SNPs. A mutation that causes a single base change is known as a Single Nucleotide Polymorphism

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1 The availability of several loci, the bi-parental inheritance, the high level of polymorphism and the codominance. Make these microsatellites especially powerful for analysis at individual and at population level. SNPs A mutation that causes a single base change is known as a Single Nucleotide Polymorphism GATTTAGATCGCGATAGAG GATTTAGATCTCGATAGAG ^ The most abundant polymorphisms in a genome (about 1 every 500 bp). Because the mutation rate is generally low, usually 2 alleles in a popultion (maximum 4). Low if compared to microsatellite but SNPs are much more frequent and easy to characterize. 1

2 SNPs may fall: within coding region, in non coding regions of genes, in the intergenic regions. This should be taken into account (if possible) when the panel of SNPs to be used is established Ascertainment bias: selection of loci from a non-representative sample. e.g.: if few animals are used for SNP discovery, then loci with rare alleles will be underrepresented. The use of these loci can reveal a false deficit of rare alleles (false bottleneck signature). (Correction methods are available) Genotyping Technologies 1. RFLP 2. PCR (allele specific primers) 3. Oligonucleotide ligation 4. Primer extension (incorporate labeled nucleotides) 5. Hybridization (microarray) 6. Taqman (RT PCR) 7. Sequencing (whole genome or targeted) and many other ones!!! 2

3 Species identification for forensic applications Control and regulation of international trading Un approccio single locus Isolamento di marcatori molecolari NUCLEARI, A SINGOLO LOCUS, che permettano l identificazione di specie e di ibridi interspecifici di storione Analisi dell introne 1 del gene RPS7 Messa a punto di un protocollo di identificazione di specie semplice, veloce e standardizzato possibilmente basato su reazioni in multiplex 3

4 RPS7 1 approccio Gene per la proteina ribosomale S7 INTRONE 1 (RP1) Componente cruciale per l assemblaggio e il funzionamento della subunità minore del ribosoma marcatore nucleare Ricerca di mutazioni fissate entro specie idonee alla progettazione di primer specie-specifici singolo locus maggior grado di polimorfismo genetico Estrazione del DNA da tessuti Amplificazione dell introne 1 (RP1) dl gene RPS7 da 80 individui Purificazione enzimatica e sequenziamento Clonaggio Analisi delle sequenze Costruzione di primer specie-specifici Messa a punto di reazioni di PCR in multiplex Validazione del metodo su circa 60 individui 4

5 Iniziale amplificazione con primer universali Analisi di RP1 Clonaggio di 3 individui A. gueldenstaedtii A. transmontanus H. huso Multi allineamento degli alleli Sequenziamento di 10 inserti di clonaggio per individuo 3 GRUPPI DI SEQUENZE Analisi di RP1 Presenza non mutuamente esclusiva di alleli dello stesso individuo nei tre gruppi identificati 3 LOCI Costruzione di un NUOVO PRIMER SELETTIVO per il LOCUS A 5

6 Amplificazione di 80 campioni 11 specie Analisi del locus A Amplificazione con esito positivo per tutti gli esemplari A supporto dell ipotesi della presenza di 3 loci Sequenze chiare Sequenze con doppi picchi Sequenze doppie CLONAGGIO SEQUENZA CONSENSO Allineamento di tutte le sequenze analizzate e screening dei polimorfismi Species and hybrid identification CAVIAR A. naccarii 6

7 3 multiplex reactions: species-specific primers Mix1: A. fulvescens, A. naccarii Mix2: A. stellatus, A. gueldenstaedtii, H. huso e A. ruthenus Mix3: A. sinensis, A. transmontanus Terminale 3 sul nucleotide diagnostico Progettazione di primer specie-specifici Frammenti di dimensioni diverse per ogni specie Mutazioni putativamente diagnostiche Ambiguità non risolvibili 7

8 Species One specific band expected in pure species Primers were designed in order to differentiate the length of the different species specific amplification product Validazione del metodo Applicazione del test a individui ottenuti da incroci interspecifici Casi di dubbia interpretazione Risultato atteso = assenza di banda IBRIDI?? A. baerii X A. ruthenus Risultato ottenuto = A. ruthenus 8

9 Advantages of SNPs Very frequent Present in all genome regions High reproducibility Co-dominant markers Limits of SNPs Prior information about the species is required Cross application between species is limited. Ex novo discovery of loci is often needed. Limited number of alleles 9

10 A. baerii A. gueldenstaedtii A. transmontanus A. fulvescens A. sinensis A. ruthenus STORIONI H. huso A. naccarii A. sturio A. stellatus INTRODUZIONE PHILUM: Cordati Inquadramento sistematico SUBPHILUM: Vertebrati CLASSE: Osteitti SOTTOCLASSE: Attinopterigi SUPERORDINE: Condrostei ORDINE: Acipenseriformi FAMIGLIA: ACIPENSERIDI SOTTOFAMIGLIA: ACIPENSERINI GENERI: Acipenser Huso SOTTOFAMIGLIA: SCAFIRINCHINI GENERI: Scaphirhinchus Pseudoscaphirhynchus 10

11 INTRODUZIONE Emisfero boreale Distribuzione Gli Acipenseridi sono formati da circa 25 specie di storione INTRODUZIONE CARIOTIPO Storioni e particolarità 120 DIPLOIDI TETRAPLOIDI 240 TETRAPLOIDI OTTOPLOIDI ANADROMI IBRIDAZIONE INTERSPECIFICA 120 X X X 240? 11

12 INTRODUZIONE Carne Gelatina CAVIALE Uova fecondate Avannotti Il mercato degli storioni Individui adulti Allevamento Beluga Osietra Sevruga Commercio alimentare Pesca sportiva INTRODUZIONE CAVIALE Il mercato degli storioni Diminuzione della dimensione delle popolazioni naturali Commercio internazionale Eccessivo sfruttamento della risorsa Aumento dei prezzi dei prodotti di storione 12

13 INTRODUZIONE Conservazione SALVAGUARDIA DELLE POPOLAZIONI COMMERCIO COMMERCIO DICHIARATO COMMERCIO CLANDESTINO BRACCONAGGIO MERCATI INTERNI Overfishing Dams Pollution 13

14 STORIONI Actynopterygii, Chondrostei, Acipenseriformes, Acipenseridae. 25 specie di pesci anadromi o di acqua dolce. Economicamente importanti: caviale, carne e filetti affumicati. Di crescente interesse per l acquacoltura. A forte rischio di estinzione IUCN Red List (International Union for Conservation of Nature) include tutte le specie di storione. CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) Controlli e restrizioni su commercio, import/export, e reintroduzioni. 14

15 Storione Cobice (Acipenser naccarii) Specie endemica del bacino Adriatico Ufficialmente anadromo ma tendenzialmente potamodromo Tetraploide (240 cromosomi) Seminari di Dipartimento 19/02/2009? C è un unica popolazione Adriatica? C è struttura di popolazione Quali sono le «conservation units»? 15

16 Definizione delle unità di gestione Sviluppo e Applicazione di marcatori microsatellite. Sequenziamento della regione di controllo del DNA mitocondriale. AFLP 8 loci 5 tipizzati su N. naccarii (FIASCO) 3 tipizzati su A. fulvescens (letteratura) Campioni analizzati 31 individui italiani 17 individui albanesi (Buna river) 16

17 Microsatelliti (Analisi fenotipica) Fiume Po Fiume Buna Po river Buna river 17

18 DNA mitocondriale 31 individui italiani 17 individui albanesi (Buna river) 3 aplotipi di Acipenser gueldenstaedtii Intera regione di controllo DNA mitocondriale (d-loop) Buna Po2 Po1 INTROGRESSIONE? A. gueldenstaedtii 18

19 Azienda agricola VIP (Orzinuovi, Brescia) Giacinto Giovannini and sons : initial farming of wild Adriatic sturgeons : first successful reproduction : first restocking / reintroduction program Present stock: 24 A. naccarii of wild origin. High mortality!!! (9 animals died in 2005/06) No information is available about the presence of additional individuals (of wild origin) in the wild. So far reproductions and releasing have been conducted without any support by genetic analyses and most of the animals released are probably strictly related (brothers and sisters) 19

20 42 individui di origine selvatica (F0) Lo stock è attualmente composto da 24 individui 150 individui di F1-50 Treviso (TV) - 50 Piacenza (PC) - 50 Orzinuovi (VIP) VIP TV PC 1) Verificare il grado di diversità disponibile nei 3 stock di F1 rispetto agli individui di origine selvatica 2) Cercare di stabilire il grado di parentela tra i diversi potenziali riproduttori 3) Riassumere le informazioni in modo utile per gli operatori DNA mitocondriale La frequenza delle diverse varianti mitocondriali è molto alterata negli stock di F1 rispetto agli F0 Alcune varianti mitocondriali sono assenti SELVATICI TREVISO PIACENZA Orzinuovi (VIP) orz1 orz5 orz14 orz TV1 TV3 Piac48 Piac50 orz18 orz22 orz37 orz TV4 TV7 Piac46 Piac45 orz41 orz45 orz56 orz TV8 TV11 Piac42 Piac41 orz91 orz92 orz114 orz115 TV12 TV13 Piac40 Piac39 orz118 orz122 orz129 orz130 TV14 TV15 Piac27 Piac28 orz134 orz136 orz142 orz148 TV16 TV17 Piac30 Piac31 orz149 orz150 orz153 orz157 TV18 TV20 Piac33 Piac34 orz162 orz163 orz165 orz169 TV21 TV22 Piac36 Piac37 orz170 orz171 orz173 orz175 TV23 TV24 Piac38 Piac26 orz176 orz177 orz178 orz182 TV25 TV26 Piac1 Piac2 orz196 orz198 orz209 orz210 TV27 TV28 Piac3 Piac5 orz212 orz214 TV29 TV30 Piac6 Piac9 TV31 TV32 Piac14 Piac16 TV33 TV35 Piac17 Piac18 TV37 TV38 Piac19 Piac20 TV39 TV40 Piac21 Piac22 TV41 TV42 Piac23 Piac24 TV43 TV45 Piac25 TV46 TV48 TV49 TV50 TV F0 TV PC VIP TV2 TV6 Piac7D Piac11 orz188 orz190 orz TV10 TV34 Piac43 Piac TV5 TV TV Piac4 Piac8 Piac13 Piac15 Piac29 Piac32 Piac35 Piac TV9 TV orz181 20

21 DNA nucleare (MICROSATELLITI) Come per il DNA mitocondriale, la composizione genetica degli stock di F1 analizzati non è rappresentativa di quella osservata nello dello stock di origine selvatica nemmeno a livello di DNA nucleare 40,0 30,0 % 20,0 10,0 0,0 Locus An16 Selvatici Vivi Piacenza Treviso VIP Le frequenze delle varianti alleliche sono molto diverse tra F0 e F1 Entrando nel dettaglio dei singoli individui Rappresentazione bidimensionale delle distanze genetiche tra individui 2,0 MDS, stress = ,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2,0-1,5-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 21

22 Use of microsatellite for parental allocation and genetic tagging. Adopted criteria: All the possible pairs of putative parents were combined in cumulative moltilocus profiles Cumulative profiles were compared with F1 profiles Only the parental pair that match all the F1 bands are considered to be compatible Cumulative Dam profile F1 profile Sire COMPATIBLE NOT COMPATIBLE 43 Risultati delle analisi di parentela / Genetic tagging INDIVIDUI F1 Risultato allocazione INDIVIDUI F1 Risultato allocazione PC01 PC02 PC03 PC05 PC06 PC09 PC14 PC16 PC17 PC18 PC19 PC20 PC22 PC23 PC24 PC26 PC27 PC30 PC31 PC33 PC34 PC36 PC37 PC38 PC39 PC40 PC41 PC45 PC46 PC48 PC50 TV03 TV04 TV08 TV13 TV18 TV21 TV25 TV28 OR134 OR136 OR142 OR148 OR153 OR157 OR162 OR163 OR165 OR169 OR170 OR171 OR177 OR178 OR196 OR198 Matto( ) X naccs8( ) PC21 PC25 PC42 TV07 TV11 TV12 TV14 TV15 TV16 TV17 TV19 TV20T V22 TV23 TV24 TV26 TV27 TV29 TV30 TV31 TV32 TV33 TV35 TV37 TV38 TV39 TV40 TV41 TV42 TV43 TV45 TV46 TV48 TV49 TV50 OR1 OR5 OR14 OR17 OR18 OR22 OR37 OR38 OR41 OR45 OR56 OR85 OR91 OR92 OR114 OR115 OR118 OR122 OR129 OR130 NaccS18( ) X Pelvienne( ) PC04 PC08 PC13 PC15 PC29 PC32 PC35 PC47 naccs13( ) X naccs15( ) TV44 OR175 Matto( ) X O2( ) naccs31 X naccs8 PC07 PC011 PC43 PC44 TV02 TV05 TV06TV10 TV34 TV36 TV47 OR188 OR190 OR203 naccs6( ) X naccs7( ) OR181 TV01 naccs13 X ditata Matto( ) X Pelvienne( ) PC28 TV09 OR149 OR150 OR173 OR176 OR182 OR208 OR210 OR212 OR214 NESSUN INCROCIO COMPATIBILE 22

23 Risvolti applicativi Allo scopo di rendere utilizzabili le informazioni raccolte è stato condotto un ulteriore analisi per valutare se fosse possibile individuare delle combinazioni di individui il cui incrocio potesse ritenersi: INOPPORTUNO, SCONSIGLIATO o OPPORTUNO A questo scopo sono stati considerati gli individui con grado di parentela noto (studi precedenti) o dedotto (presente progetto): fratelli fratellastri genitori-figli presumibilmente non imparentati e ne è stata stimata la distanza genetica a coppie Frequenza 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0,28 0,32 0,36 0,4 0,44 0,48 0,52 0,56 0,6 0,64 0,68 0,72 0,76 0,8 0,84 0,88 0,92 0,96 1 Fratelli Fratellastri Genit-figli Selvatici Selv. vivi Distribuzione delle distanze genetiche a coppie per diversi gradi di parentela 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 Distanze genetiche (1-Band Sharing) Questi valori individuano le distanze genetiche al di sotto delle quali è possibile escludere con una accuratezza del 99% il grado di parentela corrispondente Frequenza Cumulativa 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,04 0,12 0,2 0,28 0,36 0,44 0,52 0,6 0,68 0,76 0,84 0,92 1 Distanza Genetica (1-Band-Sharing) Fratelli Fratellastri Genit-Figli Selvatici Selvatici vivi 23

24 Creazione di progenie virtuali con diversi gradi di parentela Distribuzione delle distanze a coppie per i diversi gradi di parentela Confronto con le distribuzioni osservate Frequence 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 full sibs half sibs unrelated virtual full sibs virtual half sibs virtual unrelated 0,05 0 0,04 0,12 0,2 0,28 0,36 0,44 Pairwise Distance 0,52 0,6 0,68 0,76 0,84 0,92 1 Analisi delle modalità di segregazione disomica o tetrasomica? AoxD234 Stabilire un criterio per la creazione di progenie virtuali Avanzare ipotesi sull origine della tetraploidia in A. naccarii AUTOTETRAPLOIDE - ALLOTETRAPLOIDE 24

25 a a maternal b alleles c were d found in b Parents All the possible combination of 16 F1 individuals, showing a tetrasomic inheritance. F1 a a The first of the paternal d alleles was never found in homozygosis suggesting an unbalanced callele dosage (ABBB) b c c Unreliability of the allele dosage based on band intensities d SO after having understood what segregation pattern to use for the creation virtual profile AND after having confirmed the observed distribution of genetic distances in different groups of relatedness we tried to set up a Practical tool for the selection of breeders to be paired in artificial reproductions. All pairwise genetic distances of possible breeders were estimated and organized in a matrix in which, based on the above threshold values, the possible pairings were highlighted as TO BE AVOIDED,, TO BE AVOIDED (if possible) or ALLOWED 50 25

26 chip n.seriale PC01 PC02 PC03 PC04 PC05 PC06 PC07 PC08 PC09 PC11 PC13 Matrix of genetic distances among pairwise F1 individuals PC PC02 0, PC03 0,25 0, PC04 0,44 0, , PC05 0,36 0,25 0, , PC06 0, ,28 0, ,52 0, PC07 0, ,68 0, ,52 0,68 0, PC08 0, , ,52 0, , , , PC09 0, , ,36 0, , , , , PC11 0, ,76 0, ,52 0,68 0, , , , PC13 0,52 0, , , , ,44 0,6 0, , , PC14 0,2 0, , , , ,36 0,68 0, , ,84 0, Probably unrelated (allowed) Possible half sibs (to be avoided if possible) Possible full sibs (to be avoided) Mitochondrial haplotype Microchip code 51 Caratterizzazione delle F1 e ricostruzione del pedigree Risultati /10 loci microsatellite dloop mitocondriale ALLOCAZIONE PARENTALE Potere di allocazione 85/95% 26

27 3/18/2014 Di 445 individui F allocati a 30 famiglie 1 multi allocato 64 non allocati Fratellastri 0,58 0,66 Non imparentati Fratelli Valori soglia di distanza genetica oltre i quali un certo grado di parentela può essere significativamente escluso 27

28 3/18/2014 Due famiglie di fratelli Concludendo... Lo stock F1 è composto da più di 30 famiglie I non allocati rappresentano nuova variabilità rispetto agli F0 Almeno 1 dei due genitori non è in nostro possesso Del gruppo di individui parentali, 18 su 45 sembrano non essersi riprodotti Saranno considerati prioritari nei futuri piani di riproduzione Lo stock F1 dovrà essere utilizzato per ogni futura attività di pianificazione di incroci 28

29 Popolazione rilasciata nel fiume Ticino Di 116 individui F allocati 1 multi allocato 38 non allocati 29