- AXXAM Spa Milano - DOMPÈ PHA.R.MA Spa L Aquila - ISTITUTO CLINICO HUMANITAS Spa Rozzano (MI) - BIOXELL Spa Milano

Transcript

1 SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI AXXAM - AXXAM Spa Milano - DOMPÈ PHA.R.MA Spa L Aquila - ISTITUTO CLINICO HUMANITAS Spa Rozzano (MI) - BIOXELL Spa Milano ID69/2005 PROGETTO R&S Piattaforma integrata per la identificazione e caratterizzazione di recettori di chemiochine. AREA MD BIOTECNOLOGIE NON ALIMENTARI DURATA 30 MESI QUADRO ECONOMICO PREVISIONE INIZIALE ,00 COSTO FINALE ,22 INTERVENTO FINANZIARIO EROGATO ,00 DESCRIZIONE Il progetto aveva come obiettivo principale la costruzione di una piattaforma integrata per l identificazione, lo studio e lo sviluppo di nuovi farmaci capaci di interferire con recettori per chemochine, potenzialmente utilizzabili dal punto di vista terapeutico nel trattamento di patologie infiammatorie acute e croniche autoimmuni. Per il raggiungimento degli obiettivi i partecipanti hanno messo in comune competenze e tecnologie specifiche creando un network altamente qualificato e competitivo. Tutti i partecipanti al network hanno ampiamente dimostrato la capacità di valorizzare i risultati della ricerca in termini di proprietà intellettuale e ricaduta industriale. L integrazione delle competenze ha permesso, nell ambito della piattaforma, di affrontare le diverse fasi della ricerca farmacologica nel campo delle chemochine,

2 quali l identificazione e la valutazione di nuovi bersagli recettoriali, il disegno e la sintesi di nuove classi chimiche di inibitori, lo screening e l eventuale successiva validazione farmacologica e clinica di molecole selezionate. La ricerca è stata articolata in tre linee: LINEA 1: Ottimizzazione di inibitori allosterici dei recettori chemochinici CXCR1 e CXCR2. LINEA 2: Identificazione e caratterizzazione di una nuova classe di inibitori dell attività biologica del recettore delle chemochine CXCR3. LINEA 3: Studio di nuovi target recettoriali nel sistema chemochine. La Linea 1 si proponeva come obiettivo specifico l ottimizzazione di inibitori allosterici dei recettori CXCR1 e CXCR2 a partire dai risultati farmacologici ottenuti con Reparixin, il primo inibitore della classe in fase di sviluppo clinico. Il risultato atteso era l identificazione di un nuovo candidato con caratteristiche farmaco-tossicologiche idonee al trattamento di patologie infiammatorie croniche. Per il conseguimento di queste attività sono stati condotti studi di chimica medicinale, farmacocinetica e tossicologia. Sono stati in parallelo effettuati screening di ampie collezioni di composti, in scala HTS (High Throughpout Screening), su adeguati modelli cellulari. Inoltre, una parte importante delle attività è stata dedicata all approfondimento della comprensione dei meccanismi della regolazione allosterica, per la validazione di un approccio generale al disegno razionale di nuovi modulatori di recettori di chemochine. La Linea 2 si proponeva come obiettivo specifico l identificazione e la caratterizzazione di una nuova classe di inibitori dell attività biologica del recettore CXCR3. Il risultato atteso era l identificazione di un lead compound idoneo alla valutazione in modelli animali di patologie autoimmuni. Per conseguire tale obiettivo sono stati sviluppati e validati test cellulari funzionali specifici idonei all utilizzo in scala HTS (High Throughpout Screening). Inoltre sono stati valutati nei modelli animali inibitori della produzione di fattori chemiotattici come un possibile approccio terapeutico alternativo. La Linea 3 si proponeva come finalità lo studio di nuovi target recettoriali (omologhi di recettori di chemochine) e, in particolare di recettori orfani (HCR/LCCR) o a funzione scavenger (D6). Per il conseguimento di questo importante risultato sono stati condotti studi per la definizione del profilo di espressione in vivo, la generazione di anticorpi monoclonali anti-hcr e la generazione di topi geneticamente modificati difettivi per l espressione di LCCR (ortologo murino di HCR). RISULTATI PROGETTO Linea 1: Ottimizzazione di inibitori allosterici dei recettori chemochinici CXCR1 e CXCR2. A partire dai dati di attività biologica ottenuti con le molecole della targeted library, sono stateprogrammate le attività per l espansione della libreria per l inizio della fase hit-to-lead.

3 Binding di un inibitore duale con CXCR1 (A) e CXCR2 (B) E stato selezionato DF 2755A, inibitore duale di CXCR1 e CXCR2, con buona PD. E stata condotta una prima fase di scale up della sintesi del DF 2755A per la caratterizzazione preclinica della molecola. E stata valutata l efficacia della molecola in modelli sperimentali di artrite reumatoide. Il profilo PK giustifica la scarsa efficacia osservata. DF 2755A è stato valutato in altre patologie in cui è chiaro il ruolo di CXCR1 e CXCR2, ed è stato selezionato per ulteriore caratterizzazione farmacologica in patologie, quali BP e IR, per le quali il profilo PK del composto sembra più adeguato. La molecola DF 2755A è stata caratterizzata sia dal punto di vista del profilo farmacocinetico nel ratto e nel topo, sia dal punto di vista del profilo di safety: a questo riguardo sono state determinate le concentrazioni alle quali si osservano modifiche nei parametri ematologici o eventi avversi importanti. Inoltre sono stati condotti i primi studi per determinare il potenziale carcinogenico (test di Ames) e l effetto della molecola sui canali del potassio (herg test). Sono stati valutati gli effetti di inibitori allosterici non competitivi di recettori per chemochine su migrazione cellulare (in esperimenti di transwell) e sull attivazione recettore-mediata di flussi di calcio intracellulari (in fluorimetria). Lo studio degli effetti di inibitori allosterici non competitivi su trasfettanti cellulari in esperimenti di migrazione cellulare in transwell ha permesso di dimostrare la potenza, efficacia e selettività d azione di queste molecole. Gli inibitori allosterici sono risultati in grado di bloccare il 90% della migrazione cellulare indotta da dosi ottimali del chemiotattico a concentrazioni di 1 μm, con una IC50 nel basso nm. A queste concentrazioni gli inibitori testati si sono dimostrati specifici, con un inibizione di migrazione indotta da chemochine scorrelate sui rispettivi trasfettanti cellulari inferiori al 10%. Sono stati valutati gli effetti di inibitori allosterici non competitivi sulle proprietà di cycling di recettori per chemochine mediante esperimenti di citometria a flusso e di valutazione di associazione recettoriale ad arrestina in esperimenti di microscopia confocale utilizzando molecole chimerizzate a proteine fluorescenti generate in laboratorio. Gli studi in citometria a flusso di internalizzazione e recycling recettoriale in L1.2 trasfettate con i rispettivi recettori hanno messo in evidenza come questi aspetti funzionali del recettore siano del tutto insensibili al blocco da inibitori allosterici non competitivi. Risultati analoghi sono stati ottenuti in trasfettanti CHO-k1 e in granulociti polimorfo nucleati.

4 Al fine di indagare quali meccanismi molecolari associati a tali funzioni sfuggono all inibizione mediata da inibitori allosterici non competitivi, in microscopia confocale è stata indagata l associazione recettoriale con arrestina, la prima tappa agonista-dipendente nota associata all attivazione del processo di internalizzazione recettoriale. Anche questo passaggio di attivazione risulta insensibile al trattamento con dosi efficaci in esperimenti di chemiotassi. Questi risultati suggeriscono che questa nuova classe di molecole agisce bloccando selettivamente un pathway di trasduzione (verosimilmente G-protein dipendente) e lasciando invece inalterate alcune vie di segnalazione. Inibitori allosterici non competitivi non modificano le proprietà di cycling recettoriale, né l associazione recettoriale con arrestina. Sono state generate due linee cellulari che esprimono in modo funzionale rispettivamente il recettore CXCR1 e il recettore CXCR2. Queste linee si sono dimostrate idonee per un loroutilizzo in una piattaforma di HTS, per l identificazione di specifici antagonisti dei due recettori. E stato effettuato lo screening di molecole chimiche sui saggi configurati. In particolare è stata testata una libreria, fornita da Dompé, contenente circa molecole di sintesi, sul saggio esprimente il recettore CXCR2. Lo screening è stato eseguito al FLIPRTETRA leggendo appunto un segnale di luminescenza. Schema di una cellula contenente il gene reporter Photina (sinistra) e delle stesse cellule stimolate con una molecola attiva e inducente il rilascio di luce (destra) misurabile con FLIPRTETRA.

5 Dalla campagna di screening sono stati identificati composti selettivamente attivi su CXCR2. In conformità a questi risultati sono state fornite da Dompé più di 250 nuove molecole, ritestate in dose risposta nuovamente su CXCR2. Solo alcune di esse si sono mostrate idonee, ma con una percentuale d inibizione superiore al 20%. Lo screening ha permesso di identificare delle molecole attive sui recettori, in particolare sul CXCR2. Esse possono rappresentare capostipiti e punti di partenza per la sintesi di nuovi composti, che mostrino maggiore potenza e selettività nei confronti del recettore d interesse. LINEA 2: Identificazione e caratterizzazione di una nuova classe di inibitori dell attività biologica del recettore delle chemochine CXCR3. Linfociti T sono stati purificati dal liquido sinoviale e dal sangue periferico di pazienti affetti da artrite reumatoide. Le quantità di cellule isolate e di RNA totale purificato si sono rivelate sufficienti a permettere l analisi dell espressione di vari recettori e geni tra cui il recettore CXCR3. Le cellule T purificate dal liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide e artrite idiopatica giovanile hanno evidenziato un espressione di mrna del gene CXCR3 più elevata rispetto alle cellule T purificate dal sangue periferico degli stessi soggetti. L analisi dell espressione del recettore CXCR3 di membrana su singola cellula mediante analisi di citometria a flusso ha confermato la maggiore espressione del recettore CXCR3 evidenziando un aumento della frazione delle cellule T CXCR3+ nel liquido sinoviale e un aumento della espressione mediana del recettore. Tali risultati hanno sostanzialmente validato il recettore CXCR3 in qualità di potenziale bersaglio farmacologico la cui inibizione sia potenzialmente in grado di impedire il reclutamento dei linfociti T di fenotipo Th1 nella sede articolare di malattia. Sono state ottenute linee cellulari esprimenti diversi livelli di recettore CXCR3 di origine umana o murina. È stata verificata la capacità di tali linee cellulari di manifestare chemiotassi in risposta a gradienti di varia intensità di chemochine CXCL9, CXCL10 e CXCL11 in grado di legare il recettore CXCR3. Sono stati selezionati quei cloni che esibivano una più alta espressione del recettore ed una migliore risposta chemotattica al gradiente di concentrazione di ligando. Sono inoltre stati selezionati i cloni che esibivano una bassa migrazione spontanea e una ridotta risposta chemocinetica ai ligandi di CXCR3. Si è infine verificato che le linee selezionate CXCR3+ mantenessero un fenotipo di espressione ed una risposta chemotattica stabile nel tempo a tutti ligandi noti del recettore CXCR3. Sono stati condotti una serie di studi di ottimizzazione delle condizioni del saggio di migrazione delle cellule trasfettate con CXCR3 in piastre di chemiotassi da 96 pozzetti. Sono state di volta in volta modificati i parametri di volume, concentrazione cellulare, concentrazione del ligando chemiotattico, tempo di incubazione del saggio e metodica di quantificazione della migrazione cellulare. L obiettivo di questa fase è stato quello di ottenere un saggio altamente riproducibile, con la sufficiente accuratezza e precisione. Attraverso gli sforzi effettuati in questa fase è stato possibile ottenere un saggio di migrazione automatizzato ad alta portata con un coefficiente di variazione intra-saggio di <10% e un coefficiente di variazione inter-saggio di <20%.

6 Saggio di chemiotassi robotizzato Attraverso la collaborazione con Hoffmann-La Roche, oltre cinquecentomila molecole a basso peso molecolare sono state saggiate per attività inibitoria nei confronti del recettore CXCR3. Questa attività ha portato all identificazione di alcune serie di composti dotati di una significativa attività inibitoria del recettore CXCR3. Composti rappresentativi delle serie selezionate sono stati trasferiti a Bioxell e l attività inibitoria è stata ulteriormente verificata attraverso l impiego di cellule Th1 o Th2 ottenute mediante coltura in vitro di linfociti T umani ottenuti dal sangue periferico di donatori sani. La migrazione delle cellule Th1 indotta da chemochine leganti il recettore CXCR3 veniva inibita in maniera dose dipendente mentre la migrazione delle stesse cellule Th1 o delle cellule Th2 indotta in risposta a chemochine leganti altri recettori quali CCR1, CCR3, CCR4, CCR7, CXCR4 non veniva inibita in maniera significativa. E stato effettuato lo screening di molecole chimiche sul saggio configurato per CXCR3. In particolare è stata testata una libreria, fornita da Dompé, contenete circa molecole di sintesi. Pochissime molecole della libreria Dompé si sono comportate come veri inibitori del recettore, senza cioè mostrare alcuna attività sulla linea reporter. In particolare: solamente un composto ritestato in dose risposta, ha mostrato un attività superiore al 40% con una IC50 inferiore a 10μM, e 3 ulteriori composti un attività superiore al 15% con un IC50 inferiore a 10μM. LINEA 3: Studio di nuovi target recettoriali nel sistema chemochine Nonostante una omologia di sequenza molto elevata con recettori segnalanti, il recettore scavenger D6 è in grado di legare specificamente e ad alta affinità la gran parte di chemochine CC infiammatorie, ma non media alcuna apparente forma di trasduzione del segnale. Tale recettore D6 è stato studiato nelle sue proprietà biologiche e basi molecolari: questo ha consentito di identificare alcuni determinanti strutturali del recettore associati alla funzione di degradazione del ligando, particolarmente efficiente per questa classe di recettori. Questi risultati aprono una interessante finestra farmacologica, rappresentata dalla possibilità di utilizzare inibitori allosterici non competitivi per abolire l attività di reclutamento cellulare preservando la funzione di degradazione del ligando, correlata alle capacità di traffico del recettore.

7 HCR/LCCR è un recettore orfano, putativo recettore per chemochine sulla base dell omologia di sequenza. Tuttavia la presenza in alcuni domini di sequenze non compatibili con il signalling ne ha fatto ipotizzare una funzione scavenger. Nel corso di questo progetto sono state conseguite informazioni funzionali e alcuni tool di laboratorio di particolare rilevanza (anticorpi monoclonali, topi geneticamente modificati) relativi a questo recettore. I dati in topi LCCR-/- indicano che questo recettore svolge un ruolo non ridondante in alcuni modelli di patologia sperimentale, identificando questa molecola quale nuovo target molecolare di potenziale rilevanza farmacologica. LE ATTIVITÀ SEGUITE IN QUESTO PROGETTO HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DI SAGGI CON TECNOLOGIE ALL AVANGUARDIA, IN GRADO DI VELOCIZZARE PROCESSI DI SCREENING E QUINDI DI IDENTIFICAZIONE DI MOLECOLE O CLASSI MOLECOLARI, LE CUI STRUTTURE RAPPRESENTANO IL PUNTO DI PARTENZA DI NUOVE OTTIMIZZAZIONI CHIMICHE, AL FINE DI SVILUPPARE NUOVI, PIÙ EFFICACI E SELETTIVI POTENZIALI FARMACI.