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1 Istruzioni per l Uso HistamineRelease Componenti per la determianzione diagnostica quantitativa in vitro del rilascio d istamina nel sangue eparinizzato. Questo prodotto dev essere usato solo con IBL Histamine ELISA (REF RE59221). RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 HistamineRelease (RE95000) 1. USO PREVISTO Componenti per la determianzione diagnostica quantitativa in vitro del rilascio di istamina nel sangue eparinizzato. Questo prodotto dev essere usato solo con IBL Histamine ELISA (REF RE59221). 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Negli esseri umani l istamina (ßimidazolo etilamina) è il principale mediatore e si riscontra prevalentemente nella fase iniziale di una reazione anafilattica (reazione allergica di "tipo immediato ). L istamina è biosintetizzata dalla decarbossilazione enzimatica dell amminoacido istidina. Nell organismo l istamina è presente in quasi tutti i tessuti ed è immagazzinata principalmente nei granuli metacromatici dei mastociti e nei granulociti basofili. L istamina è presente in forma legata e inattiva e viene rilasciata solo se richiesta. Per la determinazione dell istamina è d interesse clinico la quantificazione del rilascio d istamina dai granulociti basofili nei casi di reazioni allergiche di tipo immediato, oltre che la determinazione della quantità d istamina presente nei fluidi corporei (plasma, urina, supernatanti di colture cellulari), conseguenti alla somministrazione di allergeni. Il primo contatto dell organismo con un allergene non causa l inizio del rilascio d istamina. Prima sono prodotti gli anticorpi specifici IgE, che migrano nei mastociti dove si legano ai recettori. Al secondo contatto con l allergene la trasformazione di una cellula B in una cellula plasmatica non è più richiesta. L allergene si dirige verso gli anticorpi IgE già legati al mastocito e si lega a questi. Il mastocita risponde con la secrezione d istamina dai suoi granuli. 3. PRINCIPIO DEL TEST I campioni di sangue eparinizzato vengono incubati con diverse concentrazioni di allergene sospetto. Il rilascio di istamina avverà dopo la stimolazione dei granulociti basofili a dipendenza della loro sensibilità per l allergene. In seguito l istamina rilasciata nel supernatante viene determinata utilizzando un saggio immunologico specifico per il plasma, l Histamine ELISA (REF RE59221) comprato insieme a questo kit. Questo valore di istamina è correlato al controllo 100% (=Istamina totale) e al valore del vuoto (=Rilascio spontaneo). La determinazione del rilascio di istamina in vitro rappresenta un metodo sensibile e specifico così come un idonea aggiunta alle procedure diagnostiche di routine, inclusi i tradizionali test su pelle e i test Radio Allergo Sorbent (RAST) per la determinazione degli anticorpi specifici IgE nel siero di pazienti atopici. Inoltre questo test rivela anche la capacità di rilascio delle cellule. La rivelazione diretta di sostanze mediatrici come l istamina durante una reazione allergica non è solo di interesse scientifico ma anche di significato pratico in relazione alla terapia specifica antiagonistica. Questo test è anche particolarmente adatto per le analisi delle risposte patofisiologiche a medicamenti, prodotti chimici e altri composti che non sono stati valutati per gli effetti collaterali. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico invitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. Version / 6

3 HistamineRelease (RE95000) 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 28 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. L informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Sangue Eparinizzato 24 h prima dell estrazione dei campioni di sangue il paziente deve evitare di prendere qualsiasi medicamento che causa allergia, qualsiasi antiistaminico, corticosteroide orale, e sostanze che bloccano i recettori H 2. Il rilascio d istamina è condotto con sangue eparinizzato. Si devono osservare le precauzioni usuali per le punture venose. È importante preservare l integrità chimica dei campioni di sangue dal momento in cui sono raccolti fino al momento in cui sono analizzati. I campioni devono essere mischiati con cautela immediatamente dopo la raccolta. Calcolo dei volumi dei campioni per l ELISA per l Istamina: 50 µl per il contenuto d istamina totale per il rilascio spontaneo per il controllo positivo anti IgE per ciascuna concentrazione di allergene Esempio: Per un test con 2 allergeni con 5 concentrazioni ciascuno, serviranno 2.45 ml di sangue. Conservazione: Stabilità: 1825 C 24 h 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x RELEASEBUF 1 x ANTI IGE 1 x 20 ml HYPOMED Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Non raffeddare. I leucociti coagulano a 28 C. Tampone di Rilascio liofilizzato Acido piperazinedietansulfonico in soluzione tampone con 0.01 % thimerosal. AntiIgE liofilizzato IgE antiumano. Anticorpi policlonale da pecora. Terreno ipotonico Pronto/a all uso. Soluzione salina 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Oltre al materiale richiesto per il saggio ELISA per l Istamina sono necessari i seguenti materiali: 1. Provette in vetro (12 x 75 mm) 2. Centrifuga; 700 x g 3. Bagno termostatato ad acqua, 37 C 4. Bagno ghiacciato 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (1825 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. La forza di centrifugazione relativa (g) non è equivalente ai giri per minuto (rpm) ma deve essere calcolata sulla base del raggio della centrifuga. Version / 6

4 HistamineRelease (RE95000) 10. ISTRUZIONI PRETEST Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati Diluire / dissolvere Componente con Diluente Note Conservazione Stabilità RELEASEBUF 20 ml acqua bidist. ANTI IGE 2 ml RELEASEBUF (ricostituito) Lasciare a riposo per 15 min. 28 C 3 giorni Mescolare senza formare schiuma. 20 C 1 mesi Lasciare a riposo per 15 min. 28 C 3 giorni Mescolare senza formare schiuma. 20 C 1 mesi Preparazione degli Allergeni Preparare diverse diluizioni multiple di 10 (p.e. da 10 1 a 10 5 ) usando una soluzione allergene stock di 1 mg/ml (p.e. soluzione stock in 0.9% NaCl o Tampone PBS) = 30 µl scorta di soluzione di allergene (1 mg/ml) µl Tampone di Rilascio 10 2 = 30 µl 10 1 Diluizione µl Tampone di Rilascio 10 3 = 30 µl 10 2 Diluizione µl Tampone di Rilascio 10 4 = 30 µl 10 3 Diluizione µl Tampone di Rilascio 10 5 = 30 µl 10 4 Diluizione µl Tampone di Rilascio 11. PROCEDURA DEL TEST Reazione del Sangue con Diluizioni dell Allergene (in provette di vetro) 1. Contrassegnare le provette di vetro secondo lo schema seguente per ogni allergene e ogni campione dei pazienti. Pipettare l antiige, la diluizione dell allergene, il sangue e il tampone di rilascio nelle rispettive provette seguendo lo schema. Scuotere i campioni di sangue gentilmente prima di pipettare. Provetta AntiIgE Diluizione dell Allergene etc. Sangue Tampone di Rilascio Rilascio Spontaneo Controllo Positivo 2. Mischiare le provette con cautela, evitando la formazione di gocce sulle pareti della provetta. 3. Incubare per 60 min a 37 C in un bagno d acqua. 4. Fermare il rilascio incubando per 10 min in un bagno di ghiaccio. 5. Centrifugare per 10 min a 700 x g. 6. Rimuovere 100 µl del supernatante limpido per il passaggio di acilazione dell ELISA per l Istamina. Evitare di rimuovere cellule dal pellet Istamina Totale Per il rilascio dell istamina totale dai leucociti. 1. Pipettare 50 µl di ogni campione di sangue eparinizzato in provette di vetro. 2. Pipettare 950 µl di Soluzione Ipotonica in ogni provetta. 3. Incubare per 60 min a 37 C in un bagno d acqua. 4. Mescolare sul Vortex mixer. Rimuovere 100 µl per il passaggio di acilazione dell ELISA per l Istamina. Version / 6

5 HistamineRelease (RE95000) Conservazione dei Campioni I supernatanti dei rispettivi campioni possono essere conservati a 28 C per un giorno. Per una conservazione più lunga di una settimana congelarli a 20 C. Evitare di congelarli e scongelarli ripetutamente Acilazione per l ELISA (in provette di vetro) Usare gli Standard del Plasma per il sangue. Usare gli Standard U/C per i supernatanti privi di siero delle colture cellulari. Per rivelare qualsiasi influenza nella preparazione dell allergene, una o più diluizioni dell allergene devono essere utilizzate nel saggio come controllo supplementare dell allergene. L acilazione è effettuata secondo lo schema seguente. Standard del Plasma (per sangue) Supernatante di Rilascio e Istamina totale Diluizione dell Allergene Controllo del Plasma 1+2 (del ELISA) Standards 50 µl Supernatante di rilascio e Istamina totale 100 µl Diluizione dell Allergene 50 µl Controlli del Kit 50 µl Tampone di Rilascio 50 µl 50 µl 50 µl Tampone Indicatore 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Mescolare sul Vortex mixer. Reagente di Acilazione 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl Mescolare sul Vortex mixer. Incubare per 30 min a TA (1825 C). Soluzione Tampone 0.75 ml 0.75 ml 0.75 ml 0.75 ml Mescolare sul Vortex mixer ELISA per l Istamina Effettuare l ELISA per l Istamina seguendo il capitolo PROCEDURA DEL TEST delle istruzioni dell Histamin ELISA (REF RE59221). 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati sono validi solo se si sono seguite le istruzioni d uso del test. L utilizzatore deve attenersi alle Buone Regole di Procedura di Laboratorio (Good Laboratory Practice) o ad altri standard/regolamenti applicabili. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. Version / 6

6 HistamineRelease (RE95000) 13. CALCOLO DEI RISULTATI A causa del fattore di diluizione di 1:2 per gli standard, la concentrazione di istamina dei campioni sconosciuti (rilascio spontaneo, controllo positivo, supernatante di rilascio, controllo dell allergene) può essere letto direttamente dalla curva di riferimento. Per l istamina totale il valore dev essere corretto moltiplicandolo per 10 (a causa della diluizione di 20 volte durante il rilascio di istamina). Il risultato del rilascio spontaneo dev essere sottratto dai campioni sconosciuti e dall istamina totale. Calcolare la percentuale di ogni campione, stimando il contenuto d istamina totale come 100 %. Fare un grafico della percentuale di rilascio verso la concentrazione di allergene su carta semilogaritmica. Il grado di sensibilizzazione cellulare (HR50) è definito dalla concentrazione di allergene che causa un rilascio di istamina pari al 50 % dell istamina totale. Se il rilascio è minore del 50 %, si può usare l HR30 (concentrazione di allergene che causa un rilascio del 30 % dell istamina totale). Un esempio tipico di un esperimento di rilascio d istamina è descritto qui sotto. Risultati Tipici di un Esperimento di Rilascio d Istamina Conversione: Istamina (ng/ml) x = nmol/l 14. VALORI ATTESI I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori: Istamina totale nel sangue <59 ng/ml (nel sangue EDTA intero dopo lisi con una sostanza ipotonica quando si misura solo l'istamina totale, ma non Rilascio indotto da un allergene) Rilascio Spontaneo Questo valore dovrebbe essere < 5 % del contenuto totale d istamina. Valori più elevati indicano un danno alle cellule. Persone non allergiche hanno un rilascio spontaneo di 12 ng/ml. Controllo Positivo Questo valore dovrebbe essere > 5 % del contenuto totale d istamina. Rilascio indotto da un Antigene Qualsiasi segnale positivo maggiore del 5 % di rilascio (dopo aver sottratto il valore del rilascio spontaneo) deve essere considerato come positivo specifico di un allergene. Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento. Version / 6

7 HistamineRelease (RE95000) 15. LIMITI DELLA PROCEDURA La raccolta dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli. 16. PERFORMANCE Vedere le istruzioni per l'uso del test Histamine ELISA (REF RE59221). 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Carlos D. Infection and Immunity (2009) Histamine plays an essential regulatory role in lung inflammation and protective immunity in the acute phase of Mycobacterium tuberculosis infection 2. Patou J. J Allergy Clin Immunol (2007) Staphylococcus aureus enterotoxin B, protein A, and lipoteichoic acid stimulations in nasal polyps. 3. Clejan, S., J. Cell. Mol. Med. (2002) Blood histamine is associated with coronary artery disease, cardiac events and severity of inflammation and atherosclerosis. 4. Crockard, AD., Clinical and Experimental Allergy (2001) Basophile histamine release tests in the diagnosis of allergy and asthma. Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθµόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International B.V. Zutphenseweg 55, 7418 AH Deventer, The Netherlands IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: 11 WEB: Tel.: + 49 (0) Fax: 11 WEB: Tel.: +1 (416) Fax: WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /

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