Impiego Per la misura quantitativa in vitro di Vitamina B12 nel siero e plasma umani (EDTA o eparina), utile nella diagnosi differenziale di anemia.

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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti per Vitamina B12 (1/2) B Impiego Per la misura quantitativa in vitro di Vitamina B12 nel siero e plasma umani (EDTA o eparina), utile nella diagnosi differenziale di anemia. Compendio e spiegazione del dosaggio Livelli ridotti di Vitamina B12 possono indicare la presenza di anemia da carenze vitaminiche. Livelli elevati di Vitamina B12 sono stati associati alla gravidanza, all uso di contraccettivi orali e di multivitamine e nelle malattie mieloproliferative, come leucemia granulocitica cronica e la leucemia mielomonocitica. Non è noto che livelli elevati di vitamina B12 provochino problemi clinici. La misura della Vitamina B12 è prevista ai fini dell identificazione e del monitoraggio della carenza di Vitamina B12, imputabile a: (1) difetto nella secrezione di fattore intrinseco, con conseguente cattivo assorbimento degli alimenti (anemia perniciosa) 1 ; (2) gastrectomia e malassorbimento derivanti da resezione chirurgica; e (3) diverse malattie batteriche o infiammatorie interessanti l intestino tenue 2,3,4. Principi della procedura Il dosaggio Vitamina B12 per prodotti immunodiagnostici VITROS viene eseguito con le Confezioni dei reagente per Vitamina B12 VITROS 1 e 2, la Confezione dei reagente 3 per Vitamina B12/Folato per prodotti immunodiagnostici VITROS e i calibratori di Vitamina B12 per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema immunodiagnostico VITROS. Viene adottata una reazione legante di tipo competitivo che si basa sulla competizione tra la Vitamina B12 presente nel campione e la Vitamina B12 marcata con perossidasi di rafano (HRP) per un numero limitato di siti leganti su un fattore intrinseco biotinilato presente nella fase liquida. La Vitamina B12 presente nei campioni dei pazienti viene rilasciata dalle sue proteine leganti endogene ad opera delle denaturazione alcalina. Viene aggiunto coniugato fattore intrinseco biotinilato che viene incubato con il campione neutralizzato trattato. Un aliquota del campione trattato viene trasferita in un pozzetto rivestito di streptavidina, dove viene aggiunto il coniugato B12-HRP. In seguito ad una reazione legante di tipo competitivo, il complesso fattore intrinseco-vitamina B12 viene catturato dalla streptavidina presente sul pozzetto. Il coniugato non legato viene rimosso mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 5. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni, viene aggiunto ai pozzetti. La perossidasi da rafano nel coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta prolungandone l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato HRP legato è inversamente proporzionale alla concentrazione di vitamina B12 presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale Potenzialmente Infettivo Gli emoderivati contenuti nella presente confezione e nei calibratori per Vitamina B12 VITROS provengono da donatori umani i quali sono stati sottoposti a test individuali usando metodi approvati (immunodosaggio enzimatico) e risultati negativi per quanto concerne la presenza dell antigene di superficie dell epatite di tipo B, di anticorpi del virus dell immunodeficienza umana (HIV 1+2) e del virus dell epatite C (HCV). Trattare come materiale potenzialmente infettivo. Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare i campioni di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, dell HIV 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es. Direttiva M29 del NCCLS 6 ). Versione 3.0 Pubb. n. GEM1350_IT 1

2 B12 ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti AVVERTENZA: Contiene 2-Cloroacetammide Il reagenti contenente 2-Cloroacetammide. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Materiali forniti Scatola contenente due confezioni, comprendenti: Confezione dei reagente 1 contenente: 100 pozzetti rivestiti (streptavidina, legante 3 ng biotina/pozzetto). 6,7 ml di reagente per fattore intrinseco biotinilato (legante 1,05 ng B12/mL) in soluzione tampone con agente antimicrobico. 6,7 ml di reagente coniugato (HRP-B12, 650ng/mL) in soluzione tampone con agente antimicrobico. Confezione dei reagente 2 contenente: 100 pozzetti non rivestiti. 6,2 ml di reagente per trattamento campione (stabilizzazione) con agente antimicrobico. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Confezione dei reagente 3 per Vitamina B12/Folato (comprese scheda di lotti), Calibratori per Vitamina B12 (comprese scheda di calibrazione lotti e scheda dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante (per Confezione dei reagente 1 e 2). Preparazione e conservazione dei reagenti Le confezioni dei reagente per Vitamina B12 (1 e 2) vengono fornite pronti per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 12 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni dei reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati con essiccante a secco. Le confezioni dei reagente 3 per Vitamina B12/Folato vengono fornite pronte per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni dei reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati. I calibratori per Vitamina B12 vengono forniti pronti per l uso. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono usare campioni di siero o plasma (EDTA o eparina). Per la raccolta dei campioni ematici attenersi a procedure standard. Non riutilizzare campioni emolizzati. I campioni di siero o plasma possono essere conservati fino ad un massimo di 7 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 7. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con il sistema VITROS. 2 Pubb. n. GEM1350_IT Versione 3.0

3 ISTRUZIONI PER L USO Note sul controllo di qualità e sulla procedura B12 Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni dei reagenti (Confezione dei reagenti 1) e i calibratori vengono associati in base al numero del lotto. Le confezioni dei reagenti (Confezione dei reagenti 1) dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che dev essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. La confezione dei reagente 2 per Vitamina B12 non è associata mediante numero di lotto alla Confezione dei reagente 1 o ai calibratori e può essere utilizzata separatamente. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. Manipolare i campioni, calibratori e controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Riportare a 2-8 C quanto prima dopo l uso oppure caricarne soltanto un quantitativo sufficiente per un singolo impiego. I calibratori può essere suddiviso/possono suddivisi in aliquote in contenitori alternativi, che devono essere identificati mediante le etichette con codice a barre fornite in dotazione. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti e la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sufficienti a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli per l anemia per prodotti immunodiagnostici VITROS contengono 3 idonei livelli di Vitamina B12 (bassi, medi, elevati). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente all esecuzione di una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è B12. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio è B12. Se necessario è possibile riconfigurare. I risultati possono essere espressi come pg/ml o pmol/l. Tali opzioni sono configurabili dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. Procedura Il dosaggio per Vitamina B12 VITROS richiede 30 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio per Vitamina B12 VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti (Confezione dei reagente 1) e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per Vitamina B12 VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema immunodiagnostico VITROS, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema a questo punto viene visualizzato il pulsante relativo alle diverse determinazioni sulla videata di programmazione dei campioni. Digitalizzare la scheda di calibrazione dei lotti per i singoli nuovi lotti di Confezioni dei reagente 1 per Vitamina B12, Confezione dei reagente 2 e Confezione dei reagente 3 per Vitamina B12/Folato immettendo le informazioni lottospecifiche relative alla calibrazione (Confezione dei reagente 1) ed alla scadenza. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). Verificare che siano stato caricati le Confezioni dei reagente 1, 2 e 3 e che per ogni confezione sia disponibile un quantitativo di reagente sufficiente per il lavoro programmato. I nomi che verranno visualizzati nella videata di Gestione dei reagenti sono B12 (Confezione dei reagente 1), P2B12 (Confezione dei reagente 2) e P3 BF (Confezione dei reagente 3). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i settori sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Verificare che nel dispositivo di alimentazione dei puntali ausiliari siano disponibili puntali monouso in numero sufficiente per eseguire il lavoro programmato. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. 4. Processare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto: la calibrazione parte automaticamente. Versione 3.0 Pubb. n. GEM1350_IT 3

4 B12 ISTRUZIONI PER L USO Risultati Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di aggiustamento di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata per il sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Se non vengono rispettati tutti i range dei parametri di qualità definiti, sul rapporto di calibrazione appare un codice d identificazione. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I valori dei campioni dei pazienti che non rientrano nell intervallo di riferimento vengono identificati con un codice basso o elevato LO o HI. I valori dei controlli vengono identificati se 2 DS rispetto alla media della linea di base definita. Non esistono parametri individuali in grado di descrivere completamente la qualità dell aggiustamento della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. I campioni contenenti trioleina (33,9 mmol/l), hemoglobin (1,5 g/l) o bilirubina (0,171 mmol/l) interferiscono con questo dosaggio in ragione di meno del 10%. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nel siero restano elevati fino a 24 ore dopo somministrazione orale o endovenosa di biotina. I campioni contenenti 20 ng di biotina/ml interferiscono in ragione di meno del 10%. Valori attesi Ogni laboratorio dovrebbe confermare la validità degli intervalli di rifermento rispetto alla popolazione afferente. Come indicazione, il seguente intervallo (2,5 e 97,5 percentile) è stato determinato da 261 campioni di pazienti non anemici di età compresa fra i 18 ed i 65 anni: da 239 a 931 pg/ml. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla L intervallo di calibrazione del dosaggio per la Vitamina B12 VITROS è pg/ml (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati per essere messi in correlazione con un altro dosaggio disponibile in commercio). Le concentrazioni di Vitamina B12 vengono espresse in pg/ml o pmol/l. La conversione fra le unità si effettua tramite la seguente formula: Risultato in pmol/l = risultato in pg/ml x 0,738 Accuratezza Si è ottenuta una correlazione tra il dosaggio Vitamina B12 VITROS e un dosaggio del commercio (X) misurando un pannello di 98 campioni di pazienti appartenenti a diverse categorie cliniche. Il range di campioni utilizzato andava da 79,2-971 pg/ml con dosaggio Vitamina B12 VITROS a pg/ml con il dosaggio del commercio: Dosaggio Vitamina B12 VITROS = 0,947 x X + 10,6 (pg/ml), con coefficiente di correlazione di 0, Pubb. n. GEM1350_IT Versione 3.0

5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia B12 Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-A 8 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Due replicati di ognuno dei 3 Controlli per anemia sono stati analizzati in 2 diverse occasioni al giorno per almeno 20 diversi giorni. L esperimento è stato eseguito due volte usando 3 lotti di reagenti differenti su 3 Sistemi differenti. I dati presentati sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Concentrazione tipica Intra-dosaggio Intracalibrazione Intralaboratorio pg/ml DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 221 4,06 1,8 9,16 4,1 10,5 4, ,87 1,8 20,8 5,4 22,6 5, ,1 2,3 36,6 5,2 41,5 5,9 * Quadratica media Intra-dosaggio: Precisione fra un duplica e l altro, con media ottenuta su tutte le repliche. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variazione infra-replica, fra una replica e l altra e da un giorno all altro. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità La sensibilità analitica viene definita come la concentrazione di 2 deviazioni standard rispetto alla media di un campione che non contiene analiti, dove vengono determinati 20 replicati. La sensibilità del dosaggio VITROS Vitamina B12 è tipicamente inferiore di 90 pg/ml. Specificità I potenziali cross-reagenti sottoindicati hanno provocato interferenze inferiori a 0,002% nel dosaggio Vitamina B12 VITROS: Cobinamide dicyanide (10 µg/ml). Bibliografia 1. Ardeman S, Chanarin I. Assay of gastric intrinsic factor in the diagnosis of Addisonian pernicious anaemia. British J. Haematology II, , (1965) 2. Chanarin I (ed). The Megaloblastic Anaemias 3rd Edition 1990, Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK. 3. Chanarin I (ed). The Megaloblastic Anaemias 2nd Edition 1979, Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK. 4. Williams JW et al. Hematology 3rd Edition 1986, McGraw-Hill Book Company, Singapore. 5. Summers M et al. Luminogenic Reagent Using 3-Chloro 4-Hydroxy Acetanilide to Enhance Peroxidase/Luminol Chemiluminescence, Clin Chem 41. S73 (1995). 6. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR. Specimen Processing Separator Gels: An Update, J Clin Immunoassay 11: (1988). 8. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices - Approved Guideline. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-A (1999). Versione 3.0 Pubb. n. GEM1350_IT 5

6 B12 ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1350_IT Versione 3.0

7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni B12 Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1350/103.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 3.0 Pubb. n. GEM1350_IT 7

8 B12 ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1350_IT Versione 3.0