC MS-MS Distribuzione percentuale dei positivi sul totale dei casi analizzati Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

20 GCMS e HPLC MS-MS Distribuzione percentuale dei positivi sul totale dei casi positivi Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

21 Criticità Per i cannabinoidi la percentuale di falsi positivi è assai modesta per la cocaina (2,5%) ed accettabile per i cannabinoidi (8,3%) Per la cocaina la percentuale di falsi negativi è, significativa (10,6%) ed è attribuibile alla non elevata sensibilità o cut-off del metodo, mentre per i cannabinoidi non si sono rilevati casi di falsa negatività Per le amfetamine il test immunometrico non è,, a nostro avviso idoneo a causa sia dell elevato elevato numero di falsi positivi (63,6%) attribuibile alle possibili e numerose reazioni crociate, sia per l elevato numero di falsi negativi dovuti per lo più ai valori di cut-off molto alto. Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

22 FALSI POSITIVI 63,6 8,3 cannabinoidi amfetamine 2,5 cocaina Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

23 Aspetti analitici HPLC-MS/MS vs GC-MS Raccolta del campione salivare Cotton roll facilità d uso non necessita di stimolazione chimica volumi alti,bassissimi costi,adsorbimento diverso per le varie sostanze ma con recuperi accettabili fatta eccezione per i cannabinoidi, necessità di estrarre il THC con solventi organici. Dispositivo in dotazioe a Cozart DDS Dispositivo in dotazione al sistema Cozart DDS facilità di prelievo, agevole conservazione del residuo di liquido salivare e del relativo pad per le indagini di conferma, il liquido salivare prelevato viene diluito in un tampone non è possibile risalire con esattezza al volume del campione salivare. sufficiente quando le conferme vengono eseguite mediante HPLC MS/M, potrebbe non essere sempre adeguato quando si utilizza la GC-MS. Validità dei sistemi immunometrici criticità Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

24 La verifica dell utilizzazione del liquido salivare quale matrice alternativa al sangue nei controlli su strada, con la finalità di accertare lo stato di alterazione da sostanze stupefacenti o psicotrope, è stata fatta utilizzando gli stessi dati analitici ma scegliendo dei valori soglia (cut-off) al di sopra dei quali, secondo i dati della letteratura, vi sono evidenze di impairment. Il 28,6% dei soggetti che si trovavano alla guida di autoveicoli era in stato di alterazione (impairment). In particolare il 27,1 per cocaina, il 14,2% per cannabinoidi e l 8,6% per amfetamine. 29% 71% 30 27, ,2 10 8,6 5 0 Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

25 FALSI NEGATIVI ,6 71,4 62, ,6 29,4 37, S1 S2 S3 SERIE 1 POSITIVI E IN STATO DI ALTERAZIONE SERIE 2 POSITIVI DDS SERIE 3 POSITIVI GCMS HPLC MSMS Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

26 Etilometro Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

27 Lopez A., Mantineo G.A.- Droghe del sabato sera- Studio su un campione di 296 automobilisti Supplemento a Jura Medica N , anno XXI

28 PROPOSTE Standardizzare il il prelievo e la conservazione del campione di saliva Aumentare il il volume di saliva da raccogliere solo con i dispositivi in dotazione ai test immunometrici Disporre idoneo contenitore per il il trasferimento del residuo di saliva ai laboratori per le indagini di secondo livello, garantendo la catena di custodia (tipo di contenitore, sigillatura, modalità di conservazione) Approfondire lo studio dell assorbimento sul pad dei vari analiti Studiare la possibilità di trattamento del campione salivare da analizzare in HPLC in analogia con quanto applicato al sangue Studiare il il significato dei rapporti S/P quando si tratta di assunzioni ripetute

29 M. Laloup, M. Wood et al. Correlation of D9-tetrahydrocannabinol concentrations determined by LC-MS/MS in oral fluid and plasma from impaired drivers and evaluation of the on-site Drager Drug Test Forensic Science International 161 (2006) Langel K et al Drug testing in oral fluid-evaluation of sample collection devices. J Anal Toxicol Jul-Aug;32(6): Drummer OH Introduction and review of collection techniques and applications of drug testing of oral fluid. Ther Drug Monit Apr;30(2):203-6 G. Berghaus et al. Dose Related Risk of motor veichol crashes after cannabis use Drugs and Alchool Dependence 73 (2004) E. Cone and J.M. Oyler Cocaine Disposition in Saliva Following intravenous,intranasal, and smoked administration J. Analitycal Toxicology Vol 21,Oct.1997 Cone et al. Correlation of Saliva Cocaine levels with plasma levels and with pharmacological effects after intravenous Cocaine administration in human subjects J. Analitycal Toxicology 21:465; 1997 N. Samyn, G. De Boeck et al. Plasma, oral fluid and sweat wipe ecstasy concentrations in controlled and real life condition Forensic Science International 128 (2002) 90-97