Modulo 14: Diagnosi microbiologica di tubercolosi

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1 C.I. MEDICINA DI LABORATORIO Microbiologia Clinica CdS Medicina e Chirurgia AA Modulo 14: Diagnosi microbiologica di tubercolosi Giovanni Di Bonaventura, PhD Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Dipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel ) Centro Scienze dell Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel ) gdibonaventura@unich.it

2 Infezione batterica Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avian tubercolosi disseminata nei pazienti con AIDS Tipologie Primaria Secondaria Disseminata 2

3 M. tuberculosis Lenta crescita (tempo di generazione medio: h) Acidi micolici e superficie cerosa Primaria Tubercoli, caseosa, reazione alla tubercolina Secondaria (riattivazione) Consolidamento Disseminazione TB extrapolmonare (linfonodi, rene, ossa, tratto genitale, cervello, meningi) Il tubercolo polmonare consiste in un granuloma formato da un nucleo centrale di necrosi caseosa contenente batteri all interno di macrofagi giganti, e da una parete esterna formata da fibroblasti, linfociti e neutrofili. 3

4 Epidemiologia Le infezioni causate da Mycobacterium tuberculosis complex rappresentano uno dei più importanti argomenti di salute pubblica mondiale: prevalenza: 14 milioni di casi di TB incidenza: 9.4 milioni di casi di TB (soprattutto Africa sub-sahariana e sud-est asiatico per elevato numero HIV e scarso accesso ai servizi sanitari) 1.7 milioni di morti World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report Geneva, Switzerland: WHO Press;

5 Importanza della diagnostica Resistenza alla terapia: Nel 2008 notificati casi di multidrug-resistant TB (MDRTB), ossia il 3.3% dei nuovi casi, causando morti. Paesi a più alta incidenza di MDRTB sono distribuiti su tutto il globo (Europa, Asia, Africa) : 49 milioni di pazienti trattati, salvate oltre 6 milioni di vite. Necessità di una diagnosi improved : detection rate globale: 63%. L adozione di programmi di controllo sanitario richiede una diagnostica rapida ed accurate, soprattutto in quei Paesi dove difficile è l accesso ai servizi sanitari e dove non è possibile attendere i risultati dai laboratory di riferimento prima di avviare una terapia anti-tb. Spesso la diagnostica si basa soltanto sull osservazione microscopica, senza ottenere alcun dato sulle resistenze. I tests di sensibilità (AST) sono alquanto problematici: difficile esecuzione, elevato TAT (mesi), risultati discordanti per alcune molecule (etambutolo), mancanza di standardizzazione per i farmaci di seconda linea. E assolutamente indispensabile sviluppare strategie diagnostiche rapide, al fine di individuare nuovi casi di TB ed i pazienti infettati con ceppi MDR. World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report Geneva, Switzerland: WHO Press;

6 AST: tecniche rapide MDR-XDRTB Colour Test. Utilizza una tecnologia thin-layer agar inuna capsula Petri divisa in 4 quadranti: 1 (senza antibiotico, quale controllo di crescita batterica); 2 (contenente isoniazide), 3 (contenente rifampicina), 4 (contenente ciprofloxacina). Il campione di espettorato viene collezionato in un contenitore contenente un terreno di trasporto con disinfettante (per limitare la crescita della flora accessoria). La miscela viene seminata in ogni quadrante. Concettualmente semplice ed a basso costo, l utilizzo richiede un laboratorio con infrastrutture dedicate. 6

7 Sintomatologia Non tutti i pazienti con TB sono sintomatici; tuttavia, la maggior parte dei pazienti TB presenta uno o più sintomi. Tutti i soggetti sintomatici per TB o risultati positivi ad un test indicativo di infezione da M. tuberculosis (tuberculin skin test, TST; interferon-gamma release assay, IGRA), dovrebbero essere soggetti a valutazione medica per escludere la malattia TB. 7

8 Valutazione medica La valutazione medica della malattia tubercolare si articola nelle seguenti fasi: 1. Valutazione anamnestica 2. Esame fisico 3. Test per rilevare la presenza dell infezione da M. tuberculosis 4. Radiografia del torace 5. Esame batteriologico di campioni clinici 8

9 Anamnesi Presenza di uno o più sintomi suggestivi per TB; nel caso, da quanto tempo persistono. Esposizione ad un soggetto con TB. Diagnosi pregressa di infezione tubercolare latente (LTBI) or malattia TB. In caso di trattamenti inadeguati o per scarsa compliance del paziente, TB può ricorrere con emergenza di isolati multi-resistenti. Considerare I fattori demografici (paese di origine, età, etnia, gruppo razziale, occupazione) che possono rappresentare fattori di rischio per l infezione tubercolare. Considerare la presenza di malattie concomitanti (HIV, diabete) che aumentino il rischio di progressione della malattia nei soggetti con infezione latente da M. tuberculosis. 9

10 Tests per l infezione da M. tuberculosis La scelta del test più adatto per la ricerca dell infezione da M. tuberculosis deve tener conto di: motivi e contesto clinico disponibilità rapporto costo-efficacia Attualmente, esistono due metodi disponibili per la ricerca del microrganismo: Mantoux tuberculin skin test (TST) Interferon-gamma release assays (IGRAs) QuantiFERON-TB Gold In-Tube test (QFT-GIT) T-SPOT.TB test Questi tests consentono di differenziare i soggetti infetti con M. tuberculosis da quelli non infetti. Tuttavia, un risultato negativo non esclude la diagnosi di malattia tubercolare o infezione latente (Latent Tuberculosis Infection, LTBI). 10

11 Test cutaneo per la tubercolosi: reazione alla tubercolina 11

12 Esame radiografico Le alterazioni osservate all esame radiografico del torace potrebbero essere suggestive, ma mai diagnostiche, per TB. RX può essere utilizzato per escludere la TB polmonare in un soggetto normoreattivo, positivo a TST o IGRA, ed asintomatico per TB. Presenti soprattutto nei segmenti apicale e posteriore del lobo superiore o dei segmenti superiori del lobo inferiore, le lesioni potrebbero essere localizzate ovunque e differire per dimensioni, forma e cavitazione, soprattutto nell immunocompromesso (es. HIV). Soprattutto nei ragazzi, le alterazioni radiografiche sono minime; indicato un RX laterale per diagnosi differenziale con linfoadenopatia. La tomografia computerizzata può fornire informazioni aggiuntive, sebbene più costosa. Lesioni fibrotiche: possibile presenza di bacilli tubercolari in divisione con un alto potenziale per la progressione verso la malattia TB. Poichè RX non può differenziare una pregressa TB da una forma attiva, i soggetti con un quadro radiografico suggestivo per una TB pregressa e TST+ oppure IGRA+ dovrebbero essere sottoposti a terapia per LTBI soltanto dopo aver escluso una infezione in atto previa indagine colturale. Al contrario, lesioni nodulari non fibrotiche, pienamente calcificate e discrete, suggestive per la presenza di granuloma, indicano un basso rischio per la progressione verso la malattia TB. 12

13 Esame batteriologico E necessario che tutti i soggetti sospetti per TB debbano essere sottoposti ad indagine batteriologica. L indagine, effettuata su campioni di differente tipologia (escreato, urine, liquor), si articola nelle seguenti fasi: Prelievo del campione Osservazione microscopica per la presenza di micobatteri (AFB, Acid-Fast Bacilli) Ricerca diretta di M. tuberculosis utilizzando tests di amplificazione degli acidi nucleici (Nucleic Acid Amplification, NAA tests) Indagine colturale ed identificazione Tests di sensibilità agli antibiotici 13

14 Prelievo dei campioni TB polmonare La tecnica più frequentemente utilizzata prevede la raccolta di espettorato a seguito di colpi di tosse. E necessario prelevare almeno 3 campioni consecutivi di espettorato ad intervalli di 24 h; il campione deve essere raccolto al mattino, a digiuno, perché le secrezioni durante la notte si accumulano nelle vie respiratorie. PREPARAZIONE DEL PAZIENTE istruire il paziente su come espettorare, facendo precedere tre respiri profondi ad un energico colpo di tosse; sottolineare il fatto che escreato non è sinonimo di saliva o secrezioni mucose nasali o faringee. MODALITA DI PRELIEVO. praticare la pulizia del cavo orale (denti, gengive, lingua e parte interna delle guance) con acqua distillata sterile; sciacquare il cavo orale sempre con acqua distillata sterile, per limitare contaminazioni; raccogliere 5-10 ml di materiale di provenienza polmonare dopo un energico colpo di tosse; utilizzare un contenitore sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite; In caso di tosse non produttiva, si può ricorrere ad induzione con aerosol, facendo inalare una soluzione salina ipertonica (3-5%), sterile e riscaldata. Contrassegnare il campione come indotto, in quanto la secrezione in questo caso è altamente idratata e potrebbe pertanto essere scambiata come saliva. Qualora non fosse possibile produrre un campione di espettorato, è possible ricorrere alla broncoscopia o effettuare un aspirato gastrico per ottenere un campione adeguato. TRASPORTO: entro 1 ora dalla raccolta. CONSERVAZIONE: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare. 14

15 Prelievo dei campioni TB polmonare Durante la raccolta del campione, il paziente produce un aerosol altamente contagioso per operatori sanitari/pazienti in prossimità. La raccolta andrebbe pertanto effettuata in un ambiente dedicato dotato di ventilazione controllata (stanza di isolamento AII), in grado di contenere il rischio biologico aerogeno. Il personale sanitario deve dotarsi di mascherina. 15

16 Prelievo dei campioni TB extra-polmonare Nel caso si sospetti una TB extra-polmonare, debbono essere considerate altre tipologie di campione. campione condizioni modalità contenitore Urine (In alternativa, è possibile prelevare l urina direttamente da catetere) Raccogliere 3 campioni in giorni consecutivi. raccogliere la prima minzione completa del mattino, preferibilmente scartando il primo getto. sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite. Liquor prelevare, mediante rachicentesi, la maggior quantità possibile di liquor (minimo 2 ml). Provetta sterile Pus disinfettare la cute con alcool prima della raccolta utilizzare per la raccolta una siringa; se non è possibile il prelievo con siringa, usare un tampone con terreno di trasporto Amies o Stuart. sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite. tampone in terreno di trasporto Biopsia raccogliere, asetticamente, almeno 1 gr di tessuto. non avvolgere in garza, immergere in fissativi o conservanti. aggiungere una minima quantità di soluzione salina sterile, per evitare l essicamento. sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite. Trasporto: entro 1 ora dalla raccolta. Conservazione: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare. 16

17 Osservazione microscopica per AFB I Micobatteri, una volta colorati, resistono alla decolorazione con alcol/acido. Per questo motivo vengono anche denominati Acid-Fast Bacilli (AFB). La ricerca microscopica di AFB nello striscio colorato allestito da un campione può fornire una iniziale e rapida evidenza batteriologica della presenza di Micobatteri in un campione clinico. Due sono le tecniche più frequentemente impiegate a tal fine: microscopia diretta, previa colorazione con carbolfucsina (Ziehl- Neelsen, Kinyoun); microscopia in fluorescenza, previa colorazione con auramina-o oppure auramina-rodamina. La sensibilità dell indagine microscopica è scarsa ( bacilli/ml di campione), significativamente minore rispetto a quella dell isolamento colturale ( bacilli/ml). Di contro, la ricerca di AFB è tecnica rapida (risultati disponibili entro le 24h dal prelievo). Tale tecnica consente soltanto una identificazione presuntiva della malattia TB poichè M. tuberculosis non è l unica specie AFB. Inoltre, alcuni pazienti possono avere uno striscio AFB- ma essere positivi all indagine colturale. Una osservazione microscopica negativa per AFB non esclude, pertanto, la malattia TB. 17

18 Osservazione microscopica per AFB Nei campioni AFB+ si procede alla conta cellulare (ottenuta ad un determinato ingrandimento) refertando il risultato in maniera semi-quantitativa mediante l adozione di uno score: 4+, 3+, 2+, or 1+. Lo score è direttamente proporzionale alla presenza di AFB e, conseguentemente, alla contagiosità del paziente. 18

19 Ricerca diretta mediante amplificazione degli acidi nucleici Questa metodica si basa sulla amplificazione di specifiche sequenze contenute nel DNA/RNA di M. tuberculosis (NAA, Nucleic Acid Amplification). Molto più rapida rispetto all esame colturale (ore vs settimane). Possibili vantaggi associate all utilizzo della NAA: precoce conferma di malattia TB; rapido avvio della terapia antibiotica; migliore outcome del paziente; interruzione della trasmissione (per precoce diagnosi, messa in isolamento respiratorio ed avvio di una terapia appropriate); precoce e più efficiente utilizzo dell isolamento respiratorio; precoce inizio della individuazione dei contatti ; maggiore efficacia degli interventi di salute pubblica. CDC raccomanda l utilizzo di questi tests nei pazienti: sintomatici con sospetta TB polmonare in cui il risultato potrebbe influire significativamente sul management del caso o sulle attività di controllo (es. ricerca dei contatti ). Un test negativo non può escludere la malattia, soprattutto in presenza di un fondato sospetto clinico. Tuttavia, se considerato unitamente ad altre evidenze può essere utile per velocizzare l iter diagnostico, o per evitare l adozione di una terapia non necessaria. 19

20 Isolamento ed identificazione L indagine colturale rimane il gold standard per la conferma della malattia, oltre che necessaria per valutare il genotipo dell isolato, nonchè la sua sensibilità agli antibiotici. L esame va effettuato su tutti i campioni diagnostici, indipendentemente dall esito per AFB o NAA. Un risultato positivo per M. tuberculosis conferma la diagnosi di malattia. Nel caso di negatività, la diagnosi può essere posta soltanto su base clinica. Bacilli vitali potrebbero essere infatti presenti in altri campioni/siti. I sistemi automatizzati attualmente in commercio (BACTEC, MGIT, VersaTREK, MBBACT) sono in grado di evidenziare la crescita in terreno liquid della maggior parte dei micobatteri in 4-14 giorni, mentre 3-6 settimane sono necessarie per la crescita su agar. L indagine colturale è importante nel monitoraggio della efficacia della terapia e, conseguentemente, della contagiosità del paziente. i campioni vengono prelevati ad intervalli mensili fino a che non si ottengano 2 campioni consecutivi NEGATIVI. La conversione del colturale rappresenta la prova dell efficacia terapeutica. negativizzazione di tutti i campioni: avvenuta eradicazione. 20