Perdita di funzione e fenotipo clinico

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1 Disordini genomici un disordine genomico submicroscopico è una patologia causata da Perdita Acquisizione Alterazione di uno o più geni contigui, le cui variazioni di dosaggio possono produrre effetti fenotipici. La base molecolare è rappresentata da riarrangiamenti genomici, quali delezioni,duplicazioni, inversioni, spesso senza alterazioni apparenti del cariotipo (<5Mb).

2 Perdita di funzione e fenotipo clinico La gran parte dei geni autosomici si trova nella condizione A o C: il dosaggio genico critico è <50%. In tal caso, si osserva un fenotipo patologico solo se entrambi gli alleli sono colpiti (recesssivo). I geni autosomici responsabili della patogenesi dei disordini genomici si trovano nella condizione B o D: si osserva un fenotipo già in eterozigosi per aploinsufficienza. Spesso anche un dosaggio genico aumentato >>100% può determinare una patologia.

3 Aploinsufficienza Insufficiente quantità di prodotto genico causata da una mutazione in eterozigosi. La mutazione è di tipo allele amorfo o ipomorfo. Colpisce geni per i quali il 50% di prodotto genico non è sufficiente a garantirne la funzione Un dosaggio preciso è richiesto ai fattori di trascrizione e alle molecole di segnale espressi nel corso dello sviluppo.

4 Delezioni del cromosoma X: nei maschi si osserva direttamente in fenotipo come sindrome da geni contigui. Delezioni autosomiche in eterozigosi: Molto spesso il dosaggio dimezzato non è causa di malattia (CNV). In una sindrome da delezione, è risolutivo trovare la stessa sindrome causata da una mutazione puntiforme in uno solo dei geni (S. di Alagille: microdelezione 20p11, mutazioni JAG1). Se questa non si trova, la sindrome esiste solo come somma di più difetti.

5 Duplicazioni segmentali (LCRs) il genoma umano contiene complessivamente il 13,7% di segmenti duplicati più del 90-95% di identità di sequenza il 5,2% del genoma contiene segmenti duplicati lunghi tra 1 e 10kb, mentre il 4,5% tra 10kb e 20kb i cromosomi più colpiti sono l Y (50,4%) ed il 22 (11,9%), ma anche il 7, 9, 10, 15, 16, 17 e X le duplicazioni segmentali possono essere intracromosomiche o intercromosomiche con tre localizzazioni differenti: pericentromeriche (47Mb, dupliconi originati da altri cromosomi) subtelomeriche (ciascuna solo kb, orientate) interstiziali (solo nella specie umana sono disseminate ad una distanza media di 3Mb)

6 Non-allelic homologous recombination (NAHR)

7 Non-allelic homologous recombination (NAHR)

8 Riarrangiamenti cromosomici mediati da duplicazioni segmentali

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10 Principali sindromi da microdelezione LOCALIZZAZIONE SOGGETTI CON SINDROME CROMOSOMICA MICRODELEZIONE Prader Willi/Angelman 15q % Williams 7q % DiGeorge/Velocardiofacciale 22q % Smith-Magenis 17p %

11 Di George/Velocardiofacciale (del22q11.2) E la più frequente sindrome da microdelezione (1:4000) La delezione comprende 3Mb ed almeno 30 geni Nella maggior parte dei casi de novo. In circa il 10% ereditata da un genitore moderatamente affetto.

12 del22q11.2 Il fenotipo clinico varia da lieve a grave Cardiopatie (77% dei casi, soprattutto difetti troncoconali) tronco arterioso, tetralogia di Fallot, difetto del setto ventricolare. Anomalie del palato (75% dei casi) palatoschisi aperta, labiopalatoschisi, insufficienza velofaringea. Ritardo dello sviluppo. Dismorfismi facciali (ipertelorismo, epicanto, radice nasale prominente, ecc.) Anomalie vertebrali (vertebre a farfalla, emivertebre) Deficit immunitario (75% dei casi) da aplasia/ipoplasia del timo Ipocalcemia (50% dei casi) alla nascita. Altri segni clinici: anomalie gastrointestinali, sordità, anomalie renali (agenesia renale), anomalie dei denti (ipoplasia dello smalto) Disturbi dell'apprendimento e/o disturbi psichiatrici (disturbo deficit dell'attenzioneiperattività, schizofrenia) La diagnosi si basa sull'esame clinico e sulla presenza di alterazioni cardiache rilevabili con l'ecocardiografia, o anomalie vertebrali osservabili con la radiografia della regione cervicale. È confermata dall'identificazione della delezione 22q

13 Mutazioni in TBX1 causano 5 caratteristiche fenotipiche principali: facies anomala difetti cardiaci ipoplasia del timo insufficienza velofaringea con palatoschisi disfunzione paratiroidea con ipocalcemia. 13

14 Embrione a 4-6 settimane di gestazione Alterazioni della migrazione delle cellule della cresta neurale dal romboencefalo al sistema degli archi faringei, probabilmente concorrono a determinare peculiari elementi del fenotipo: Anomalie cardiache Anomalie del palato e dismorfismi facciali Deficit immunitario e ipocalcemia.

15 Williams-Beuren La sindrome di Williams è un disordine multisistemico dello sviluppo con un incidenza di circa 1/ nati. E causata da una microdelezione di Mb a 7q11.23, che coinvolge geni. Principali caratteristiche cliniche: Facies caratteristica (faccia da Elfo) Anomalie cardiovascolari Stenosi sopravalvolare dell aorta (70% dei pazienti) Stenosi periferica delle arterie polmonari Ipertensione (50% dei pazienti) Anomalie endocrine Episodi di ipercalcemia (5-50% dei pazienti, particolarmente nell infanzia) Ridotta tolleranza al glucosio isolitamente aumentata nei pazienti WS Anomalie neurocognitive

16 Williams-Beuren Syndrome Critical Region ELN (gene dell elastina): mutazioni in pazienti con stenosi sopravalvolare aortica familiare. LIMK1 e CLIP2: riduzione delle abilità motorie e spaziovisive in modelli animali. GTF2I (GTF2IRD1 incluso): anomalie craniofacciali, disabilità intellettiva, profilo cognitivo tipico WBS (modelli animali e delezioni atipiche).

17 Diagnosi molecolare La microdelezione non è rilevabile con l analisi del cariotipo

18 Caratteristiche morfologiche Faccia da Elfo Occhi blu (77%) con pattern stellato dell iride (74%) ma questo vale per i nordeuropei, strabismo (40%) Naso con la punta bulbosa bocca larga e guance piene microdontia e micrognazia Statura 10 cm in meno del normale

19 Aspetti cognitivi e comportamentali Ritardo mentale di grado lieve-moderato (IQ tra 41 e 80) Scarsa capacità di concentrazione Ritardo nell apprendimento del linguaggio,e poi esagerata loquacità Personalità amichevole e affettuosa: danno facilmente confidenza anche a sconosciuti Ansietà: spesso preoccupati per il benessere altrui Ipersensibilità ai suoni Memoria visiva e uditiva, spesso fuori dal comune Ricordano persone, luoghi e motivi musicali Predisposizione ad imparare le lingue e la musica

20 Smith-Magenis (SMS) E un disordine caratterizzato da anomalie multiple congenite e ritardo mentale E causato da microdelezione a 17p11.2 (90% dei casi) o mutazioni nel gene RAI1 (10% dei casi) con aploinsufficienza Disturbo sporadico (de novo) con una prevalenza di 1: Caratteristiche dei pazienti SMS: Ritardo mentale lieve-moderato (IQ 20-78) Caratteristiche comportamentali peculiari Anomalie cranio-facciali e scheletriche Ritardo nello sviluppo del linguaggio Disturbi del sonno (inversione nel ritmo circadiano della melatonina). Riduzione/perdita dell udito e infezioni croniche dell'orecchio Ipotonia Altre alterazioni sistemiche meno frequenti (es. oculari, cardiache, renali)

21 Circa il 90% dei pazienti SMS hanno la microdelezione 17p11.2 (tra 1.5 e 9 Mb), mentre il restante 10% ha mutazioni in RAI1 (Retinoic Acid Inducible 1). Circa il 70% dei pazienti la microdelezione è di circa 3.7Mb, mentre il restante 30% può presentare delezioni più grandi, più piccole o atipiche. Diagnosi molecolare mediante FISH, array CGH, MLPA.

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23 Aspetti comportamentali I problemi comportamentali sono una caratteristica dei pazienti SMS. Comportamenti disadattivi: Frequenti scoppi di collera, Ricerca di attenzione Aggressività, disobbedienza e scarsa attenzione Comportamenti autolesionistici (sbattere la testa, strappare la pelle, mordersi il polso) sono presenti già a mesi. Caratteristiche uniche della SMS: Onicotillomania (strapparsi le unghie delle mani e dei piedi) Poliembolocoilamania (inserimento di oggetti in orifizi del corpo) Abbracciarsi e stringere le mani

24 Sindrome 5p- Sindrome del Cri du Chat Frequenza 1/50000 nati vivi. E espressione di una delezione parziale del braccio corto del cromosoma 5, de novo nella maggioranza dei casi (85%). Può essere dovuta a: Segregazione sbilanciata di un riarrangiamento cromosomico presente in uno dei due genitori (5-12%). Riarrangiamenti strutturali de novo (6%). Formazione di cromosomi ad anello (2,4 %) Un 4% dei soggetti evidenzia mosaicismo. Il fenotipo, sebbene caratteristico evidenzia ampia variabilità. Superata l età neonatale la sopravvivenza non è compromessa. 24

25 Sindrome 5p- o Sindrome del Cri du Chat (2) I neonati hanno un pianto acuto e flebile, che è caratteristico di questa sindrome. Grave ritardo di crescita e nello sviluppo psicomotorio. Microcefalia Faccia tondeggiante con ipertelorismo, radice del naso allargata, strabismo divergente, micrognazia, ipotonia congenita. Manifestazioni cliniche tardive sono: Asimmetria facciale, voce flebile e acuta, scoliosi. Grave deficit del linguaggio e deficit intellettivo medio-grave. La diagnosi clinica è validata dall analisi citogenetica per evidenziare e definire l estensione della delezione. Regione critica per la sindrome del cri du chat è la banda 5p

26 Sindrome da monosomia 4p o Sindrome di Wolf-Hirshhorn Frequenza 1/50000 nati. La WHS è causata da una delezione parziale del braccio corto del cromosoma 4 che può avere estensione variabile. La regione critica per la tipica sintomatologia e identificabile in 4p16.3. La maggioranza delle delezioni insorge de novo (90%). Più raramente è il risultato della segregazione sbilanciata di una traslocazione familiare. Rara la descrizione di cromosomi ad anello. Quadro clinico variabile in funzione dell estensione della delezione. Ritardo di crescita intrauterino (IUGR) e scarso accrescimento dopo la nascita. Ritardo mentale Microcefalia con dolicocefalia a frequente asimmetria cranica. Dismorfismo facciale (fronte ampia, ipertelorismo, globi oculari sporgenti). 26

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28 Diagnostica molecolare dei disordini genomici

29 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Riconoscimento di variazioni del numero di copie in più di 40 distinte sequenze genomiche mediante un unica reazione di PCR. Campi applicativi: Caratterizzazione di delezioni/duplicazioni o variazioni del numero di copie (aneuploidie) Determinare lo stato di metilazione di promotori o regioni imprinted Riconoscimento di specifiche mutazioni puntiformi o SNPs (single nucleotide polymorphism) Richiede minime quantità di DNA genomico (circa 20 ng).

30 Come funziona l MLPA

31 MLPA probes

32 Hybridization 1. The MLPA probemix is added to denatured genomic DNA 2. The two parts of each probe hybridize to adjacent target sequences

33 Ligation 3. Probes are ligated by a thermostable ligase

34 PCR amplification 4. A universal primer pair is used to amplify all ligated probes The PCR product of each probe has a unique length (rangeb bp)

35 Separation and quantification by capillary electrophoresis Each peak is the amplification product of a specific probe. Samples are compared to a control sample. A difference in relative peak height or peak area indicates a copy number change of the probe target sequence

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38 Analisi mediante MLPA del gene DMD (1) 1.6 ìmlpa_p34_3_c^gmstxt.txt Mix P Paziente A P35 Mix P Ratio Ratio X DMD exon 01 X DMD exon 03 X DMD exon 05 X DMD exon 07 X DMD exon 09 X DMD exon 21 X DMD exon 23 X DMD exon 25 X DMD exon 27 X DMD exon 29 X DMD exon 41 X DMD exon 43 X DMD exon 45 X DMD exon 47 X DMD exon 49 X DMD exon 61 X DMD exon 63 X DMD exon 65 X DMD exon 67 X DMD exon 69 c c c 0 X DMD exon 11 X DMD exon 13 X DMD exon 15 X DMD exon 17 X DMD exon 19 X DMD exon 31 X DMD exon 33 X DMD exon 35 X DMD exon 37 X DMD exon 39 X DMD exon 51 X DMD exon 53 X DMD exon 55 X DMD exon 57 X DMD exon 59 X DMD exon 71 X DMD exon 73 X DMD exon 75 X DMD exon 77 X DMD exon 79 c c c Mapview Mapview Femmina portatrice di una delezione degli esoni 12-30

39 Analisi mediante MLPA del gene DMD (2) Maschio affetto (BMD) con duplicazione in emizigosi degli esoni 3-4

40 Methylation-specific MLPA (MS-MLPA)

41 Methylation-specific MLPA (MS-MLPA) Promoter region of SNRPN gene Undigested or Digested with HhaI (CGC G) AS PWS Normal

42 Identificazione di specifiche mutazioni puntiformi mediante MLPA

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