Evidenze e benefici dell analisi clinica di routine in LC-MS/MS

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1 Evidenze e benefici dell analisi clinica di routine in LC-MS/MS Immunosoppressori in sangue intero 25-OH vitamina D3/D2 in plasma/siero Steroidi in plasma/siero/dbs Dr. Donzelli Simone Regional Development Specialist Clinical Waters 2013 Waters Corporation 1

2 Indice: Immunosoppressori Studio del TDM L importanza del TDM degli immunosoppressori Tecniche a confronto Vitamina D3 Perchè la misura della 25-OH Vitamina D3 L importanza della 25-OH Vitamina D2 Tecniche a confronto Stato dell arte Steroidi Tecniche a confronto Analisi del profilo steroideo (valutazione kit CE-IVD) Applicazioni su siero e DBS del CAH (Congenital Adrenal Hyperplasia) 2013 Waters Corporation 2

3 2013 Waters Corporation 3

4 Immunosoppressori e l importanza del Therapeutic Drug Monitoring 2013 Waters Corporation 4

5 Cos è il therapeutic drug monitoring? Il Therapeutic Drug Monitoring (TDM) è un settore della chimica clinica che si specializza nella misurazione di livelli di farmaci nel sangue. Il suo principale obiettivo è focalizzato sui farmaci con un piccolo margine terapeutico: farmaci che facilmente possono essere sotto o sovradosati. D. Holt I clinici useranno la misurazione della concentrazione del farmaco insieme alle loro osservazioni ed agli altri risultati di altri tests per modificare il dosaggio del farmaco per ottenere il risultato migliore possibile per ogni paziente. Questa individualizzazione della terapia usando tutte le informazioni possibili è conosciuta come Therapeutic Drug Management Waters Corporation 5

6 Sub-therapeutic Sub-therapeutic Therapeutic Perchè il TDM è necessario? La maggior parte dei farmaci terapeutici possono anche avere effetti di tossicità Ibuprofene Se l optimum del range terapeutico è vicino alla tossicità Therapeutic Toxic Toxic il dosaggio deve essere controllato accuratamente TDM Concentration 2013 Waters Corporation 6

7 TDM degli immunosoppressori Il TDM per i farmaci anti-rigetto è una strategia per la quale il regime di dosaggio per un paziente è controllato da ripetute misurazioni della concentrazione del farmaco nel sangue. Fattori critici che possono aiutare a definire un indice terapeutico: Età, sesso, peso del paziente Dosaggio del farmaco Farmacocinetica Co-medicazioni Metodiche usate dal laboratorio per misurare i farmaci 2013 Waters Corporation 7

8 Variabilità inter-individuale A seconda del paziente ci possono quindi essere anche grandi differenze inter-individuali nella farmacocinetica e farmacodinamica. Una terapia opportuna dipenderà appunto dall individualizzazione del trattamento Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient Waters Corporation 8

9 Perchè TDM per gli immunosuppressori? Il range terapeutico è piccolo per cui il dosaggio deve essere controllato in modo opportuno; L individualizzazione del trattamento dovuta alle ampie differenze inter-paziente in PK/PD richiede un accurato TDM; In alcuni casi il TDM viene utilizzato anche per assicurarsi che i pazienti stiano prendendo le dosi prescritte del farmaco (compliance del paziente) Waters Corporation 9

10 Tecniche di analisi Immunoassay (automatizzato / semi-automatizzato) HPLC con rivelazione a UV / Fluorescenza LC-MS/MS 2013 Waters Corporation 10

11 Piattaforme di analisi del tacrolimous in US 2010 Waters 58% AB Sciex 30% Thermo Fisher 8% Agilent 4% LC-MS/MS 29% Abbott Architet 44% Altre Piattaforme IA 5% Siemens Dimension 22% 2013 Waters Corporation 11

12 Numero di risultati riportati Crescita della tecnica di LC-MS/MS per il monitoraggio degli immunosuppressori LC-MS/MS Total Imx Emit 2000 ACMIA CMIA HPLC MS 50 0 Set 99 Mar 00 Set 00 Mar 01 Set 01 Mar 02 Set 02 Mar 03 Set 03 Mar 04 Set 04 Mar 05 Set 05 Mar 06 Set 06 Mar 07 Set 07 Mar 08 Set 08 Mar 09 Set 09 Mar 10 Set 10 Mar 11 Set 11 Mar Waters Corporation 12

13 Come mai cresce la LC-MS/MS? Carenze Immunoassay Performance Immunoassay Performance LC-MS/MS Bassa Specificità Interferenze dei metaboliti di Ciclosporina e Tacrolimus sono bene documentati. Specificità altissima: massa e frammenti caratteristici per ogni farmaco Bassa Sensibilità Molti, se non tutti gli IA TDM hanno problemi con la sensibilità Eccellente: < 0,5 ug/l Alti costi* 2013 Waters Corporation 13

14 Confronto di Performance tra IA e LC-MS/MS 2013 Waters Corporation 14

15 LC-MS/MS è più specifica degli IA Interferenze con metaboliti Interferenze da anticorpi endogeni 1 Interferenze da fattori reumatoidi 2 Effetto dell ematocrito 3 Interferenze sconosciute 4 1 Ther Drug Monit 2009;31(2): Ther Drug Monit 2009;31(6): Ther Drug Monit 2007;27(1): Clinica Chimica Acta 2010;411: Waters Corporation 15

16 Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 16

17 Perchè la LC-MS/MS? Immunosuppressant Immunoassays - Company Assay % Metabolite Cross Reactivity Siemens Dimension Systems SIRO Assay 89% Emit 2000 Sirolimus Assay 61% ADVIA Centaur Systems CsA Assay 16% Dimension Clinical Chemistry System CSA/CSE Assay 6% Emit 2000 Cyclosporine Assay 8% Dimension Clinical Chemistry System Tacrolimus 18% Emit 2000 Tacrolimus Assay 21% Abbott ARCHITECT Sirolimus Assay 37% ARCHITECT Tacrolimus Assay 94% ARCHITECT Cyclosporine Assay 3.3% TDx Cyclosporine Monoclonal Whole Blood Assay 96% IMx Sirolimus Assay 77% IMx Tacrolimus/Tacrolimus II Assay 67% Thermo-Fisher Thermo Scientific QMS Everolimus Immunoassay 63% Thermo Scientific Innofluor Certican (Eve) Seradyn 142% CEDIA Cyclosporine Plus (Microgenics) 32.5 % CEDIA Tacrolimus (Microgenics) 38% % Metabolite cross reactivity is the highest % of cross reactivity for a specific metabolite of the parent drug. References Advances in Chromatographic Techniques for Therapeutic Drug Monitoring Amitava Dasgupta Waters Corporation 17

18 LC-MS/MS vs. MEIA Ther Drug Monit Volume 28, Number 4, August Waters Corporation 18

19 LC-MS/MS vs. MEIA e CEDIA 2013 Waters Corporation 19

20 LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus 2013 Waters Corporation 20

21 LC-MS/MS vs. ACMIA per tacrolimous 2013 Waters Corporation 21

22 LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus The analytical methods FPIA and LC-MS/MS are not in agreement.... using FPIA results in higher everolimus concentrations compared with LC-MS/MS. FPIA can lead to clinically relevant differences in everolimus dosage advice and higher intra-patient variability. LC-MS/MS outperforms FPIA for clinical monitoring and intervention of everolimus therapy in adult renal transplant recipients 2013 Waters Corporation 22

23 Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 23

24 Ciclosporina Cut-off: cuore: 350 ng/ml Linearità Massa 2000 ng/ml 2013 Waters Corporation 24

25 ARCHITECT tacrolimus package insert 2013 Waters Corporation 25

26 Innofluor Certican package insert 2013 Waters Corporation 26

27 Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 27

28 LC-MS/MS accuratezza Accuratezza Concentrazione del Tacrolimus misurata con il kit MassTrak in relazione al valore medio dei report NEQAS di tutti i laboratori che utilizzano la tecnica di LC-MS/MS Linearità: Y = 0.998X ; r 2 = Differenza media 1.1% in un range di ng/ml 2013 Waters Corporation 28

29 Perchè la LC-MS/MS? Tecnica considerata Gold standard per il TDM degli immunosoppressori Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco elimina ogni cross-reaction con i metaboliti Accuratezza e precisione superiori Sensibilità elevata (0,5 ug/l) 2013 Waters Corporation 29

30 Sensibilità elevata La combinazione di immunosoppressori ha portato ad una diminuzione dei livelli di dosaggio terapeutico: La sensibilità,la specificità e la precisione degli strumenti immunochimici ai livelli bassi delle finestre terapeutiche iniziano a diventare critiche per il monitoraggio. Con livelli funzionali vicini a 1 ng/ml (pediatrici), LC-MS/MS ha prestazioni decisamente superiori della strumentazione immunochimica 2013 Waters Corporation 30

31 2013 Waters Corporation 31

32 2013 Waters Corporation 32

33 25-OH Vitamina D3/D Waters Corporation 33

34 25 OH - Vitamina D Che cos è la Vitamina D? Non bisogna considerare la Vitamina D come una vera e propria Vitamina (sostanza che, come la Vitamina C, partecipa alle reazioni biologiche, aiutando il corpo a operare ottimamente) Vitamina D è una classe a se stante: gli effetti che ottiene nel corpo sono allineati a un ormone che agisce per influenzare i percorsi metabolici, le funzioni cellulari La forma metabolica attiva della Vitamina D, chiamata 1,25- diidrossivitamina D (o calcitriolo) è un ormone secosteroide (pro ormone) 2013 Waters Corporation 34

35 25 OH - Vitamina D Benefici della Vitamina D Metabolismo Osseo: previene osteoporosi, rachitismo, fratture Salute cellulare: previene tumori (seno, prostata, pancreas, ovaie, colon) Salute organismo: previene problemi cardiaci ed infarti, diabete di tipo 2, perdita dei denti Salute muscolare Salute Mentale: previene la depressione (stimola la produzione di serotonina), schizofrenia, Alzheimer, Waters Corporation 35

36 25 OH - Vitamina D Misurazione della Vitamina D Nel corpo sono presenti circa 30 metaboliti che in maggior parte non svolgono alcuna funzione fisiologica ma costituiscono soltanto prodotti di degradazione Migliore indicatore dello stato della vitamina D: 25-OH-vitamina D 3 È il metabolita principale (prodotto nel fegato); Emivita di 8 settimane; Si presenta in concentrazioni rilevabili in siero/plasma: µg/l; È l indicatore principale dello stato della presenza di Vitamina D3 nel corpo Come mai la forma attiva 1,25-(OH) 2 -vitamina D 3 non viene considerata come il principale indicatore della carenza di Vitamina D? molto instabile (emivita 8 minuti) quantità di almeno 1000 volte inferiore alla 25-OH-vitamina D 2013 Waters Corporation 36

37 25 OH - Vitamina D Range terapeutici Vitamina D: Grave Carenza: < 10 ug/l (ng/ml) Insufficienza: 10 ug/l < Vit D < 20 ug/l Livello Ottimale: 20 ug/l < Vit D < 70 ug /L Il fatto che la sintesi della VitD3 viene attivata anche dai raggi UV solari porta ad un valore medio di Vitamina D3 diverso tra estate ed inverno ed a un valore basso in zone poco esposte ai raggi solari Carnagione scura meno Vit.D3; Carnagione chiara più Vit.D3 In Gran Bretagna più del 50% della popolazione ha livelli di vitamina D insufficienti In Medio Oriente alta presenza di sole ma le donne sono completamente vestite 2013 Waters Corporation 37

38 Valutazione di: Roche Diasorin RIA Diasorin Liaison IDS EIA HPLC UV LC-MS/MS Capacità di analizzare 25OH vitd2 e 25OH vit D3 separatamente Capacità di misurare Vit D2 e vit D3 totali Capacità di discriminare l epimero LOQ Precisione Produttività Flessibilità nel settaggio metodi 2013 Waters Corporation 38

39 25 OH - Vitamina D Valutazioni Metodiche Immunoassay: Diasorin: Sensibilità: 4 ug/l Range di linearità: ug/l IDS: Sensibilità: 2,5 ug/l Range di linearità: 2,5 144 ug/l Abbott: Sensibilità: 8,0 ug/l Range di linearità: ug/l Valutazioni Metodiche HPLC: HPLC-UV: Sensibilità: 3 ug/l Range di linearità: ug/l HPLC-MS/MS: Sensibilità: 1,0 ug/l Range di linearità: 1,0-250 ug/l Entrambe le metodiche: Misurano la Vitamina D TOTALE! non riescono a separare l epimero della Vit. D Entrambe le metodiche: Possono calcolare separatamente la 25-OH vitamina D 3 e D 2 La massa riesce a separare l epimero della Vit. D 2013 Waters Corporation 39

40 PERCHE E IMPORTANTE QUANTIFICARE LE DUE ISOFORME: La Vitamina D3 non è presente in natura perché viene prodotta solo nel corpo mediante la reazione vista precedentemente La Vitamina D2 è di origine vegetale. Mediante la dieta si può raggiungere una concentrazione massima nel corpo di circa 2 ug/l. Ci sono quindi differenze nelle attività biologiche e nella tossicità fra le due isoforme: L assorbimento intestinale della Vitamina D2 è minore che quello della vitamina D3 La clearance della 25OH-VitD2 è più veloce di quella della 25OH-VitD3. Ciò dovrebbe essere dovuto alla minore affinità del 25OH-VitD2 al legame D-proteico (DPBV) Ci sono quindi differenze nel metabolismo di queste due forme di Vitamina: la Vit D2 non può essere considerata efficace come la Vit D3! 2013 Waters Corporation 40

41 Stato dell arte della Vitamina D Compares DiaSorin RIA, Nichols CPBA, IDS RIA with LC/UV Vitamin D2 is a common supplement worldwide for the treatment of vitamin D deficiency. Consequently, assay recognition of 25OHD2 is critically important Treatment with vitamin D2 may not be accurately monitored with any of the three commercial assays studied 2013 Waters Corporation 41

42 Stato dell arte della Vitamina D Comparazione di diversi metodi di rilevazione: -RIA (Diasorin) -Diasorin Liaison (CLIA) -IDS ISYS (CLIA) Analisi di 170 pazienti -Abbott (CMIA) selezionati a caso -Siemens (CLIA) -Roche (ECLIA) -2 LC-MS/MS Diasorin R&D: Waters Acquity TQD Pathology Queensland: Waters Acquity XE premiere (Tecan) 2013 Waters Corporation 42

43 Stato dell arte della Vitamina D Calcoli fatti: Passing-Bablock Regression Y=a + bx Intrassay precision CCC= Concordance Correlation Coefficient Bias 2013 Waters Corporation 43

44 Stato dell arte della Vitamina D 2013 Waters Corporation 44

45 2013 Waters Corporation 45

46 2013 Waters Corporation 46

47 Steroidi 2013 Waters Corporation 47

48 Steroidi in Immunoassay 2013 Waters Corporation 48

49 Steroidi in Immunoassay 2013 Waters Corporation 49

50 Analisi del profilo steroideo utilizzando kit diagnostici CE-IVD 2013 Waters Corporation 50

51 Obiettivo: Valutazione del kit per analisi degli steroidi CHS su strumentazione ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S Il metodo usato utilizza la preparazione del campione del kit diagnostico: Precipitazione proteica del siero + evaporazione del surnatante + ricostituzione Il kit presenta calibratori in matrice a 7 livelli (L1-L7) e 3 controlli di qualità sempre in matrice (QC1-QC3) Abbiamo utilizzato la colonna Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 1.0x100mm 2013 Waters Corporation 51

52 Pannelo steroideo Analiti misurabili nel PE MSMS Steroidi Kit Testosterone Cortisolo Corticosterone DHEA, Deidroepiandrosterone Progesterone 4-androsten-3,17-dione 11-deossicortisolo DHEAS, Deidroepiandrosterone solfato 17-alfa-idrossiprogesterone Aldosterone 2013 Waters Corporation 52

53 Produttività Grazie a Acquity UPLC la cromatografia è stata migliorata portando il tempo a 12 minuti di corsa da iniezione ad iniezione (aumentando produttività e salvando circa il 25% di fase mobile). Inoltre è stata migliorata la separazione tra i picchi del 11-deossicortisolo e del corticosterone. Corticosterone 11-deoxycortisol 2013 Waters Corporation 53

54 2013 Waters Corporation 54

55 Precisione Analyte Aldosterone Androstenedione Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) CV(%) Analyte Corticosterone Cortisol Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) CV(%) Analyte 11-deoxycortisol Dehydroepiandrosterone Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) CV(%) Analyte Dehydroepiandrosterone sulfate Progesterone Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) CV(%) Il migliore valore di precisione (2.3% RSD) è stato ottenuto sul controllo di qualità alto del cortisolo e del testosterone (Q3). Il peggiore sul controllo di qualità basso (Q1) del DHEAS (7.25 RSD). Analyte 17á-hydroxyprogesterone Testosterone Level Low Middle High Low Middle High Mean (ng/ml) CV(%) Waters Corporation 55

56 Precisione QC1 QC2 QC3 Steroid %RSD %RSD %RSD Aldosterone Androstendione Corticosterone Cortisol Deoxycortisol DHEA DHEAS Progesterone alpha hydroxyprogesterone Testosterone Questi dati ottenuti sono migliori di quanto dichiarato sul technical note della Perkin Elmer Waters Corporation 56

57 Response Response Response Response Response Response Response Response Response Response Linearità Compound name: Aldosterone Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 11 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Androstendione Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 12 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Corticosterone Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 13 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None nmol/l Compound name: Cortisol Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 14 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None nmol/l Compound name: 11-Deoxycortisol Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 15 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None nmol/l Compound name: DHEA Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None nmol/l 0.0 nmol/l nmol/l Compound name: DHEAS neg Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 16 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Progesterone Compound name: 17-alpha hydroxyprogesterone Correlation coefficient: r = , r^2 = Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 17 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: NoneCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Testosterone Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: Internal Std ( Ref 19 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None nmol/l 0.0 nmol/l 0.0 nmol/l 0.0 nmol/l Waters Corporation 57

58 Linearità Sovrapposizione di 8 curve di calibrazione: Steroid Lowest cal (nmol/l) Highest Cal (nmol/l) r^2 Aldosterone >0.999 Androstendione >0.999 Corticosterone >0.998 Cortisol > Deoxycortisol >0.998 DHEA >0.994 DHEAS >0.999 Progesterone > alpha hydroxyprogesterone >0.996 Testosterone > Waters Corporation 58

59 Robustezza Nota: Risoluzione Cromatografica mantenuta! 2013 Waters Corporation 59

60 CAH in Serum 2013 Waters Corporation 60

61 CAH in DBS 2013 Waters Corporation 61

62 Grazie per l attenzione 2013 Waters Corporation 62

63 17-OHP analysis in dried blood spots (DBS) 2013 Waters Corporation 63

64 17-OHP analysis in DBS System: ACQUITY Xevo TQ MS Protocol: 2 x 3mm punches LLE ACN/acetone 20µL injection HSS C18 2.1x50mm 4.5min run time Calibration 3-400ng/mL 2013 Waters Corporation 64

65 Linearity 2013 Waters Corporation 65

66 Precision Intra-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50, 100ng/mL) (n=5) QCs obtained from CDC (Atlanta, GA) Low Mid High mean(ng/ml) Std.Dev %CV Waters Corporation 66

67 Precision Inter-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50, 100ng/mL) over five days Low Mid High mean(ng/ml) Std.Dev %CV Waters Corporation 67

68 Ion suppression profile 2013 Waters Corporation 68

69 Sensitivity LLOQ 3.27ng/mL Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2) 3.27 ng/ml OHP F1:MRM of 6 channels,es > e+004 % min Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2) 3.27 ng/ml 100 % 17-OHP F1:MRM of 6 channels,es > e min Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2) 3.27 ng/ml 100 d8-17-ohp F1:MRM of 6 channels,es > e+005 % 0 min 2013 Waters Corporation

70 Plasmatic Metanephrines analysis with Off-line SPE 2013 Waters Corporation 70

71 Sample Preparation Matrix :Plasma WATERS Oasis WCX 1cc Cartridge 30mg 30µm 1ml ACN 1ml Buffered Water ph 6.8 1ml Plasma + 25µl Internal Standard Solution Wash with 2X 1 ml Buffered Water ph 6.8 an 1ml ACN Elute with 1 ml ACN + 2% FA 2013 Waters Corporation 71

72 Chromatograpghic Conditions Column: Waters Acquity HILIC 50 x 2.1 mm, 1.7 µm with in-line filter Waters Acquity UPLC TQD Sytem Flow Rate: 0.6 ml/min Injected Volume: 20 μl (full loop) Column Oven: 30 C Mobiles Phases: A = Water + 0.5% FA + 50mM AmFo B = Acetonitrile Total Run Time: 5 minutes Gradient: Temps (min.) %A %B Slope Waters Corporation 72

73 Calibration curve (can be performed in Extracted Water) Metanephrine: nM Normetanephrine: nM Metanephrine Normetanephrine 2013 Waters Corporation 73

74 Same Sample Positive Patient TQD Metanephrine 1.4 µg/l Normetanephrine 1.4 µg/l Metanephrine Normetanephrine 2013 Waters Corporation 74

75 Conclusion Quantification of Plasmatic Metanephrine and Normetanephrine using off-line SPE with UPLC-Quattro Premier XE or TQD Sensitivity is similar on Quattro Premier XE and TQD Run time set to 5 minutes in order to maximize the Analytical Column Life-Time (about 1000 injections so far) Excellent linearity across the analytical range LOQ < 0.1nM for Metanephrine and < 0.2nM for Normetanephrine This method has been validated internally and is used by Angers University Hospital as well as Lille University Hospital Cross Analysis of 10 samples Groningen University Hospital (On-line SPE) gave CV around 10% 2013 Waters Corporation 75

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