Pacemaker biologico: Cellule staminali embrionali murine Vs Cellule staminali cardiache adulte

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI MILANO Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Laboratorio di Fisiologia Molecolare e Neurobiologia Dottorato di Ricerca in Scienze Fisiologiche XX ciclo (Bio/09) Pacemaker biologico: Cellule staminali embrionali murine Vs Cellule staminali cardiache adulte Docente responsabile: Chiar.mo Prof. Dario DIFRANCESCO Coordinatore del Dottorato: Chiar.mo Prof. Paolo CAVALLARI Tesi di Dottorato di Ricerca Dott.ssa Alessia CRESPI Anni Accademici

2 Alla mia famiglia, a Matteo, e a Chiara Grazie per tutto l Amore e il sostegno che mi avete dato in questi anni.

3 INDICE INTRODUZIONE 5 Il Cuore 5 Embriologia del cuore 5 Il sistema di conduzione 6 Il potenziale d azione cardiaco 9 Corrente I f 11 Modulazione da parte del sistema nervoso autonomo 12 Canali HCN 14 Cellule staminali 20 Cellule staminali embrionali 20 Cellule staminali adulte 24 Patologie cardiache e Terapia cellulare 27 Cardiopatie ischemiche 27 Patologie a carico della generazione e conduzione dell impulso elettrico 30 Pacemaker elettronico e Pacemaker biologico 33 Pacemaker elettronico 33 Pacemaker biologico 34 SCOPO DEL LAVORO 39 MATERIALI E METODI 40 Cellule staminali embrionali murine 40 Coltura di cellule staminali embrionali murine 40 Differenziamento di cellule ES-D3 in cardiomiociti 41 Isolamento delle aree contrattili degli EBs 44 Estrazione dell RNA totale da cellule con l utilizzo del TRIzol Reagent 44 Trattamento degli estratti con DNase I (Fermentas) 46 RT-PCR 46 PCR (Polymerase Chain Reaction) 47 Elettroforesi su gel di agarosio 49 Analisi elettrofisiologiche 49 Protocolli ed analisi dei dati 50 Analisi di immunofluorescenza 50 Mesoangioblasti 53 Isolamento di mesoangioblasti da vasi di ventricolo murino 53 Citometria a flusso 53

4 RT-PCR 55 Costruzione del vettore plasmidico e trasfezione dei mesoangioblasti 55 Analisi di immunofluorescenza 56 Analisi elettrofisiologica 58 Analisi dei dati 59 RISULTATI 61 Cellule staminali embrionali murine 61 Mesoangioblasti 80 DISCUSSIONE 96 BIBLIOGRAFIA 108

5 Embriologia del cuore INTRODUZIONE Il Cuore Introduzione Il cuore deriva embriologicamente dal mesoderma e lo si può considerare un tratto morfologicamente differenziato di un primitivo vaso sanguigno situato ventralmente al tubo digerente e deputato alla propulsione del sangue in direzione caudo-cefalica. Nell uomo i primi abbozzi compaiono durante la terza settimana di sviluppo dell embrione prima della delimitazione nella regione cefalica (processo che porta all avvolgimento dell embrione su se stesso sia in senso latero-laterale che cranio-caudale in modo tale che da struttura piana esso divenga tubulare e chiuso). Alcuni angioblasti del mesenchima, interposto tra la splancnopleura e l entoderma della faringe, che inizialmente si trovavano ammassati in modo irregolare (Figura 1A), progressivamente si organizzano a delimitare i tubi endocardici destro e sinistro (Figura 1B). Da questi angioblasti si origina l endotelio della parete dei due tubi endocardici che confluiscono nell unico tubo cardiaco dopo 22 giorni dalla fecondazione dell oocita (Figura 1C e D). Successivamente la splancnopleura si ispessisce e circonda il primitivo tubo cardiaco formando il miocardio. L epicardio deriva dall epitelio celomatico che, dai margini dell abbozzo del miocardio, progressivamente si estende a rivestire l abbozzo stesso. Si forma così la prima struttura in grado di contrarsi. Figura 1: Sviluppo embriologico del primitivo tubo endocardico. Allungandosi in misura maggiore rispetto alla cavità pericardica in cui è accolto, il primitivo tubo cardiaco, dapprima rettilineo, si incurva a S, sia sul piano frontale che sagittale, così che la porzione caudale viene a porsi dorsalmente alla porzione cefalica. Recenti lavori hanno 5

6 Introduzione dimostrato che durante questo processo di torsione vengono reclutate cellule che, proliferando, andranno a formare inizialmente una successione caudo-cefalica di quattro dilatazioni ampollari: il seno venoso, cui arriva il sangue refluo da tutto il corpo dell embrione, l atrio, il ventricolo e il bulbo cardiaco. In seguito le quattro cavità continueranno a maturare fino ad assumere la corretta morfologia nel muscolo cardiaco (Figura 2). Figura 2: Sviluppo del primitivo tubo cardiaco. Il sistema di conduzione Il cuore è un organo posto nella cavità toracica, costituito pressoché esclusivamente da tessuto muscolare striato, supportato da una struttura fibrosa detta pericardio. La parete del cuore è costituita da tre tuniche: Endocardio, che tappezza la cavità cardiaca ed è costituito da una sottile lamina connettivale rivestita, verso il lume, da cellule endoteliali: ha la funzione di favorire lo scorrimento del sangue all interno del cuore per evitarne i coaguli; Miocardio, formato da fibrocellule muscolari cardiache ordinatamente orientate in modo da permettere la corretta contrazione; Epicardio, costituito da un sottile strato di connettivo lasso e contenente capillari sanguigni, capillari linfatici e fibre nervose. È l'organo centrale dell'apparato circolatorio, funge da pompa capace di produrre una pressione sufficiente a permettere la circolazione del sangue. Il cuore è un organo autoritmico e quindi non necessita dell innervazione per contrarsi, presenta infatti un sistema di generazione e di conduzione dell impulso che permette l eccitazione prima degli atri e poi dei ventricoli, con modi, tempi e velocità opportuni per permettere al cuore di svolgere correttamente la sua 6

7 Introduzione funzione di contrazione (sistole) e dilatazione (diastole). Le cellule muscolari cardiache sono organizzate a formare un sincizio grazie alla presenza di estesi complessi giunzionali, detti dischi o strie intercalari, che ne connettono le estremità adiacenti. I complessi giunzionali, oltre che da desmosomi e fasciae adhaerentes, sono rappresentati anche da gap junctions, sede della propagazione dell impulso elettrico da una fibra all altra. L insieme di queste giunzioni assicura la coesione elettrica e meccanica tra le fibre che compongono il miocardio per facilitare la propagazione dell eccitamento. Dal punto di vista fisiologico e funzionale, è possibile suddividere il cuore in due distretti fondamentali: il miocardio di lavoro, che costituisce la parte muscolare e fibrosa del cuore, formato prevalentemente da cellule muscolari, e il tessuto di conduzione (Figura 3), di origine nervosa, che assicura la propagazione dell impulso nervoso a tutto il muscolo cardiaco. Si tratta di un sistema specializzato del cuore che permette, in condizioni normali, che il cuore batta in maniera efficiente ed ordinata (prima gli atri, poi i ventricoli permettendo il completo riempimento di questi ultimi) e che l'impulso generato si diffonda velocemente, facendo contrarre tutte le parti del ventricolo in maniera pressoché simultanea. Figura 3: Struttura del cuore e schema del tessuto di conduzione cardiaco in una sezione longitudinale del cuore umano. (da Questo sistema è formato da diverse parti: Il nodo seno-atriale (S-A): si tratta di una piccola e appiattita striscia elissoidale larga circa 3 mm, lunga 15 mm e spessa 1 mm, che si trova nella parete posteriore dell'atrio destro subito sotto allo sbocco della vena cava superiore ed è noto anche come pacemaker 7

8 Introduzione naturale del cuore. Le fibre del nodo seno-atriale hanno un diametro variabile tra i 3 e i 5 mm, mentre le fibre circostanti sono delle dimensioni di una decina di micrometri. In questo nodo si genera il normale impulso ritmico, per fare in modo che l'impulso venga trasmesso alle fibre atriali, le fibre del nodo SA si connettono direttamente con quelle atriali; il potenziale d'azione si diffonde, così, in maniera simultanea negli atri. Le vie internodali: si tratta di una striscia di tessuto di conduzione che deve condurre il segnale verso il nodo atrioventricolare. Il nodo atrio-ventricolare (AV): situato nella parte posteriore destra del setto interatriale, è il principale responsabile del ritardo nel passaggio del segnale dagli atri ai ventricoli; rappresenta l unico punto di connettività elettrica tra atri e ventricoli. Le fibre del Fascio di His si estendono nella parte membranosa del setto interatriale e propagano l'impulso alla massa cardiaca ventricolare, dividendosi in due branche, destra e sinistra. La branca sinistra possiede due fascicoli, anteriore, più spesso, e posteriore, più sottile. Parte terminale del sistema di conduzione del cuore sono le fibre del Purkinje, cellule cardiache con conducibilità maggiore dei cardiomiociti. La principale particolarità del miocardio specifico consiste nella possibilità di generare autonomamente gli impulsi elettrici: in pratica la centrale pacemaker principale si trova nel nodo seno-atriale, ma non è l'unica presente nel miocardio: anche altri distretti cardiaci, quali il Nodo Atrio Ventricolare e le Fibre del Purkinje sono in grado di generare spontaneamente potenziali d azione. È stato possibile apprezzare questo escludendo dalla conduzione il nodo SA: il cuore continua a battere, anche se a ritmi notevolmente inferiori (40/60 impulsi al minuto, contro i normali 60/100) e il ritmo che si impone è detto "non sinusale" perché ha origine al di fuori del nodo del seno. Questo meccanismo può essere spiegato come una sorta di autoprotezione da parte del cuore, esistono infatti patologie a causa delle quali viene bloccata la conduzione del nodo SA. In questo caso, il cuore può continuare a battere poiché il nodo AV comincia a dettare il passo del ritmo (con frequenza minore) e la situazione è compatibile con la vita. Questo fenomeno viene definito overdrive suppression, in quanto il nodo senoatriale è in grado di generare potenziali d azione con una frequenza più elevata, che copre quella degli altri pacemaker cardiaci ausiliari: per questo motivo viene definito pacemaker naturale del cuore, in quanto i miociti senoatriali, formando un sincizio funzionale, sono accoppiati elettricamente, per cui quelli dotati di una frequenza più elevata impongono il proprio ritmo. Nell uomo l impulso elettrico che nasce dal nodo seno-atriale stimola il cuore ad una frequenza di circa 70 battiti/minuto in condizioni di riposo, si propaga agli atri provocandone la contrazione e, 8

9 Introduzione attraverso le vie internodali, raggiunge il nodo atrio-ventricolare (nodo AV) dove subisce un leggero ritardo (circa 0.1 ms -1 ). Il ritardo di trasmissione dell impulso è indispensabile per un perfetto rendimento della pompa cardiaca, in questo modo gli atri hanno il tempo necessario per svuotare il loro contenuto nei ventricoli prima dell inizio della contrazione ventricolare. L impulso elettrico percorre il fascio di His, che si divide in una branca destra e una sinistra, e raggiunge i rami terminali, chiamati fibre di Purkinje, che conducono l impulso rapidamente fino ai ventricoli che si contraggono. Il potenziale d azione cardiaco Le cellule cardiache esprimono un notevole numero di canali ionici voltaggio-dipendenti e non, con caratteristiche cinetiche diverse che, a seconda del distretto cardiaco in cui sono espressi, generano potenziali d azione dalle forme molto diverse e con diverse conseguenze funzionali (Figura 4). Figura 4: Schema della distribuzione dei potenziali d azione nei diversi distretti cardiaci. (da La particolarità che contraddistingue il potenziale d azione delle cellule autoritmiche da quello delle altre cellule cardiache è l assenza di una fase di riposo stabile tra un potenziale d azione e l altro. I miociti con attività autoritmica presentano una fase di depolarizzazione diastolica lenta 9

10 Introduzione che conduce il potenziale di membrana verso il valore soglia per l insorgenza di un nuovo potenziale d azione. Nelle cellule cardiache non autoritmiche alla fine di un potenziale d azione, durante la fase 4 (Figura 5A), il potenziale di membrana rimane stabile intorno a valori di riposo di -75 mv per l intervento della corrente I K1, una corrente di K + rettificante entrante, che risulta invece assente nelle cellule pacemaker (Figura 5B). A 1 2 B Figura 5: Esempio di un potenziale d azione di una cellula ventricolare in A e di una cellula senoatriale in B. Nei miociti senoatriali, la fase 0 del potenziale d azione è determinata dall apertura dei canali di calcio di tipo L e non da quelli del sodio come avviene nei miociti ventricolari. Inoltre la fase 1 e la fase 2, che nelle cellule ventricolari rappresentano, rispettivamente, un primo breve periodo di ripolarizzazione ed il plateau, non sono presenti. L assenza della fase 2 è dovuta al fatto che i canali di calcio in questa fase sono già inattivi e l apertura dei canali di potassio conduce il potenziale di membrana verso valori più iperpolarizzati. L attività spontanea di tali cellule deriva da una tipica fase del loro potenziale d azione definita depolarizzazione diastolica lenta (fase 4) che è successiva al raggiungimento del massimo potenziale diastolico (MDP). Questa fase non mantiene il potenziale di membrana ad un valore di riposo, ma provoca una lenta e spontanea depolarizzazione che porta il potenziale di membrana fino al valore soglia necessario per la generazione di un nuovo potenziale d azione. L assenza di una fase di riposo stabile induce così un attività ripetitiva e autoritmica. Nella fase di depolarizzazione pacemaker delle cellule senoatriali un ruolo fondamentale è svolto dalla corrente I f, una corrente voltaggio e tempo dipendente che si attiva alla fine della ripolarizzazione del potenziale di azione (fase 3), con una soglia di circa -45 mv [1]. Verso la fine della fase 4, a valori di circa -50 mv, si attivano i canali di calcio di tipo T e L che accelerano la depolarizzazione e sono responsabili dell upstroke del potenziale d azione (fase 0). In generale, il potenziale d azione senoatriale viene definito come 10

11 Introduzione lento in quanto mancano i canali del Na + rapidi che danno origine alla fase di depolarizzazione veloce (fase 0) dei miociti atriali e ventricolari; è stato però dimostrato che nei miociti senoatriali di topo durante la fase 0 sono coinvolti anche i canali di Na. Inoltre la fase 1 e la fase 2, che nelle cellule ventricolari rappresentano, rispettivamente, un primo breve periodo di parziale ripolarizzazione e il plateau, non sono presenti nei miociti senoatriali. Durante la fase 3 si attivano i canali di potassio rettificatori ritardati che conducono le correnti uscenti, I Kr e I Ks, che non essendo più bilanciate dalle correnti entranti di calcio ripolarizzano la membrana. Corrente If Tra le varie conduttanze ioniche implicate nel potenziale d azione, la corrente I f, o corrente pacemaker o corrente funny, svolge un ruolo fondamentale nella genesi spontanea del potenziale stesso, ovvero nella fase di depolarizzazione diastolica lenta [2]. La corrente I f è una corrente mista di sodio e potassio che si attiva in iperpolarizzazione con un potenziale d inversione intorno ai -15 mv, risultando quindi entrante durante la fase pacemaker e di conseguenza in grado di depolarizzare la cellula verso il valore soglia (Figura 6). Un altra caratteristica di questa corrente è il blocco parziale da ione Cesio (Cs +, [3]. La corrente I f è inoltre voltaggio e tempo dipendente [2] ed è modulata direttamente dall adenosina monofosfato ciclico (AMPc) [4]. La bassa soglia di attivazione (circa -40 mv) che tale corrente presenta nei miociti senoatriali è uno dei motivi della loro maggiore frequenza di contrazione e di conseguenza del fenomeno di overdrive suppression. B 0 pa -35 s Figura 6: Tracce di corrente I f registrate a potenziali diastolici. Durante lo sviluppo embrionale e neonatale del cuore, i canali responsabili della corrente I f sono funzionalmente espressi anche nei miociti programmati per svilupparsi nelle cellule del 11

12 Introduzione miocardio di lavoro (miociti atriali e ventricolari). Tuttavia, negli stessi miociti adulti, non è evidente un ruolo fisiologico della I f. Questo accade sia perché la densità dei canali è bassa, sia perchè l attivazione della corrente avviene a potenziali troppo negativi (-120/-150 mv) e quindi al di fuori dei potenziali fisiologici [5]. Di conseguenza, sia i miociti ventricolari che quelli atriali non sono dotati di attività autoritmica in condizioni normali. Modulazione da parte del sistema nervoso autonomo L attività cardiaca viene finemente regolata dal Sistema Nervoso Autonomo (SNA). In particolare il nodo senoatriale, in quanto sede di generazione dell impulso, è il sito di regolazione della frequenza cardiaca. Esso è infatti riccamente innervato dalle terminazioni nervose del Sistema Nervoso Autonomo, sia Simpatico che Parasimpatico, che esercitano, rispettivamente, un effetto cronotropo positivo e negativo. L innervazione simpatica e parasimpatica agiscono sulle cellule cardiache rispettivamente mediante recettori β-adrenergici e colinergici muscarinici. I neurotrasmettitori agiscono sulla I f modulando la concentrazione citoplasmatica del secondo messaggero AMPciclico (nucleotide ciclico adenosin-monofosfato) [6]. Entrambi i recettori sono accoppiati a G-proteine le cui subunità αβ sono in grado di interagire direttamente con l adenilato ciclasi modificandone l attività (Figura 7). ACh NA canale f Gi recettore muscarinico AC Gs recettore β-adrenergico ATP AMPc Figura 7: Modulazione del canale f da parte dell AMP ciclico (AMPc); vie di trasduzione del segnale accoppiate al recettore β-adrenergico e al recettore muscarinico che determinano la variazione dei livelli di AMPc e, di conseguenza, la modulazione del canale pacemaker nei miociti senoatriali. ACh, acetilcolina; NA, noradrenalina; AC, adenilato-ciclasi; Gi, G-protein inibitoria; Gs, G-protein stimolatoria. 12

13 Introduzione Il Sistema Simpatico tramite le G-protein stimolatorie (Gs) causa un aumento di concentrazione di AMPc intracellulare, mentre il Sistema Parasimpatico tramite le G-proteine inibitorie (Gi) ne determina la diminuzione. Gli effetti cronotropi della stimolazione β-adrenergica e di quella colinergica muscarinica possono essere riprodotti in cellule senoatriali isolate, che mantengono la capacità di battere spontaneamente. Quando si applicano basse dosi di agonisti β-adrenergici o di acetilcolina, la frequenza spontanea subisce una accelerazione o un rallentamento, dovuti, rispettivamente, all aumento o alla diminuzione della pendenza della depolarizzazione diastolica, con piccole variazioni nella forma o nella durata del potenziale d azione, suggerendo uno specifico coinvolgimento della corrente I f nella modulazione della pendenza della depolarizzazione diastolica da parte dei neurotrasmettitori (Figura 8A). Un incremento dei livelli basali intracellulari di AMPc promuove l interazione diretta del secondo messaggero con il canale f [4] attraverso un meccanismo indipendente da processi fosforilativi. Questa molecola agisce sul canale f determinandone un aumento della probabilità di apertura senza modificarne la conduttanza [7]. L aumento di AMPc si traduce quindi in una maggiore probabilità di apertura dei canali pacemaker a parità di potenziale; al contrario, la diminuzione del secondo messaggero ne provoca una minore attivazione. A B Figura 8: Regolazione autononomica della corrente f. A: modulazione dell attività pacemaker: l attività spontanea di una singola cellula senoatriale è accelerata dall isoprenalina (0.01µM) e rallentata da acetilcolina (0.003µM); tali neurotrasmettitori causano la modificazione della fase di depolarizzazione diastolica lenta. B: la stimolazione β-adrenergica e muscarinica aumentano e diminuiscono la quantità di corrente I f disponibile per la depolarizzazione diastolica spostando la curva d attivazione verso potenziali più positivi o negativi, rispettivamente. L AMPc intracellulare agisce come secondo messaggero determinando un spostamento depolarizzante della curva di attivazione dell I f. In particolare la stimolazione colinergica, diminuendo la produzione di AMPc, sposta la curva di attivazione verso valori di voltaggio più 13

14 Introduzione negativi diminuendo la corrente attivata ai potenziali diastolici e rallentando di conseguenza la depolarizzazione diastolica; la stimolazione β-adrenergica determina il meccanismo opposto, aumentando così la pendenza della depolarizzazione diastolica (Figura 8B). Canali HCN I costituenti molecolari delle correnti cationiche attivate in iperpolarizzazione appartengono ad una famiglia di canali denominati HCN (Hyperpolarization-activated, Cyclic Nucleotide-gated channels) che comprende 4 isoforme: HCN1, HCN2, HCN3 e HCN4 [8],[9],[10],[11]. Queste presentano diversità sia dal punto di vista elettrofisiologico (cinetica, voltaggio dipendenza e risposta all AMPc) sia dal punto di vista della distribuzione tissutale. Lo studio della sequenza amminoacidica e del profilo idrofobico ha permesso di classificare i canali HCN come appartenenti alla famiglia dei canali a 6 segmenti transmembrana, insieme ai canali di K + voltaggio dipendenti (K v Voltage Shaker) e ai canali nucleotidi ciclici dipendenti (CNG channels). Analogamente agli altri membri della famiglia di canali di K + voltaggio-dipendenti, i canali HCN si assemblano a formare dei complessi tetramerici [12], [13]. In figura 9 è mostrata la struttura di una subunità dei canali HCN. Figura 9: Struttura dei canali HCN. Rappresentazione di una singola subunità dei canali HCN. I 6 cilindri indicano i segmenti transmembrana; S4 è indicato come il sensore del voltaggio; il loop tra S5 e S6 come la regione del poro. A livello del C-terminale è indicato il sito di legame per i nucleotidi ciclici (CNBD). Nella parte inferiore è mostrato il tetrametro formato dalle 4 subunità, inserito nella membrana plasmatica. (da [14]). 14

15 Introduzione Ciascuna subunità comprende 6 segmenti transmembrana (S1-S6), di cui il segmento S4, carico positivamente, rappresenta il sensore del voltaggio e il loop tra i segmenti S5 e S6 forma la regione del poro: infatti il linker S5-S6 esibisce la sequenza amminoacidica GYG, sequenza firma dei canali selettivi per il potassio [15], [14]. A valle della sequenza GYG il canale presenta una serie di amminoacidi differenti rispetto ai canali di potassio (due residui carichi positivamente e una Istidina in più) che sono stati dimostrati essere responsabili dell elevata permeabilità al sodio che lo contraddistingue [16]. Le estremità C ed N terminali sono intracitoplasmatiche; la porzione carbossiterminale mostra un dominio di 120 amminoacidi indicato come Cyclic Nucleotide Binding Domain (CNBD) in quanto rappresenta il sito di legame per i nucleotidi ciclici. Il CNBD è omologo a regioni simili in altre proteine che legano nucleotidi ciclici, incluse le proteinkinasi AMPc e GMPc dipendenti. Il canale funzionale è un complesso multimerico formato da quattro subunità [13]. Differenze strutturali. Le varie isoforme di canali HCN sono altamente conservate tra loro nelle regioni transmembrana S1-S6, con un livello di identità aminoacidica pari ad 80-90%, mentre, se si esclude la regione del CNBD, le sequenze dei carbossi e amino terminali variano considerevolmente sia per la lunghezza, sia per la sequenza primaria. Tale osservazione suggerisce che queste regioni possano essere responsabili delle differenze nelle proprietà biofisiche tre le varie isoforme (Figura 10). Figura 10: Struttura complessiva dei quattro membri della famiglia di canali HCN. I sei segmenti transmembrana sono numerati 1-6; P e CNBD indicano rispettivamente la regione del poro e il dominio di legame ai nucleotidi ciclici. [11]. Differenze funzionali. Quando espresse in sistemi eterologhi come oociti di Xenopus o cellule HEK 293, le isoforme HCN mostrano proprietà caratteristiche della corrente I f nativa, come l attivazione in iperpolarizzazione, la permeabilità ad entrambi gli ioni sodio e potassio 15

16 Introduzione (conduzione di ioni Na + e K + (rapporto di permeabilità P Na /P K di circa 0.2), la modulazione da parte dei nucleotidi ciclici e il blocco da parte dello ione Cs + [17], [18], [10], [19], [9]. Una significativa variabilità è mostrata invece nella cinetica di attivazione/deattivazione, come pure nella sensibilità alla modulazione da parte dei nucleotide ciclici. Le isoforme HCN possono essere classificate sulle basi delle loro rispettive cinetiche di attivazione. L isoforma HCN1 è il canale che si attiva più velocemente con una costante di tempo di attivazione di circa ms [10]; [20], seguita dalle isoforme HCN2 e HCN3 (range ms). L isoforma più lenta è HCN4 con una costante di attivazione compresa tra poche centinaia di ms, quando il potenziale di membrana è fortemente iperpolarizzato (ad esempio -140 mv), fino a diversi secondi, a voltaggi più depolarizzati (-70 mv) [17], [21], [22]. Le correnti prodotte dall espressione di HCN1, HCN2, e HCN4 sono attivate in iperpolarizzazione, ma hanno differenti cinetiche di attivazione e di deattivazione con HCN1 più veloce, seguito da HCN2 e HCN4. L analisi delle curve d attivazione (Figura 11) mostra invece una posizione più iperpolarizzata per HCN2 (V 1/2 di -92 mv) seguita da HCN4 (V 1/2 di -84 mv) e da HCN1 (V 1/2 di -73mV) [23]. mhcn3 Figura 11: Differenze elettrofisiologiche delle isoforme HCN. Caratteristiche cinetiche delle diverse isoforme degli HCN espresse in cellule HEK-293. In alto: per mhcn1, hhcn2 e hhcn4 le tracce di corrente sono state registrate ai potenziali indicati partendo da un potenziale di riposo di -35mV; per mhcn3 le correnti sono state registrate partendo da un potenziale di riposo di -40 mv fino ad arrivare a -140 mv con steps di -20 mv per 3 s, 16

17 Introduzione ogni gradino è seguito da uno step di 500 ms a -140 mv. In mezzo: curve di attivazione; per mhcn3 sono riportate le rispettive curve in presenza o in assenza di camp (0.5 mm). In basso: costanti di tempo di attivazione; per mhcn3 sull asse delle ordinate l unità di misura è riporatata in scala logaritmica. mhcn1 (mouse-hcn1); hhcn2 (human-hcn2); hhcn4 (human-hcn4) (da [23]) e mhcn3 (mouse-hcn3) (da [24]). La modulazione dei canali HCN da parte del AMPc avviene attraverso il legame diretto del nucleotide ciclico con il dominio CNB presente all estremità C-terminale che provoca un aumento della probabilità di apertura del canale senza modificarne la conduttanza [7]. L AMPc aumenta l attività dei canali accelerando le cinetiche di attivazione in maniera voltaggiodipendente e spostando il valore di V ½ verso voltaggi più positivi. Le isoforme altamente sensibili all AMP ciclico sono HCN2 e HCN4 dove si registra uno shift del V ½ di circa +15mV, mentre è minimo, se non nullo, l effetto su HCN1 (shift da 0 mv a +7 mv) [14]; [20]. Al contrario l isoforma HCN3 non viene modulata dall AMPc intracellulare [24], [25] (Figura 12). A mhcn1 B rbhcn4 C mhcn2 D mhcn3 - camp + camp (0.5 mm) - camp + camp (0.5 mm) 17

18 Introduzione Figura 12: Azioni del camp sulla corrente generata dalle diverse isoforme dei canali HCN. A e B: le correnti sono state misurate ai potenziali indicati partendo da un potenziale di riposo di -35 mv in condizioni di controllo e in seguito a perfusione con camp 10M. Gli shift della curva di attivazione erano di 7.6 e 17.4 mv per le isoforme 1 e 4, rispettivamente. Gli shift medi della curva di attivazione erano di 5.6 ± 0.5 mv (n=10) per la corrente mhcn1 e di 16.0 ± 0.9 mv (n=15) per la corrente rbhcn4 (da [22]). C e D: le tracce di corrente normalizzate sono state registrate, in assenza e in presenza di 0.5mM di camp intracellulare, ad un potenziale di -140 mv partendo da un potenziale di riposo di -40 mv. (da [24]). Per spiegare l azione del AMPc è stato proposto un modello in cui il dominio CNBD potrebbe diminuire l inibizione: la diversità della modulazione da AMPc nelle diverse isoforme potrebbe essere dovuta a differenze nel grado di inibizione [26], [27]. Distribuzione tissutale. Tecniche di Northern Blot, ibridazione in situ, RNAse Protection Assay e immunolocalizzazione hanno permesso di determinare l espressione tessuto-specifica delle 4 isoforme HCN [28], [9], [29], [19], [30], [31]. A livello cardiaco sono stati rilevati alti livelli dell isoforma HCN2 nel ventricolo, moderati nell atrio, bassi nel SAN [31]. Nel Nodo Senoatriale l isoforma 4 è senz altro quella che presenta i più alti livelli di espressione (più dell 80% dell HCN-mRNA totale) e nelle fibre del Purkinje [17], [18], [10], [31], [9], [11]. Anche l isoforma HCN1 è espressa nel Nodo Senoatriale, dove rappresenta più del 18% dell HCNmRNA totale, e nelle fibre del Purkinje [31]. Bassi livelli di HCN2 sono stati riscontrati nel nodo senoatriale di coniglio [31]. Si è sempre creduto che l isoforma HCN3 non fosse presente nel cuore, invece dati recenti indicano che è espresso nel ventricolo di topo [24]. In queste cellule HCN2 è l isoforma maggiormente espressa, soprattutto nei ventricoli. Questi dati suggeriscono che l espressione di HCN4 è correlata a cellule spontaneamente autoritmiche presenti nel tessuto di conduzione, mentre l espressione di HCN2 è sostanzialmente correlata a miociti non spontaneamente attivi. Ciò rispecchia i cambiamenti dell espressione dei canali HCN nel cuore di topo durante lo sviluppo embrionale [32]. Nei miociti ventricolari precoci che battono spontaneamente (9.5 giorni postcoitum) le isoforme dei canali HCN espresse in maniera predominante sono HCN4 e HCN1. Nei miociti embrionali più tardivi (da 18 giorni postcoitum a 1 anno prima della nascita), che nella maggior parte dei casi hanno perso la loro capacità di battere spontaneamente, HCN2 diventa la principale isoforma. Risultati analoghi sono stati precedentemente riscontrati nei miociti ventricolari neonatali e adulti di ratto [31]. Solo le isoforme HCN2 e HCN4 sono state rilevate in entrambe le tipologie di tessuto; mentre nei miociti neonatali HCN2 era espresso ad alti livelli (circa l 82% dell mrna totale dei canali HCN) e HCN4 era espresso a livelli molto più bassi (circa il 18% dell mrna totale dei canali HCN), nel ventricolo adulto di ratto questa percentuale cambiava risultando in un incremento 18

19 Introduzione dell espressione di HCN2 (circa il 93% dell mrna totale dei canali HCN, HCN4 diventa circa il 6.8%). Dato che nessuna delle quattro isoforme ricalca perfettamente le proprietà del canale nativo, non si esclude la possibilità che esso sia in realtà un eterotetramero. Recentemente sono stati condotti degli esperimenti nel nostro laboratorio nei quali si dimostra che le isoforme HCN1 e HCN4 contribuiscono entrambe alla corrente f nativa nelle cellule senoatriali, coassemblandosi in canali eterotetramerici. È stato confermato che le proprietà cinetiche e la sensibilità al camp di questi eterotetrameri sono intermedie tra quelle dei canali monomerici HCN1 e HCN4 ed è stato riscontrato che queste proprietà sono strettamente dipendenti dalla composizione delle subunità dell eterotetramero; nonostante gli eterotetrameri HCN4-1 presentino caratteristiche intermedie ai rispettivi omotetrameri, non riproducono completamente le proprietà dei canali f [33]. Quanto detto sottolinea l importanza del contesto intracellulare nella determinazione di alcune delle caratteristiche del canale come ad esempio la voltaggio dipendenza. La variabilità funzionale riscontrata nella corrente I f nativa potrebbe derivare da un eterogenea distribuzione tissutale delle diverse isoforme, da una diversa composizione eteromultimerica del canale, dalla presenza di subunità accessorie e/o, molto probabilmente, dall interazione con il microenvironment citoplasmatico unico dei vari tipi cellulari [34]. 19

20 Introduzione Cellule staminali Le cellule staminali sono i precursori delle altre cellule che compongono gli organi di un individuo. Il termine staminale è utilizzato per definire una cellula generica, indifferenziata, in grado di dividersi, in modo asimmetrico, per periodi indefiniti (long-term self renewal) dando vita contemporaneamente ad altre cellule staminali e a cellule precursori di una progenie cellulare destinata a differenziarsi e a dar vita a tessuti e organi, come i muscoli, il cuore, il fegato, le ossa ecc. In base alla capacità differenziativa le cellule staminali si possono dividere in quattro tipi: Le cellule staminali totipotenti (dal latino totus che significa tutto), che sono in grado di dare origine a tutte i tessuti dell organismo, compresi quelli extraembrionali, come la placenta, il cordone ombelicale e il sacco vitellino. Solo lo zigote (uovo fecondato alla stadio di 4-8 cellule dopo 4-5 giorni dalla fecondazione) è totipotente. Le cellule staminali pluripotenti (dal latino plures che significa parecchi) sono in grado di generare tutte le cellule che fanno parte dell organismo animale (cellule staminali embrionali) ma non le cellule che compongono i tessuti extra-embrionali. Le cellule staminali multipotenti sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule. Le cellule staminali unipotenti possono generare solamente un tipo di cellula specializzata. Le cellule staminali si classificano anche secondo la provenienza come embrionali (Embryonic Stem Cells o ESCs) o adulte (Adult Stem Cells o ASCs). Entrambi i tipi di cellule possono essere coltivati in vitro e indotti a differenziare. Cellule staminali embrionali Le cellule staminali embrionali (Embryonic Stem Cells o ESCs) provengono da un embrione allo stadio di blastocisti quindi a 4-5 giorni dalla fecondazione. La blastocisti è costituita da tre strutture: uno strato cellulare più esterno che circonda la blastocisti chiamato trofoblasto, che darà origine ai tessuti extraembrionali, una cavità interna o blastocele e la inner cell mass, un gruppo di circa 30 cellule all interno del blastocele, destinato a differenziarsi per dare origine all embrione (Figura 13). Le cellule embrionali staminali sono cellule pluripotenti, capaci quindi di generare tutti i differenti tipi cellulari presenti nell organismo; sono cellule non specializzate B 20

21 Introduzione ed in grado di replicarsi in modo indefinito se mantenute in opportune condizioni. Inoltre sono geneticamente manipolabili. A B Figura 13: A: immagine elaborata al computer di una blastocisti umana. B: embrione di 4-5 giorni. (da www. stemcells.nih.gov). Sono cellule pluripotenti, in grado di originare qualsiasi tipo cellulare proveniente dai tre foglietti embrionali (ectoderma, mesoderma e endoderma). Grazie a queste caratteristiche, queste cellule potrebbero essere particolarmente utili per uso terapeutico nel tentativo di curare alcune patologie umane in cui vengono alterate funzioni cellulari o distrutti tessuti dell organismo. Le ES potrebbero essere infatti una fonte rinnovabile per sostituire le cellule dei tessuti malati in un elevato numero di condizioni patologiche, come per esempio nel morbo di Parkinson, nel morbo di Alzheimer, nelle lesioni del midollo spinale, nelle ustioni, nel diabete o nelle malattie cardiache (Figura 14). 21

22 Introduzione Figura 14: Plasticità delle cellule staminali embrionali. (da Le prime linee di cellule staminali embrionali murine (mes) furono generate nel 1981 da Evans e Martin, in modo indipendente, trasferendo cellule della Inner Cell Mass derivate da blastocisti di topo in colture contenenti feeder cells (fibroblasti murini utilizzati per fornire gli elementi necessari per il mantenimento della pluripotenza delle cellule staminali) [35], [36]. Le colture risultanti contenevano popolazioni cellulari che crescevano come colonie, mostravano un elevata capacità replicativa mantenendo la pluripotenza, ed erano capaci di differenziarsi in coltura in derivati dell ectoderma, mesoderma ed endoderma. Le cellule staminali embrionali murine possono ora essere propagate in vitro sia attraverso l uso di feeder cells, sia aggiungendo in coltura il fattore inibitore per la leucemia (LIF: Leukemia Inhibitory Factor, [37]). Le cellule staminali embrionali murine sono commercialmente disponibili, esistono inoltre protocolli ben documentati e standardizzati che ne consentono la coltivazione e il differenziamento, senza trascurare il fatto che il loro utilizzo non è vincolato da problemi di carattere etico. Per questi motivi le cellule staminali embrionali di origine murina sono le più utilizzate nel campo della ricerca. Negli ultimi trent anni, le cellule staminali embrionali hanno avuto un grosso impatto nella ricerca biomedica permettendo di comprendere meglio molte malattie come diabete, distrofia muscolare, fibrosi cistica e osteoporosi. L isolamento di cellule staminali embrionali umane (hes), avvenuto nel novembre del 1998 ad opera di un gruppo di biologi dell Università di Madison nel Winsconsin, suscitò grande clamore [38]. 22

23 Introduzione Gli scienziati riuscirono a produrre cinque linee staminali indipendenti usando 14 blastocisti ottenute da embrioni umani prodotti da fecondazione in vitro, donati perchè in soprannumero. Queste linee cellulari erano in grado di proliferare prolungatamente senza differenziarsi e mantenevano la capacità di dare origine ad una varietà di specifici tipi cellulari quali cellule neuronali, muscolari, cartilaginee. Fin da subito si è compresa la grande potenzialità delle cellule staminali embrionali umane e si è aperta la prospettiva di un loro utilizzo clinico. Tuttavia esistono problemi tecnici legati all uso di queste cellule. Ad esempio, le cellule staminali isolate da embrioni non impiantati, quali quelli ottenuti in eccesso durante procedure di fecondazione in vitro, potrebbero essere potenzialmente immunogeniche se trapiantate in un paziente e ciò richiederebbe procedure di immunosoppressione simili a quelle utilizzate attualmente per i trapianti d organo. Una possibile soluzione a questo problema è rappresentata dalla clonazione terapeutica. In breve, il materiale genomico di una cellula somatica del paziente è trasferito in un ovocita di una donatrice dopo che da questo è stato eliminato il pronucleo. In alcuni casi l ovocita con il nuovo nucleo comincia a subire una serie di divisioni che lo portano allo stadio di blastocisti. Dalla ICM della blastocisti si possono isolare cellule staminali che hanno lo stesso genoma del paziente e quindi non daranno problemi di rigetto. Altri problemi concernenti l utilizzo delle cellule staminali embrionali in vivo: sono dovuti al fatto che non si conosce ancora come controllare la loro crescita fuori dalla provetta ed evitare quindi che diventino cellule tumorali. Oltre ai problemi tecnici l utilizzo di cellule staminali embrionali umane solleva importanti questioni di carattere etico: l estrazione di queste cellule richiede la soppressione dell embrione che non supera mai i quattordici giorni dalla sua fecondazione. Negli ultimi tempi le cellule staminali, in particolare la loro creazione e il loro impiego in medicina, sono diventate il tema scientifico più attuale: le ricerche e le scoperte si susseguono a ritmo sfrenato, occupando non solo le pagine delle riviste scientifiche specializzate ma anche quelle dei quotidiani o dei settimanali più popolari. Su questo tema si sollevano numerose polemiche: da una parte sulla capacità di queste cellule di curare malattie finora considerate inguaribili, dall'altra sulla moralità delle tecniche utilizzate per ottenerle. In Italia la ricerca sulle cellule staminali embrionali è regolata dalla legge n. 40 del 19 febbraio del 2004, Norme in materia di procreazione medicalmente assistita, che vieta qualunque sperimentazione condotta su embrioni umani e qualunque intervento di manipolazione che non sia finalizzato alla tutela della salute e dello sviluppo degli embrioni stessi. La legge non si pronuncia sulla sperimentazione condotta su staminali importate dall estero o ricavate da embrioni umani, prima dell entrata in vigore della legge in questione. L Unione europea non ha 23

24 Introduzione un regolamento comune riguardo la ricerca sulle cellule staminali embrionali umane. Ogni Stato ha leggi differenti. In Italia è vietato l utilizzo di embrioni soprannumerari per ricavarne cellule staminali, ma è consentita la ricerca su staminali importate da altri Paesi o su quelle ottenute prima che le leggi attuali entrassero in vigore. Cellule staminali adulte Le cellule staminali adulte, invece, sono cellule indifferenziate multipotenti caratterizzate da un continuo self-renewal e sono localizzate, insieme alle cellule specializzate tipiche di un tessuto, all interno del tessuto stesso o di un organo. Il loro ruolo principale in un organismo vivente è quello di mantenere l omeostasi del tessuto in cui si trovano e di ripararlo in seguito ad un eventuale danno. Al contrario delle ES, che hanno un origine ben definita, l origine delle cellule staminali adulte nei tessuti maturi è ancora ignota. Le cellule staminali adulte sono note fin dagli anni sessanta quando si scoprì la presenza di due diversi tipi di cellule staminali all interno del midollo osseo: le cellule staminali ematopoietiche (Hematopoietic Stem Cells, HSC) che danno origine ai vari tipi di cellule del sangue e le cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells o MSCs) o cellule stromali del midollo osseo che danno origine a osteociti, condrociti, adipociti e altre cellule del tessuto connettivo [39], [40], [41], [42], [43] (Figura 15). Figura 15: Cellule staminali del midollo osseo: Differenziamento di cellule staminali ematopoietiche e mesenchimali del midollo osseo. (da 24

25 Introduzione È più recente invece la scoperta di cellule staminali in organi considerati da sempre privi di capacità rigenerativa come il cervello e il cuore [44], [45]. Le cellule staminali cardiache (Cardiac Stem Cells, CSCs) (Figura 16) sono cellule multipotenti, in grado di originare miociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce che quindi potrebbero essere impiegate nella rigenerazione del miocardio in caso di danno. Figura 16: Origine e proprietà delle cellule staminali cardiache. Le cellule staminali adulte sono state trovate in quasi tutti gli organi: cervello, midollo osseo, vasi sanguigni, scheletro, muscoli, pelle e fegato ma il numero di queste cellule è molto basso. All interno di questi organi le cellule staminali risiedono in specifiche nicchie dove rimangono allo stato quiescente per molto tempo e quando vengono attivati in caso di malattia o danno iniziano a proliferare, migrano fuori dalla nicchia e vanno incontro al differenziamento [46], [47]. Queste nicchie protettive contengono anche diversi tipi di cellule specializzate che secernono particolari fattori e organizzano la matrice extra-cellulare in modo tale da permettere alle cellule staminali stesse di mantenere le loro capacità di self-renewal o di un eventuale differenziamento. L architettura di ciascuna nicchia sembra essere costruita ad hoc per le esigenze della cellula staminale e ciascuna cellula staminale sembrerebbe giocare un ruolo importante nell organizzazione e nelle peculiarità della nicchia. Quindi è una combinazione sia del comportamento della cellula staminale sia delle caratteristiche della nicchia stessa a costituire questo microambiente importante per la protezione e il mantenimento dello stato indifferenziato delle cellule staminali residenti [46]. Inizialmente si credeva che la capacità differenziativa delle cellule staminali adulte fosse piuttosto limitata e che potessero dare origine solo a cellule con caratteristiche strutturali e funzionali specifiche del tessuto di appartenenza 25

26 Introduzione (cellule multipotenti). Diversi esperimenti hanno dimostrato invece che alcuni tipi di cellule staminali adulte sono pluripotenti cioè in grado di differenziare in diversi tipi cellulari. È stato dimostrato che le cellule staminali del midollo osseo possono differenziare anche in cellule del cervello, cellule muscolari scheletriche, cellule cardiache e cellule del fegato [48], [49], [50], [51] mentre le cellule staminali del cervello possono originare anche cellule del sangue e cellule muscolari scheletriche [52],[53] (Figura 17). Figura 17: Pluripotenza delle cellule staminali. (da Risulta quindi evidente che alcune cellule staminali adulte sono dotate di una certa plasticità e sono in grado di differenziare in tipi cellulari di derivazione embriologica diversa. Recentemente è stata identificata una nuova popolazione di cellule staminali associati ai vasi sanguigni in grado di differenziare in diversi tipi di cellule mesodermiche e perciò chiamati mesoangioblasti (Mabs) [54],[55]. Queste cellule sono caratterizzate oltre che dalla presenza di tipici markers staminali, CD34 e Sca-1 anche di markers endoteliali precoci, tra cui Flk-1 e VE-cadherin e di marker muscolari tra cui α-sma (α smooth muscle actin), Myf5 e MyoD. Per la loro capacità di differenziare spontaneamente in cellule muscolari si pensa possano essere impiegate nella cura della distrofia muscolare; un recente lavoro ha mostrato risultati promettenti in cui la somministrazione di mesoangioblasti di derivazione muscolo-scheletrica in topi e cani distrofici ha portato ad un parziale ma significativo recupero della struttura e funzionalità muscolare [56], [57]. 26

27 Patologie cardiache e Terapia cellulare Introduzione Le malattie cardiache rappresentano uno dei maggiori problemi sanitari a livello mondiale e costituiscono la prima causa di morte nella popolazione dei paesi occidentali compresa l Italia dove il 44% di tutte le morti è causato da malattie del sistema cardiocircolatorio. Nella definizione di malattie cardiovascolari rientrano tutte le patologie a carico del cuore e dei vasi sanguigni tra cui la cardiopatia ischemica, la cardiopatia ipertensiva, la pericardite, il prolasso della valvola mitrale e le aritmie. Per tutte queste patologie non esistono cure efficaci in grado di ripristinare il normale funzionamento cardiaco ed è quindi necessario sviluppare terapie alternative. Cardiopatie ischemiche Le cardiopatie ischemiche sono le patologie cardiache con più alta incidenza; in Italia interessano il 5% della popolazione, con di malati e nuovi casi ogni anno. Queste patologie sono caratterizzate da una riduzione progressiva o improvvisa del flusso sanguigno dovuto ad un restringimento o ad una ostruzione completa delle arterie coronarie solitamente per la presenza di placche arteriosclerotiche. La manifestazione più grave dell ischemia cardiaca è l infarto del miocardio che si manifesta con una sensazione dolorosa di costrizione o di oppressione al torace, in corrispondenza del cuore, che può irradiarsi alla spalla e al braccio sinistro. L insufficiente apporto sanguigno ha come conseguenza la necrosi del tessuto miocardico che era prima irrorato dall'arteria ostruita, ma nei casi più gravi può portare al collasso cardiocircolatorio e alla morte. L entità dell infarto dipende quindi dall arteria occlusa e dalla presenza o meno di un apporto di sangue collaterale. Nel periodo successivo ad un infarto si assiste a un progressivo assottigliamento del tessuto muscolare con l alterazione della configurazione e della contrattilità del ventricolo sinistro. Le terapie ad oggi utilizzate nei casi di cardiopatie ischemiche comprendono l uso di farmaci vasodilatatori, anticoagulanti e trombolitici che migliorano la circolazione sanguigna, ma nei casi di maggior gravità sono necessari interventi chirurgici come il by-pass o l angioplastica. Nessuna di queste terapie è però in grado di sostituire il tessuto cardiaco danneggiato e nei pazienti sopravvissuti all infarto la riduzione nel numero dei miociti e nella funzionalità della pompa cardiaca possono causare insufficienza cardiaca e condurre a morte per un nuovo infarto del miocardio. Considerata quindi la gravità di queste patologie risulta evidente la necessità di sviluppare trattamenti innovativi ed efficaci. Una possibile terapia alternativa è l utilizzo di cellule sane che trapiantate nella zona infartuata potrebbero sostituire il tessuto cardiaco danneggiato. Molti tipi cellulari sono stati trapiantati nel miocardio infartuato: cardiomiociti (embrionali, fetali e adulti), 27

28 Introduzione mioblasti scheletrici, cellule staminali del midollo osseo e cellule progenitrici endoteliali. L approccio più promettente risulta essere l uso di cellule staminali che, differenziando in cardiomiociti, potrebbero essere in grado di sostituire il tessuto cardiaco danneggiato. Le cellule staminali possono essere iniettate nella zona d interesse oppure, attraverso l uso di citochine, si può promuovere la migrazione di queste cellule dal midollo osseo fino all area infartuata. Inoltre si potrebbe potenziare il processo di riparazione endogeno con specifici fattori di crescita che stimolano la replicazione dei cardiomiociti e il differenziamento di cellule staminali residenti [58]. Nonostante sia stato dimostrato che le cellule staminali adulte sono caratterizzate da un certo grado di plasticità, la loro capacità di dare origine ad un fenotipo cardiaco differenziato è tuttora oggetto di discussione da parte di molti scienziati. Sono stati infatti riportati in letteratura risultati in contraddizione tra loro riguardo al differenziamento delle cellule staminali verso una linea cardiomiocitaria. Molti ricercatori ritengono possibile una fusione cellulare, altri scienziati invece supportano il processo di differenziamento. Cellule staminali embrionali Sono molto più versatili rispetto alle cellule staminali adulte e in grado di differenziare in diversi tipi cellulari. In particolari condizioni di coltura le cellule staminali embrionali umane sono in grado di differenziare in cardiomiociti che esprimono marker cardiaci e rispondono a farmaci cardioattivi [59], [60]. Inoltre, in un modello murino, è stato dimostrato che cellule staminali embrionali iniettate direttamente nel miocardio sono in grado di integrarsi nel tessuto, migliorare la funzione ventricolare e la contrattilità cardiaca dopo circa 6 settimane dal trapianto [61]. Cellule progenitrici endoteliali Le cellule progenitrici endoteliali (Endothelial Progenitor Cells o EPCs) provengono dal midollo osseo e nell adulto contribuiscono alla formazione di nuovi vasi sanguigni in risposta a particolari condizioni fisiologiche e patologiche. Queste cellule sono state impiegate in diversi studi per verificare la loro capacità di differenziamento verso un fenotipo cardiaco e la capacità di migliorare la funzionalità cardiaca in modelli di infarto. In questi modelli in vivo gli effetti delle EPCs dopo un evento ischemico, sono state valutate o in seguito alla loro mobilizzazione dal midollo osseo al sangue periferico attraverso la somministrazione di particolari fattori quali fattori di crescita, citochine e chemochine, oppure iniettando queste cellule in prossimità dell area infartuata. In un modello murino le EPCs umane sono state iniettate in circolo dopo 28