Struttura e replicazione del DNA

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1 Struttura e replicazione del DNA

2 La struttura del DNA e stata chiarita nel 1953 ad opera di Watson e Crick A quel tempo si sapeva che: - I geni erano fattori ereditari (Mendel) - I geni controllano la struttura delle proteine - I geni si trovano sui cromosomi - I cromosomi consistono in DNA e proteine

3 Il DNA e il materiale genetico (Griffith 1928) Non virulento R (rough) Virulento con rivestimento o capsula polisaccaridica S (smooth) Agente eziologico della polmonite Streptococcus Pneumoniae, letale per i topi

4 La trasformazione

5 Dai cadaveri dei topi morti vennero recuperate cellule batteriche vive che formavano colonie di tipo liscio e che in una successiva infezione risultavano virulente I resti delle cellule virulente (S) morte col calore avevano convertito le cellule R vive in cellule S trasformazione

6 Avery, McLeod Saggio delle componenti dei batteri virulenti uccisi dal calore

7 Il DNA e in grado di trasformare le cellule R, determinando la capacita di produrre il carattere virulento rappresentato dalla capsula polisaccaridica Dimostrazione definitiva: esperimenti di Hersey/Chase

8 DNA Molecola trasmessa dai fagi nei batteri e che permette la formazione di nuove particelle fagiche Materiale ereditario Molecola semplice Come traduce l informazione in proteine? Come si replica?

9 La sintesi del DNA avviene nella fase S

10 Le unita costitutive del DNA: i nucleotidi A G C T

11 Acido desossiribonucleico DNA RNA

12 Le basi azotate

13 Diffrattogramma del DNA -Molecola lunga e sottile -Composta da 2 parti simili fra loro parallele - Molecola elicoidale

14 Le regole di Chargaff T+C=A+G A+T C+G

15 Rapporti molari delle basi in DNA di varia origine

16 La doppia elica di DNA di Watson & Crick

17 Modello della struttura ad elica del DNA Direzioni opposte: 2 catene antiparallele Legami idrogeno

18 La stima del diametro del DNA si accorda con l appaiamento base purinica-base pirimidinica

19 Legami idrogeno A-T, C-G Tratti di DNA C-G sono piu stabili dei tratti A-T

20 L impilamento delle basi dà origine a 2 solchi: solco maggiore e solco minore

21 destrorse sinistrorsa Forma A Forma B Forma Z

22 Modello della replicazione del DNA proposto da Watson e Crick Ogni filamento funge da stampo per la costruzione di una nuova catena di DNA Data la complementarieta delle basi, ciascuno dei 2 filamenti di DNA funge da STAMPO per formare 2 doppie eliche, identiche a quelle originali, usando i nucleotidi liberi presenti nella cellula

23 La complementarietà delle basi, ovvero l inserimento della base complementare sul nuovo filamento, garantisce la fedeltà della trasmissione dell informazione genetica

24 Modelli alternativi per la replicazione del DNA Replicazione dispersiva Replicazione semiconservativa Replicazione conservativa

25 Prove della replicazione semiconservativa del DNA: Meselson-Stahl (1958)

26 Meselson-Stahl

27 Purificazione del DNA in gradiente di CsCl Soluzione CsCl soluzione CsCl soluzione CsCl

28 Bande di DNA pesante ( 15 N) e leggero ( 14 N)

29 Solo il modello semiconservativo e in accordo con l esperimento di Meselson-Stahl 15 N 15 N 15 N

30 Cromosomi arlecchino Visualizzazione della replicazione semiconservativa dei cromosomi durante la mitosi con l uso della BUdR (Bromodeossiuridina) al posto della Timidina. Una delle proprietà del DNA risultante è che non assume il colorante Giemsa in modo normale (bande chiare) BUdR Colchicina, blocco in metafase In questo modo si possono anche vedere gli scambi tra cromatidi fratelli in mitos

31 Watson e Crick avevano proposto la formazione di una FORCELLA REPLICATIVA durante la replicazione del DNA

32 Replicazione del DNA batterico in presenza di timidina triziata ( 3 H Timidina) Filamento freddo Filamento caldo Strutture theta θ

33 La replicazione a circoli rotanti dei DNA circolari (plasmidi, virus, etc) 3 -OH libero

34 Replicazione a circoli rotanti

35 Ogni base del filamento stampo controlla l inserimento della base complementare in corso di sintesi

36 DNA polimerasi Enzima che catalizza la reazione 3 5 PPi Rilascio di pirofosfato determinante affinche avvenga la reazione

37 DNA polimerasi Reazione di polimerizzazione dal 5 al 3

38 Proprieta della DNA polimerasi 1)Catalizza l allungamento 5 ->3 2)Attivita esonucleasica 5 ->3 rimuove i ribonucleotidi dei frammenti di Okazaki 3)Attivita esonucleasica 3 ->5 correzione di bozze rimuove le basi non complementari missmatches Oloenzima DNA poliii di E.Coli

39 Le DNA polimerasi In E.Coli si distinguono almeno 5 DNA polimerasi diverse, le fondamentali sono: -DNA polimerasi I replica il DNA -DNA polimerasi II ripara il DNA danneggiato -DNA polimerasi III replica il DNA Negli eucarioti si distinguono circa 15 DNA polimerasi, le fondamentali sono: α, δ, simili alla pol I/III procariotiche β riparazione del DNA ε, γ, mitocondri e altro

40 Le DNA polimerasi

41 Le 3 attivita della DNA polimerasi Attivita polimerasica 5 ->3 Attivita esonucleasica 5 ->3 Attivita esonucleasica 3 ->5

42 Attivita esonucleasica 5 ->3

43 Fedelta di replicazione -L accuratezza della replicazione del DNA e fondamentale per la corretta trasmissione dell informazione genetica -Valutando la frequenza di basi malappaiate in una varieta di geni, si stima che la DNA polimerasi inserisce 1 BASE ERRATA OGNI nucleotidi inseriti. Questo significa che su genomi grandi come quelli eucariotici (uomo, 3x10 9 bp) si inserisce solo 1 errore su 10 9 bp. Ma solo il 25% del genoma umano ha una funzione! Attivita di Proofreading o Correzione di bozze della DNA polimerasi La DNA polimerasi e in grado di discriminare appaiamenti corretti da appaiamenti non corretti

44 Attivita di correzione di bozze

45 L attivita di Proofreading puo spiegare perche l estensione del DNA avviene in direzione 5 ->3

46 Replicazione del genoma procariotico Origine di replicazione Terminatore della replicazione

47 La replicazione bidirezionale nei procarioti Ciclo di replicazione batterico 40 min

48 Origini di replicazione eucariotiche Ciclo di replicazione eucariotico da 1h a 200h Origini di replicazione nell uomo circa 30,000 distanti Kb Pulse-Chase Replicazione in presenza di [ 3 H]Timidina e poi somministrazione di timidina non marcata ->autoradiogramma

49 Origini di replicazione eucariotiche Bolle di replicazione

50 Innesco della sintesi di DNA La DNA polimerasi puo allungare la catena di DNA ma non la puo iniziare-> necessita di un primer (innesco) o breve oligonucleotide La Primasi catalizza la formazione di un breve frammento di RNA (30 bp) che funge da innesco per la reazione di allungamento

51 Comparazione procarioti/eucarioti La polimerasi α coopera con la primasi per la sintesi dell innesco

52 Replicazione continua e discontinua del DNA 3 5 La DNA ligasi salda con legami covalenti le catene di DNA 5 3

53 Passaggi nella sintesi del filamento copia di DNA Frammenti di Okazaki La DNA pol I grazie alla sua attivita esonucleasica 5 ->3 rimuove gli inneschi di RNA La DNA ligasi salda tra loro i frammenti usando ATP

54 Un dimero di DNA polimerasi III puo sintetizzare contemporaneamente i 2 nuovi filamenti

55 Elicasi Le proteine SSB stabilizzano il singolo filamento e bloccano la formazione del duplex Elicasi-> enzima che rompe i legami idrogeno tra le basi usando ATP

56 Elicasi

57 Topoisomerasi La topoisomerasi rimuove le torsioni positive a valle della forca di replicazione, introducendo dei tagli a singolo o doppio filamento sul DNA, permettendo ai 2 filamenti di ruotare liberamente uno intorno all altro Regioni di DNA superavvolte si accumulano in seguito all azione dell elicasi

58 Topoisomerasi

59 La replicazione ai telomeri Segmento non polimerizzato cromosoma piu corto

60 La replicazione ai telomeri

61 Telomeri _ Sono formati da DNA altamente ripetuto (2000 ripetizioni di TTAGGG nell uomo) e non codificante Telomerasi-> trascrittasi inversa (ribonucleoproteina, TERT) che a partire dall RNA stampo (snorna, TERC) catalizza la sintesi di pezzi di DNA

62 Replicazione ai terminali cromosomali

63 Telomerasi

64 La telomerasi non si trova nelle cellule somatiche umane I telomeri proteggono i terminali comosomali dall accorciamento In molte cellule somatiche i telomeri vengono persi ad ogni divisione cellulare e le cellule smettono di dividersi-> causa della senescenza La telomerasi si trova generalmente in: - cellule della linea germinale - cellule embrionali - cellule staminali adulte - cellule cancerose - cellule di eucarioti unicellulari come Tetrahymena thermophila Le cellule cancerose producono alti livelli di telomerasi

65 Cellule di un neonato in coltura-> si dividono circa 100 volte Cellule di un 50enne in coltura-> circa 12 divisioni

66 La lunghezza dei telomeri e correlata con l invecchiamento precoce Le cellule somatiche degli individui affetti da progeria hanno telomeri piu corti e mostrano una diminuzione della capacita proliferativa in coltura

67 Alcuni genomi virali ad RNA

68 Replicazione del virus dell HIV

69 Retroviral virus Fusion Assemblament Reverse Transcription Traduction Nuclear Import Transcription Nuclear Export INTEGRATION

70 Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA Si rompono i legami idrogeno 100 C Denaturazione del DNA Rinaturazione per riassociazione delle sequenze complementari

71 Ogni frammento di DNA ha una caratteristica temperatura di fusione (Tm-> melting temperature) Maggiore e il contenuto delle G C, maggiore e la Tm Tm-> temperatura alla quale meta delle molecole di DNA sono denaturate in singoli filamenti

72 Effetto ipercromico delle basi nucleotidiche, all aumentare della separazione dei due filamenti aumenta la OD a 260nm

73 Applicazioni sperimentali della complementarietà delle basi Le cinetiche di riassociazione suggeriscono che il DNA umano e formato da: fast Cinetica di rinaturazione del genoma umano intermediate slow

74 Fast: DNA altamente ripetuto, presente in numerose copie (trasposoni inattivi, copie geniche inattive, ripetizione di sequenze semplici, sequenze ripetute in tandem, duplicazioni segmentali) Intermediate: DNA mediamente ripetuto Slow: DNA presente in sequenze uniche

75 Composizione del genoma umano

76 PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione a catena della polimerasi) Gene a sequenza nota La PCR permette l amplificazione di un milione di volte o piu di una sequenza specifica di DNA che e gia nota o di cui sono note delle piccole sequenze all estremita del gene

77 Oligonucleotidi o primers

78 Oligonucleotidi o primers

79 Reazione 2 n dove n=numero di cicli Si possono ottenere informazioni sulla sequenza a partire da ridottissime quantita di DNA come sangue, capelli, etc PCR (Polymerase Chain Reaction)

80 Southern/Northern Blot Ibridazione con sonda di DNA

81 Ibridazioni in situ

82 Il sequenziamento del DNA (Sanger)

83 Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA

84 il metodo di Sanger 2-3 DIDEOSSINUCLEOTIDI Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dntp sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddntp in ciascuna provetta

85 Sequenziamento del DNA: il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Si legge la sequenza mano mano sintetizzata dal basso verso l alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l estremità 5 mentre il nucleotide T è all estremità 3. 5 GCTCCACGTAACGT3 Questa sequenza è complementare al filamento stampo.

86 ddntp marcati con fluorofori

87 cromatogramma

88 Mappe fisiche di molecole di DNA basate su taglio di enzimi di restrizione (Mappe di Restrizione) Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNA riconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici e con una sequenza ben precisa.

89 Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che i batteri utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo

90 Frammenti di restrizione La mobilita di ciascun fammento e inversamente proporzionale al logaritmo della sua lunghezza

91 DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENI Anemia falciforme RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) polimorfismo dovuto a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati dalla presenza o assenza di un sito di restrizione

92 Applicazione del DNA ricombinante: Diagnosi dell anemia falciforme tramite Southern Blot La mutazione abolisce il sito MstII