16/12/2011. Mitocondri. Biotecnologie_2011

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1 Mitocondri Biotecnologie_2011 1

2 *l ambiente in assoluto più ossigenato, se sangue arterioso * Hematology s/1971/jns issue 3/jns /production/images/small/jns_1971_35_3_0263.fig00 7.gif 2

3 Membrane mitocondriali Teoria endosimbiontica cells/organelles/ I mitocondri sono circondati da due membrane, la membrana mitocondriale esterna e la membrana mitocondriale interna. La membrana mitocondriale esterna racchiude completamente il mitocondrio e rappresenta il confine con il citosol. La membrana mitocondriale interna contiene due domini interconnessi: Membrana delimitante interna: sotto la membrana mitocondriale esterna. Particolarmente ricca di proteine implicate nell importo di proteine mitocondriali. Creste mitocondriali: si estendono verso l interno dell organello. La membrana delimitante interna e le creste sono collegate da sottili connessioni giunzioni delle creste. Adattato da Karp G.: Biologia Cellulare e Molecolare: Concetti ed Esperimenti, EdiSES, IV ed., 2010; Smith & Wood, Cell Biology,2nd ed., Stanley Thornes, Membrana mitocondriale esterna E formata per il circa 50% di lipidi (lipidi simili a qulli della maggior parte delle altre membrane delle cellule eucariotiche. Contiene solo il circa 5% della massa totale di proteine dei mitocondri. Le proteine più abbondanti sono le porine, proteine integrali che formano ampi canali (2 3 nm) circondati da una palizzata di foglietti β (similmente alla membrana esterna che fa parte della parete cellulare dei batteri Gram ). Le porine sono strutture dinamiche in grado di chiudersi reversibilmente a seconda delle condizioni della cellula: Quando i canali delle porine sono aperti, la membrana esterna è permeabile a molecole con peso molecolare fino a 1000 o meno, in particolare anche l ATP, il NAD e il coenzima A, che giocano un ruolo chiave nel metabolismo energetico. Contiene diversi enzimi quali la NADH /citocromo b5 ossido reduttasi, la monoamina ossidasi e enzimi coinvolti nell ossidazione dell adrenalina, nella degradazione del triptofano e l allungamento degli acidi grassi. Presenti sia nella membrana esterna dei batteri Gram che nella membrana esterna dei mitocondri Porine battere 3

4 Spazio intermembrane Proteine coinvolte nella morte cellulare programmata (apoptosi). Vd figura Karp Membrana mitocondriale interna (1) Praticamente priva di colesterolo ma ricca di un lipide inusuale il difosfatidil glicerolo, detto anche cardiolipina. La cardiolipina, che ha una bassa concentrazione nella membrana mitocondriale esterna, conta per circa il 20% del contenuto totale di lipidi della membrana interna. La membrana interna contiene più di 100 diversi tipi di polipeptidi Contiene un alto rapporto proteine/lipidi (> 3:1 in peso; circa il 20% del contenuto totale di proteine dei mitocondri) Cardiolipina (1) La cardiolipina (difosfatidilglicerolo) è un lipide molto concentrato della membrana mitocondriale interna, ma anche nella membrana plasmatica dei batteri, ossia in membrane coinvolte nella trasduzione di energia. Cardiolipina (2) La cardiolipina è importante per ridurre la permeabilità ai protoni dando così origine al gradiente elettrochimico di protoni fra lo spazio intermembranario e la matrice dei mitocondri. La cardiolipina è un doppio fosfolipide inusuale, che contiene quattro catene di acidi grassi e che si trova principalmente nella membrana mitocondriale interna. 4

5 Cardiolipina (3) Membrana mitocondriale interna (2) Nel cuore, tessuto ricco di mitocondri, i fosfolipidi mitocondriali svolgono diversi ruoli nella regolazione dei vari processi mitocondriali che includono l apoptosi, il trasporto degli elettroni e l importazione verso i mitocondri di proteine e lipidi. (Hatch GM. Cell biology of cardiac mitochondrial phospholipids. Biochem Cell Biol. 82: , 2004). E la membrana specializzata per la trasduzione di energia ed è impermeabile a quasi tutti i piccoli ioni. Vi si trovano tre tipi principali di complessi proteici: Componenti della catena di trasporto di elettroni (catena respiratoria): complessi I, II, II e IV. L ATP sintasi Proteine di trasporto specifiche che mediano il trasporto di metaboliti verso e al di fuori della matrice mitocondriale. L architettura e la grande fluidità della membrana mitocondriale interna facilitano le interazioni tra i componenti richiesta per la produzione di ATP e in particolare la diffusione laterale di piccole proteine coinvolte nel trasporto di elettroni della catena di trasporto degli elettroni. Le membrane mitocondriali dividono i mitocondri in due compartimenti ripieni di fluido: Matrice: Consistenza di gel, dovuta ad elevata concentrazione di proteine idrosolubili (< 500 mg/ml). Contiene diversi enzimi, in particolare quelli che catalizzano i vari passi del ciclo degli acidi tricarbossilici (ciclo di Krebs) Contiene ribosomi e parecchie molecole di DNA a doppio filamento, di solito circolari. Il DNA mitocondriale codifica per un piccolo n di proteine (circa 13 nell uomo) coinvolte nel trasporto degli elettroni nelle creste mitocondriali, per due RNA ribosomiali e per una ventina di trna. DNA mitocondriale (1) Mappa del DNA mitocondriale umano (mtdna) che illustra i loci dove possono avere luogo mutazioni che portano a citopatie. Le lettere singole sono le abbreviazioni convenzionali ad una lettera degli aminoacidi. ND: NADH deidrogenasi CO: citocromo ossidasi 12S e 16S: RNAs ribosomali /figure/A3442/?report=objectonly 5

6 DNA mitocondriale (2) MATRICE & MEMBRANA MITOCONDRIALE INTERNA La catena respiratoria mitocondriale. Le subunità codificate dal DNAnucleare sono in rosso, mentre le subunità codificate dal mtdna sono in porpora. I protoni (H + ) sono pompati dalla matrice verso lo spazio intermembranoso attraverso i complessi I, III e IV. Essi ritornano verso la matrice attraverso il complesso V (ATP sintasi) con la concomitante produzione di ATP. Il coenzima Q10 (CoQ) e il citocromo c (Cyt c) sono proteine di trasferimento di elettroni codificate dal DNA nucleare. Reazioni che catalizzano l ossidazione del piruvato e degli acidi grassi a CO 2 e H 2 O. Sintesi ad esse accoppiata di ATP a partire da ADP + P i. ND: NADH deidrogenasi SDH: succinato deidrogenasi COX: citocromo ossidasi A6 e A8: subunità del complesso V dell ATP sintasi BK22005/figure/A3436/ Tre gruppi di reazioni in regioni distinte dei mitocondri (1) MATRICE (insieme a proteine della membrana mitocondriale interna rivolte verso la matrice): Ossidazione del piruvato e degli acidi grassi a CO 2 Riduzione dei coenzimi NAD + e FAD a NADH e FADH 2 Tre gruppi di reazioni in regioni distinte dei mitocondri (2) MEMBRANA MITOCONDRIALE INTERNA: Trasporto di elettroni dal NADH e dal FADH 2 all O 2 Accoppiato alla creazione di FORZA PROTON MOTRICE (gradiente protonico) attraverso la membrana mitocondriale interna. COMPLESSO F 0 F 1 SULLA MEMBRANA INTERNA: Utilizzazione dell energia accumulata nel gradiente protonico per la sintesi dell ATP. 6

7 Mitocondri METABOLISMO Metabolismo nei mitocondri (1) DECARBOSSILAZIONE DEL PIRUVATO 7

8 MOVIMENTO DEL PIRUVATO DAL CITOSOL VERSO LA MATRICE MITOCONDRIALE La struttura dell importante molecola trasportatrice ( Carrier ) attivata acetil CoA. In alto un modello space-filling della struttura. Un atomo di zolfo (giallo) forma un legame tioestere con l acetato. Dato che questo è un legame ad elevata energia, che rilascia una grande quantità di energia libera quando è idrolizzato, la molecola di acetato può essere prontamente trasferita ad altre molecole. Decarbossilazione ossidativa del piruvato (matrice mitocondriale) Il piruvato viene convertito in CO 2 (decarbossilato) e in acetilcoa, in un processo che produce anche una molecola di NADH. Il coenzima A (CoA SH) é un trasportatore generale di gruppi acilici attivati in una grande varietà di reazioni. 8

9 Il complesso della piruvato deidrogenasi Le molecole di piruvato prodotte nella glicolisi sono trasportate attraverso la membrana mitocondriale interna verso la matrice, dove vengono decarbossilate per formare gruppi acetile, con 2 atomi di carbono ( CH 3 COO 2 ). Il gruppo acetile forma in seguito un complesso con il coenzima A per formare acetil CoA: Piruvato + HS CoA + NAD + acetil CoA + CO 2 + NADH + H + La decarbossilazione del piruvato ed il trasferimento del gruppo acetile al CoA sono catalizzati dal complesso multienzimatico gigante della piruvato deidrogenasi nella matrice mitocondriale. Ciclo di Krebs, degli acidi tricarbossilici o dell acido citrico 9

10 Consegna elettroni alla catena respiratoria sulla m.m. interna I prodotti significativi del ciclo di Krebs Diffonde via dalla cellula Consegna elettroni alla catena respiratoria sulla m.m. interna Il ciclo dell acido citrico genera elettroni ad alta energia Il ciclo dell acido citrico converte gli atomi di carbonio dell acetil CoA in CO 2 che la cellula elimina come prodotto di scarto. Il punto molto importante è che tale l ossidazione genera elettroni ad alta energia, trasportati dalle molecole «carrier» attivate, NADH e FADH 2. Questi elettroni ad alta energia sono in seguito trasferiti alla membrana mitondriale interna dove incontrano la catena di trasporto degli elettroni. La perdita degli elettroni dal NADH e dal FADH 2 rigenera il NAD + e il FAD, necessari per che il metabolismo ossidativo prossegua. La riduzione dell ossigeno ad acqua avviene in diversi passi (1) Metabolisamo CATENA DI TRASPORTO DEGLI ELETTRONI La reazione energeticamente favorevole H 2 + ½ O 2 H 2 0 viene fatta svolgere in diversi passi in modo che l energia rilasciata possa essere immagazzinata invece di venire persa nell ambiente sotto forma di calore. Prima gli atomi di idrogeno sono separati in protoni ed elettroni. Gli elettroni passano attraverso una serie di trasportatori di elettroni presenti sulla membrana mitocondriale interna. In diverse occasioni i protoni e gli elettroni sono ricombinati transitoriamente. I protoni ritornano permanentemente alla matrice soltanto alla fine della catena di trasporto degli elettroni; nella matrice possono essere usati per neutralizzare le cariche negative create dall aggiunta finale di elettroni alla molecola di ossigeno. 10

11 La riduzione dell ossigeno ad acqua avviene in diversi passi (2) Il processo di trasporto degli elettroni inizia quando l ione idruro (ione carico negativamente dell idrogeno: H ) è rimosso dal NADH (per rigenerare NAD + ) ed è convertito in un protone e due elettroni (H H + + 2e ). I due elettroni sono passati al primo di una serie di più di 15 diversi trasportatori di elettroni nella catena respiratoria. Gli elettroni iniziano con energia molto elevata e progressivamente la perdono mentre passano lungo la catena. Nella maggior parte dei passi gli elettroni passano da un ione metallico ad un altro (ciascuno di questi ioni è strettmanete legato ad una molecola proteica che altera l affinità verso gli elettroni del metallo) La riduzione dell ossigeno ad acqua avviene in diversi passi (3) La maggior parte delle proteine coinvolte sono raggruppate in tre grandi complessi enzimatici respiratori, ciascuno dei quali contiene proteine transmembrana che trattengono i complessi fermamamente nella membrana mitocondriale interna. Ogni complesso della catena ha un affinità verso gli elettroni superiore a quella del suo predecessore, e quindi gli elettroni passano in sequenza da un complesso all altro finchè non sono trasferiti all ossigeno, che ha l affinità per gli elettroni superiore a tutti gli altri. Mentre gli elettroni si muovono lungo la catena respiratoria, l energia viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico attraverso la membrana interna (1) La fosforilazione ossidativa è possibile dato che i trasportatori di elettroni sono strettamente associati alle molecole proteiche. Le proteine guidano gli elettroni lungo la catena respiratoria in modo che essi si muovano in sequenza da un complesso enzimatico al successivo. Il trasferimento degli elettroni è accoppiato: alla captazione e rilascio orientati di H + a modificazioni allosteriche nelle pompe protoniche coinvolte nella conversione di energia. Il risultato complessivo è il pompaggio di H + attraverso la membrana interna dalla matrice allo spazio intermembrane pilotato dal flusso energeticamente favorevole di elettroni. Mentre gli elettroni si muovono lungo la catena respiratoria, l energia viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico attraverso la membrana interna (3) Il movimento dell H + ha due conseguenze principali: Genera un gradiente di ph attraverso la membrana interna, con ph superiore nella matrice rispetto allo spazio intermembrana (e al citosol, dato che la membrana esterna è permeabile ). Genera un gradiente di voltaggio (potenziale di membrana) attraverso la membrana interna, in cui l interno è negativo e l esterno positivo (come risultato del flusso netto di ioni positivi). 11

12 Mentre gli elettroni si muovono lungo la catena respiratoria, l energia viene immagazzinata sotto forma di gradiente protonico attraverso la membrana interna (4) Il gradiente di ph (ΔpH) pilota il ritorno degli H + verso la matrice, così rinforzando l effetto del potenziale di membrana (ΔV), che agisce per attrarre qualsiasi ione positivo verso la matrice e quindi per spingere gli ioni negativi fuori. Complessivamente, il ΔpH e il ΔV costituiscono un gradiente elettrochimico protonico. Il gradiente elettrochimico protonico esercita una forza proton motrice (misurata in millivolts, mv) 12

13 Il gradiente protonico pilota la sintesi dell ATP (1) Il gradiente elettrochimico protonico attraverso la membrana mitocondriale interna è il processo fondamentale della fosforilazione ossidativa. Questa è svolta mediante un enzima legato alla membrana interna, l ATP sintasi. L ATP sintasi crea una via idrofilica attraverso la membrana interna che permette il flusso di protoni lungo il loro gradiente elettrochimico. Mentre i protoni si incanalano lungo l ATP sintasi, essi sono usati per pilotare la reazione energeticamente sfavorevole fra l ADP e il P i che permette il ripristino dell ATP. Natura elettrochimica del gradiente protonico Dato che i protoni sono carichi positivamente, il gradiente protonico stabilito attraverso la membrana mitocondriale interna ha componenti sia chimiche che elettriche. La componente chimica è la concentrazione di protoni, o gradiente protonico, che corrisponde ad una concentrazione circa dieci volte superiore di protoni nel versante citosolico della membrana mitcondriale interna (differenza di una unità di ph). Inoltre, vi è un potenziale elettrico attraverso la membrana, che deriva dall aumento netto di cariche positive sul versante citosolico. 13

14 CHEMIOSMOSI (1) CHEMIOSMOSI (2) Il NADH e il FADH 2 trasportano protoni (H + ) ed elettroni (e ) alla catena di trasporto di elettroni localizzata sulla membrane mitocondriale interna. L energia del trasferimento di elettroni lungo la catena trasporta dei protoni attraverso la membrana crea un gradiente elettrochimico. Man mano che i protoni che si accumulano seguono il gradiente elettrochimico di ritorno attraverso la membrane lungo un complesso ATP sintasi, il movimento dei protoni fornisce l energia per sintetizzare ATP a partire dall ADP e fosfato. Alla fine del sistema di trasporto di elettroni, due protoni, due elettroni e una metà di una molecola di ossigeno si combinano per formare acqua. Poichè l ossigeno è l accettore finale degli elettroni, il processo è detto respirazione aerobica. Riassunto dell ossidazione aerobica del piruvato nei mitocondri (2) Proteine specifiche di trasporto (ovali) sulla membrana interna importano il piruvato (ocra), l ADP (verde) e il P i (viola) verso la matrice ed esportano l ATP. Il NADH generato nel citosol non viene trasportato direttamente verso la matrice perché la membrana interna é impermeabile al NAD + e al NADH; invece, un sistema navetta ( shuttle (ovale rosso) trasporta gli elettroni del NADH citosolico al NAD + della matrice mitocondriale. L O 2 diffonde verso la matrice e il CO 2 diffonde verso l esterno. HSCoA: coenzima A libero (CoA) SCoA: CoA esterificato. 14

15 Riassunto dell ossidazione aerobica del piruvato nei mitocondri (3) Gli acidi grassi vengono legati al CoA sulla membrana mitocondriale esterna. In seguito, il gruppo acilico grasso é rimosso dal CoA, legato ad un trasportatore (la carnitina) che lo fa attraversare la membrana mitocondriale interna; a questo punto l acido grasso viene riattaccato ad un CoA presente dal lato rivolto verso la matrice della membrana interna (ovale blu). Riassunto dell ossidazione aerobica del piruvato nei mitocondri (4) L ossidazione del piruvato nel ciclo dell acido citrico genera NADH e FADH 2. Gli elettroni di questi coenzimi ridotti sono trasferiti mediante quattro complessi di trasporto degli elettroni (rettangoli blu) all O 2 concomitantemente con il trasporto di ioni H + dalla matrice allo spazio intermembranoso, generando una forza protonmotrice. Il complesso F 0 F 1 (arancio) allora sfrutta la forza proton motrice per sintetizzare ATP. Le frecce blu indicano il flusso degli elettroni; le frecce rosse il movimento transmembrana di metaboliti. Lodish et al.: Molecular Cell Biology 16. Cellular Energetics: Glycolysis, Aerobic Oxidation, and Photosynthesis Oxidation of Glucose and Fatty Acids to CO2 Il gradiente protonico pilota il trasporto accoppiato attraverso la membrana interna (1) Il gradiente protonico pilota altri processi oltre che la sintesi dell ATP. Molte molecole di piccole dimensioni cariche, quali il piruvato, l ADP, e il P i sono pompati verso la matrice dal citosol. Altre, quali l ATP, devono essere spostate in senso opposto. I trasportatori che legano tali molecole/ioni possono accoppiare il loro trasporto al flusso energeticamente favorevole di H + verso la matrice mitocondriale. Perciò ad es. il piruvato e il fosfato inorganico (P i ) sono c trasportati verso l interno con il H + quando esso si muove verso la matrice Il gradiente protonico pilota il trasporto accoppiato attraverso la membrana interna (2) L ADP e l ATP sono cotrasportati in direzioni opposte (antiporto) mediante una singola proteina trasportatrice. Dato che la molecola di ATP ha una carica negativa in più rispetto all ADP ogni scambio di nucleotidi ha come conseguenza il fatto che una carica negativa sia trasportata al di fuori del mitcondrio. Quindi, la differenza di potenziale attraverso la membrana interna pilota il co trasportatore ADP ATP 15

16 Trasporto di metaboliti attraverso la membrana mitocondriale interna (1) Mitocondri TRASPORTATORI E NAVETTE SULLE MEMBRANE MITOCONDRIALI Trasporto di metaboliti attraverso la membrana mitocondriale interna (2) Il trasporto di piccolo molecule attraverso la membrane interna è mediato da proteine di trasporto che attraversano la membrana e guidato dal gradiente elettrochimico. Ad esempio, l ATP viene esportato dai mitocondri verso il citosol da un trasportatore che lo scambia con l ADP. La componente di voltaggio del gradiente elettrochimico guida questo scambio: l ATP porta una maggiore carica negativa ( 4) dell ADP ( 3), e perciò l ATP é esportato dalla matrice mitocondriale al citosol mentre l ADP viene importato verso i mitocondri. Viceversa, il trasporto del fosfato (P i ) e del piruvato é accoppiato ad uno scambio con ioni idrossilici (OH ); in questo caso, la componente di ph del gradiente elettrochimico guida l esportazione degli ioni idrossilici, accoppiata al trasporto di P i e piruvato verso i mitocondri. 16

17 Mitocondri ULTRASTRUTTURA Navetta («shuttle») per riossidare nei mitocondri il NADH formato nel citosol, quando c è ossigeno. Altrimenti il NADH può venire ossidato mediante la fermentazione. 17

18 Cellule parietali dello stomaco: secernono acido cloridrico Tubuli renali 1.shtml Tubuli distali del nefrone: riassorbono sodio dall ultrafiltrato contro gradiente 18

19 JC 1 Dye Mitchondrial Membrane Potential Probe Health-and-Viability-Assays-for-Flow-Cytometry/Apoptosis-Assays-for-Flow-Cytometry/JC-1-Dye-Mitochondrial- Membrane-Potential-Probe.html 19