Reticolo endoplasmatico: sistema di canali, sacchi e vescicole membranose delimita un lume interno Strutturalmente e funzionalmente diviso in liscio

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1 Organuli cellulari

2 Reticolo endoplasmatico: sistema di canali, sacchi e vescicole membranose delimita un lume interno Strutturalmente e funzionalmente diviso in liscio e rugoso

3 Reticolo endoplasmico Sistema di tubuli, vescicole e sacchi appiattiti Cisterne intercomunicanti RER RE REL Assente negli ovociti e cell. embrionali. Molto svilupp. nelle cell. impegnate nella sint. prot. Si sviluppa durante il differenziamento Contiene proteine per la magg. parte integrali RER: Adesione di ribosomi alla faccia delle membr. rivolte verso il citosol (cell.pancreas) Alcune proteine integrali di membr. provviste att. enzim. iniziano processo glicosil. REL (sacche tubulari) Sintesi lipidi, ormoni steroidei, metab.glicogeno Enzimi faccia membr. rivolta verso citosol Lipidi leg. prot. Mitocondri cloroplasti Colesterolo diffonde da solo nel citopl.

4 Il RE non è visibile con la M.O. RER: Un sottodominio è rappresentato dagli ELEMENTI TRANSIZIONALI (ET): Formano le vescicole di transizione che trasportano i lipidi e le proteine dal RE al GOLGI. Gli ET assomigliano al REL. La quantità del RE varia a seconda delle cellule, es.: - RER + presente nel fegato - REL + presente nelle cellule del Leydig (ormoni steroidei)

5 Dopo omogenizzazione e centrifugazione le membrane del RER e REL si organizzano in MICROSOMI che sono quindi un artefatto del processo di frazionamento. RER: le proteine sono inserite nel RER con un meccanismo co-traduzionale. Dopo la biosintesi 1. Le proteine di membrana rimangono ancorate alla m. del RER tramite le regioni idrofobiche degli Aa o tramite legami covalenti ai lipidi di membrana 2. Le proteine solubili sono rilasciate nel lume del RER. Le proteine per il perossisoma, mitocondrio e cloroplasto sono introdotte con meccanismo post-traduzionale. RER è anche Sito della f. iniziale dell aggiunta di carboidrati Ripiegamento conformazionale di polipeptidi Assemblaggio delle proteine multimeriche Sito di controllo della qualità delle prot. le proteine non buone vengono esportate dal RER per la degradazione

6 Il RER è associato ai ribosomi Sede di : sintesi di proteine destinate a secrezione e vari organuli (golgi lisosomi, membrana pasmatica..) Modificazioni postraduzionali N-glicosilazione idrossilazione Formazione ponti S-S Aggiunta di glicolipidi

7 La glicosilazione avviene a livello di specifici aa, Nel RER avviene la N-glicosilazione

8 Il reticolo endoplasmatico liscio (REL o SER) Ha aspetto tubulare svolge molteplici funzioni Grazie a varietà dei enzimi inglobati nella sua membrana: sintetizza i lipidi (acidi grassi, fosfolipidi, steroidi) e quindi le membrane e gli ormoni steroidei; Detossifica: demolisce/modifica chimicamente tossine, farmaci e molecole estranee (es. antibiotici, pesticidi) nelle cellule del fegato (ossidasi citocromo P450); immagazzina e rilascia ioni calcio nelle cellule muscolari: importante per controllo della contrazione Metabolismo carboidrati (cell fegato)

9 REL Nella detossificazione dei farmaci e della biosintesi degli steroidi è utilizzata la IDROSSILAZIONE in cui è coinvolto il citocromo P-450: Un sistema di trasporto di e - li trasferisce da NADPH citocromo P 450 O 2 che viene attivato per l idrossilazione. Reazione finale: RH + NADPH + H + + O 2 ROH + NADP + + H 2 O Usato anche NADH come donatore di e -. - NADPH usato per detossificazione dei farmaci e sintesi steroidi - NADH nella idrossilazione degli ac. grassi - Gli enzimi sono le mono-ossigenasi

10 Esempio: Eliminazione dei barbiturici rapido incremento di enzimi nel REL. Effetto concomitante: negli abituali consumatori necessarie sempre + alte dosi per ottenere effetto sedativo. Le ossidasi per la detossif. idrossilano anche altri farmaci: antibiotici, anticoagulanti e steroidi l uso di barbiturici diminuisce l efficacia di molti altri farmaci clinicamente utili. Citrocromo P 448 è parte del complesso enzimatico chiamato IDROSSILASI degli IDROCARBURI AROMATICI i prodotti ossidati sono spesso + tossici dei composti originari. FUMO DI SIGARETTA: potente induttore dell idrossilasi degli idrocarburi aromatici.

11 Ruolo del REL nel catabolismo del glicogeno epatico E presente l enzima glucosio-6-fosfatasi. Il fegato mantiene costante il livello ematico del glucosio. L utilizzo del glicogeno epatico è mediato da ormoni camp attivazione di fosfoglucomutasi glicogeno fosforilasi glucosio-1-p glucosio-6-p Per attraversare la membrana il glucosio deve essere non P. La glucosio-6-fosfatasi è presente in fegato, reni e cellule intestinali. Assente in cell. muscolari e cervello che utilizzano il glucosio per attingere E.

12 Il REL serve anche per immagazzinare il Ca ++ mediante POMPE ATP dipendenti (cell. muscolari). che viene pompato in esso Il REL svolge un ruolo importante nella biosintesi delle membrane. La biosintesi è limitata ad un singolo strato: I siti attivi degli enzimi sono esposti verso il citosol e i lipidi di nuova sintesi vengono incorporati nel monostrato della m. che guarda verso il citosol. Allora deve esistere un meccanismo per trasferire i fosfolipidi da uno strato all altro della m. poiché la m. è a doppio strato FLIPPASI: traslocatori di fosfolipidi influenzano solo la velocità e non la specificità dipende da traslocatori disponibili ASIMMETRIA della m. Quando dalla membrana del RE si formano le vescicole e si fondono con altri organuli del sist. di endomembrane, le composizioni distinte degli strati citosolico e luminale stabilite nel RE vengono trasferite ad altre m. cellulari Eccezioni: I mitocondri importano dal REL la fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina e colesterolo delle mm. esterne e interne. Mentre la fosfatidiletalnolamina deriva dalla decarbossilazione della importata fosfatidilserina. Inoltre i perossisomi contribuiscono alla biosintesi di colesterolo e dolicolo delle m. epatiche

13 I mitocondri e cloroplasti non accrescono le m. grazie alla fusione delle m. del RE, ma grazie a Proteina scambiatrici di fosfolipidi che riconosce un sito specifico di fosfol., lo rimuove da una membrana e lo porta attraverso il citosol ad un altra. Le composizioni di altre m. cellulari dalla composizione della m. del RE. Il gradiente di colesterolo è correlato all di spessore della m. M. del RE = 5 nm m. dell epatocita 8 nm. Il cambiamento osservato nello spessore ha implicazioni nello smistamento e nell indirizzamento delle prot. integrali in cui ha la sua importanza il complesso di Golgi.

14 Lo sviluppo di REL e SER riflette il tipo di attività cellulare REL sviluppato in cellule di ghiandole che producono ormoni steroidei (es testicoli) o impegnate in detossificazione (fegato) e/o in soggetti che assumono farmaci cronicamente RER sviluppato in cellule di ghiandole che secernono enzimi o producono ormoni proteici

15 Cellule animali e vegetali dittiosomi Apparato di Golgi Collegato al RER Provvede a ulteriori modificazioni. RER Proteine e lipidi CIS Cisterne mediane Cisterne trans Situato Nei pressi del nucleo Cisterne Cis Cisterne Trans Vescicole (50-70 nm) per trasferimento da RER a cist. cis Golgi Fuoriescono picc. vescicole Si fondono in grandi e dense vescicole secrezione Maturazione Richiedono presenza prot. solubili

16 Apparato di Golgi Funzioni Completamento delle modific. alle glicoproteine e glicolipidi Glicosilazione De-glicosilazione Solfatazione Acetilazione Deaminazione Secrezione Merocrina (Solo secreto) Apocrina (citoplasma e secreto) Olocrina (Tutta la cellula)

17 COMPLESSO DI GOLGI Serie di cisterne appiattite: pila. Il numero e la grandezza delle pile del Golgi variano a seconda del tipo cellulare e dell attività metabolica della cellula. Molte vescicole coinvolte nel trasferimento di lipidi e proteine sono chiamate vescicole rivestite di prot. la cui composizione rispetto al ruolo. Il CGN e TGN e le cisterne mediane sono dal punto di vista biochimico e funzionale.

18 Due modelli descrivono il flusso di lipidi e delle proteine attraverso il Golgi: modello delle cisterne stazionarie: vescicole spola (sostanziale evidenza) modello di maturazione delle cisterne: le cisterne si trasformano l una nell altra. Probabilmente esistono entrambi i modelli a seconda del tipo cellulare! TRASPORTO : 1) ANTEROGRADO e 2) RETROGRADO 1) Movimento di materiale dal RE Golgi m. plasm. Tra i lipidi e le proteine trasportati ci sono molecole essenziali x impacchettamento e x indirizzare le vescicole alle loro destinazioni 2) La cellula ricicla lipidi e proteine non più necessari durante gli ultimi stadi del trasporto antegrado

19 Compartimentazione delle fasi della glicosilazione e della successiva modificazione delle proteine. Vedi figura successiva Ogni cisterna nella pila contiene un distinto set di enzimi! O- glicosilazione Glicosilazione terminale Enzimi anormali coinvolti nella glicosilazione sono stati implicati nella carcinogenesi!

20 Appena le glicoproteine escono dal complesso di Golgi possono contenere solo oligosaccaridi ad alto contenuto di MANNOSIO, solo complessi oligosaccaridici o entrambi. Enzimi presenti nel Complesso di Golgi glucano-sintetasi glicosil-transferasi (attaccano glucidi alle proteine)

21 Assemblaggio del core oligosaccaridico e suo trasferimento alla proteine FLIPPASI c: ad opera della oligosaccariltransferasi Tolte da glucosidasi Tolte da mannosidasi

22 Dopo la biosintesi, le proteine e i lipidi glicosilati sono rivolti verso l interno del RE e del Complesso di Golgi. Appena le vescicole gemmano da questi organuli e si fondono con altre m. cellulari l asimmetria stabilita durante la glicosilazione è trasferita alle altre membrane. Poiché il lato luminale della m. del RE è topologicamente equivalente alla superficie ext. della cellula tutte le glicoproteine della m. plasm. si trovano sul versante extracell. della m. Ruolo del RE e Golgi nello smistamento di ciascuna proteina. Una volta che una proteina raggiunge un organulo, ci deve essere un meccanismo che ne impedisce il suo allontanamento. Segnale: specifica sequenza di Aa catena laterale oligosaccaridica Dominio idrofobico Un altra caratteristica strutturale Il Complesso di Golgi è coinvolto anche nella maturazione di proteine che entrano nella cellula tramite endocitosi.

23 Traffico delle vescicole attraverso il sitema endomembranoso. *

24 * Proteine RE-specifiche contengono segnali di recupero (4). Inoltre le proteine che rimangono nel RER formano dei grossi complessi che sono fisicamente esclusi dalle vesc. di transizione gemmanti. Il trasporto retrogrado avviene grazie a brevi sequenze nelle prot.: KDEL ( Lys-Asp-Glu-Leu ). L acidità del lume del RE è più bassa della acidità del CGN Dissociazione delle prot. RE specifiche dai loro recettori ciò permette ai recettori di ritornare al Golgi per recuperare altre prot. del RE. Tutte le prot. del Golgi sono legate alla membrana. La lunghezza dei domini idrofobici può determinare in quale cisterna del Golgi la prot. si va a sistemare. la lunghezza dei domini idrofobici da CGN a TGN. Le prot. tendono a spostarsi da un compartimento all altro si bloccano quando lo spessore della membrana non supera la lungh. dei domini m. RE (5 nm) m. cell. (8 nm).

25 Indirizzamento degli enzimi lisosomali solubili agli endosomi e ai lisosomi grazie al segnale di mannosio-6-p. Alcuni enzimi lisosomali passano prima attraverso l endosoma precoce e poi arrivano al tardivo. fosfotransferasi Rivestite di clatrina ph 5,5 Endosoma precoce: siti per lo smistamento di molecole assunte nelle cell. eucariotiche tramite endocitosi e sono una sorgente di vescicole che portano materiale per la digestione agli endosomi tardivi. Endosoma tardivo: organulo contenente enzimi digestivi inattivi.

26 * Sequenze Aa le rendono riconoscibili. Secrezione regolata: in seguito a segnali. Secrezione costitutiva: intestino (muco) e glicoprot. della matr. extracell. Es: Insulina dalle cell. β delle isole del Langherans (pancreas). TGN vesc. secretorie immature perdono rivestimento di clatrina [ proteine maturazione proteolitica granuli di secrezione o di zimogeno. ] di

27 Riassunto distribuzione delle proteine Lisosomi Golgi Membr. nucleare RER Membr. plasmatica esocitosi Proteine del Trasp. Attivo e Passivo Recettori Complesso Magg. Istoc.

28 Ci sono sequenze Aa che rendono anche qui le prot. riconoscibili, inoltre alte [ ] di prot. di secrezione nei granuli secretori promuovono la formazione di grossi aggregati prot. che escludono le prot. NON secretorie.

29 Esocitosi ed Endocitosi Lo spostamento di vescicole è regolato dal citoscheletro Vescicole membranose Regolata da recettori di membrana Secrezione intermittente Secrezione costitutiva Es.: cell. epit. mucosa intestinale esocitosiche Membr. Trans Golgi Fusione con membr. plasm. e suo accrescim. Segnali all interno della cellula Regolata dalle annessine (prot. Ca-dipendenti) Secondi messaggeri: AMPc, Ca ++

30 ESOCITOSI. Diverse prot. sono esportate da cellule animali e vegetali tramite esocitosi. Le cellule animali secernono: ormoni peptidici muco prot. del latte enzimi digestivi. La secrezione polarizzata è limitata ad una superficie della cellula, es.: intestino cell. nervose (neurotrasmettitori).

31 Grossi aggregati molec.insolubili Es.: ( macrofagi; eucarioti monocell.: ameba, protozi ciliati; fibroblasti che rimodellano tess. connettivo) Esocitosi ed endocitosi Vescicole membranose Fagocitosi Pinocitosi Incorporaz. di liquido e molec. in esso contenute senza recettori (endocitosi clatrinaindip.) Endocitosiche Membr. plasm. invaginata Si perde un pezzo di membr. Endocitosi e pinocitosi mediata da recettori Il rivestimento delle fossette è formata dalla clatrina (trimero che s intreccia a formare canestri) Incorporazione: anticorpi ormoni vitamine

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33 ENDOCITOSI Attraverso l endocitosi e il trasporto retrogrado la cellula può riciclare molecole essenziali per l esocitosi, recuperando lipidi e proteine. Endocitosi clatrina indipendente (in fase fluida) non [ ] il materiale ingerito: ingloba fluidi materiale inviato a endosomi precoci.

34 FAGOCITOSI Come parte del loro ruolo immunitario i fagociti generano nel vacuolo fagocitico [ ] tossiche di perossido d idrogeno, ac. ipocloroso. La fagocitosi non concentra macromolecole, né è clatrina dipendente, al contrario dell endocitosi clatrinadipendente che serve ad internalizzare ormoni, fattori di crescita, enzimi, prot. del siero, anticorpi, ferro, e anche alcuni virus e tossine.

35 ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE Ci sono varianti a questo meccanismo: - EGF (fattori di crescita dell epidermide): i recettori dell EGF sono [ ] in fossette rivestite dopo la formazione dei complessi recettoreligando. - I recettori sono [ ] costitutivamente in fossette indipendentemente dal legame recettore-ligando. Perché ph. Trasporto v/s un altra regione (6): endosoma precoce: sito di smistamento e riciclaggio di mat. Extracell.

36 Endocitosi mediata da recettore, della proteina del tuorlo in un oocita del pollo.

37 Le vescicole rivestite da clatrina sono circondate da reticolo composti da clatrina e da una proteina adattatrice (AP) che promuove l assemblaggio in reticoli esagonali e pentagonali. Le cellule eucariotiche contengono complessi AP ciascuno con 4 polipeptidi: 2 sub. di ADAPTINA + 1 catena media e 1 catena piccola. I 4 polipept. a seconda del complesso, legano specifici recettori specificità durante la gemmazione.

38 La capacità dei complessi AP di legarsi alla clatrina è influenzata dal ph, fosforilaz. e defosforilazione. Comunque grazie ad AP molecole appropriate saranno legate e [ ] in fossette rivestite.

39 L ipotesi SNARE connette le vescicole rivestite e le membrane bersaglio. Bisogna trovare la membrana appropriata con cui fondersi. Le GTPasi Rab sono e sono specifiche per membrana

40 Compl.di Golgi Lisosomi (Contengono enzimi idrolitici, circa 40, attivi a ph acido) Degradano macromolecole carboidrati (glicosidasi) Proteine (peptidasi) Lisosomi Pompa protonica ATP dip. Che innalza la H + Produzione piccole molecole pronte per essere utilizzate Ac. nucleici (Desossiribonucleasi, ribon., fosfatasi) 4 Tipi: 1 primario 3 secondari 1) Lisosoma primario: Gemma dalle cisterne trans del Golgi Piccole dimens. contiene l uno o l altro degli enzimi che si sommeranno nei lisosomi secondari. 2) Eterofagosoma o vacuolo digerente Plurienzimatico Materiale extracell. (fagocitosi ed endocitosi) 3) Corpi residui Digestione materiale extracell. Se incompleta Gravi disturbi 4) Autofagosoma Frammenti organelli cell., mitocondri, RE Digiuno prolungato Cell.epatiche autofagosoma

41 LISOSOMI - Originano da endosomi tardivi. - Immagazzinamento delle idrolasi per proteine carboidrati grassi. Le idrolasi sono sintetizzate sul RER e sono trasportate all apparato di Golgi dove viene aggiunta una molecola di MANNOSIO-6-P per marcarli come enzimi dei lisosomi e quindi trasportati in Endosomi tardivi. Perché un processo di digestione abbia inizio, un endosoma tardivo deve incontrarsi e fondersi con vescicole che trasportano il materiale destinato alla digestione. L endosoma tardivo evolve quindi in modo da formare un lisosoma. ph dell endosoma tardivo: 5,5. ph del lisosoma: 4,5 si attivano le idrolasi acide e si favorisce la parziale denaturazione del materiale destinato alla degradazione.

42 Localizzazione citochimica della fosfatasi acida, enzima lisosomiale.

43 La formazione dei lisosomi e il loro ruolo nei processi di digestione. Lisosoma eterofagico: contiene materiale extracell. Lisosoma autofagico: materiale intracell. AUTOFAGIA: originale sistema di riciclaggio Macrofagia: organulo avvolto da doppia membrana di derivazione del RE. (Es.: enzimi lisosomiali dello spermatozoo; digestione extracell.) Microfagia: vacuolo autofagico + piccolo. 1 solo doppio strato membranoso.

44 Importanti evoluz.: O 2 tossico per azione ossidante e formazione H 2 O 2 Perossisomi IN: Cellule animali, piante, funghi, protozoi, alghe Enzimi Ossidasi (formano H 2 O 2 ) Catalasi (diffondono nel cit, degradano H 2 O 2 ) Uricasi (degr. ac. Urico che deriva dal catab. basi puriniche) Hanno svariate funzioni a seconda del tipo di cellule, ma comunque hanno la proprietà comune di GENERARE e DECOMPORRE H 2 O 2. H 2 O 2 tossica per la cellula, ma essere decomposta in acqua e ossigeno dalla CATALASI. Perossisomi degli animali possono avere altre svariate funzioni: detossificazione da altri composti (metanolo, etanolo, formiato, formaldeide) catabolismo di sostanze non comuni (D-Aa) degradazione ossidativa di ac. grassi a 22 atomi di C fino a C ( poi mitocondri)

45 BIOGENESI DEI PEROSSISOMI. I perossisomi non gemmano dal Golgi, ma si formano da perossisomi pre-esistenti. Il segnale che indirizza almeno alcune prot. al perossisoma è costituito da 3 Aa: Serina-lisina-leucina

46 Bande sovrapposte La scoperta dei perossisomi è dipesa dall utilizzo della centrifugazione all equilibrio di densità. Trattando il ratto con detergente i lisosomi variano la loro densità di galleggiamento riuscendo quindi a discriminare meglio il picco dei perossisomi.