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1 IVD IVD Diagnostici in Vitro ThromboFil Genotipizzazione molecolare del Fattore V di Leiden, Fattore II, MTHFR C677T, MTHFR A1298C attraverso Multiplex PCR / elettroforesi capillare Codice MDS-PTF-001 Fabbricante: Orga Bio Human S.r.l. 50 Reazioni Store at -18 C to -25 C Data sheet, Revisione 1.3 (02/01/2014) 1 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

2 INTRODUZIONE Il rischio di patologia cardiovascolare e trombosi venosa è determinato sia da fattori ambientali (età, gravidanza, etc.) sia da una predisposizione genetica. Mutazioni nei geni del fattore V, nel fattore II della coagulazione e nel gene della metilentetraidrofolato reduttasi (MTHFR) determinano suscettibilità alla trombosi. Fattore V. E un cofattore per l attivazione della protrombina (fattore II) a trombina. Il suo effetto è normalmente inibito dalla proteina C attivata che taglia il fattore V in corrispondenza dell aminoacido arginina in posizione 506. La mutazione V R506Q (G1691A), denominata variante di Leiden, rende il fattore V non sensibile al taglio da parte della proteina C attivata e favorisce un aumento di produzione della trombina con un effetto pro coagulante che predispone alla trombosi con modalità di trasmissione ereditaria autosomico dominante. La resistenza alla proteina C attivata che ne deriva è il maggiore fattore di rischio ereditario per lo sviluppo della trombosi venosa. La presenza in eterozigosi della mutazione aumenta di 5-10 il rischio trombosi venosa; tale rischio aumenta di 35 volte in associazione all assunzione di contraccettivi. Fattore II. La sua attivazione a trombina porta alla trasformazione del fibrinogeno in fibrina e quindi alla formazione del coagulo. La mutazione in posizione (variante G20210A) si associa con un aumento di circa il 30% dei livelli plasmatici di protrombina. La variante genetica G20210A, localizzata nella regione non tradotta al 3 del gene della protrombina, è associata ad elevati livelli di protrombina funzionale nel plasma con conseguente aumentato rischio di trombosi venosa. MTHFR. La metilentetraidrofolato reduttasi è un enzima coinvolto nella trasformazione del 5-10 metilentetraidrofolato in 5 metiltetraidrofolato che serve come donatore di metili per la rimetilazione della omocisteina a metionina tramite l intervento della vitamina B12. La variante genetica comune C677T determina la sostituzione della valina con una alanina in posizione 223 con conseguente riduzione di circa il 50% della sua normale attività enzimatica. La presenza di omozigosi ed eterozigosi di MTHFR C677T può dunque comportare elevati livelli di omocisteina nel sangue che sono considerati fattori di rischio per malattia vascolare. Recentemente, una seconda mutazione del gene MTHFR (A1298C) è stata associata ad una ridotta attività enzimatica (circa il 60% singolarmente; circa il 40% se presente in associazione alla mutazione C677T). Questa mutazione, in pazienti portatori della mutazione C677T, determina un'aumento dei livelli ematici di omocisteina. 2 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

3 METODICA Thrombofil CE IVD (Linea MoDiSeq TM ) permette di genotipizzare le seguenti mutazioni: G20120A nel Fattore II, G1691A nel Fattore V, C677T ed A1298C nell MTHFR (Tabella 1). Mutazione Gene Localizzazione Variazione Nucleotidica Variazione Aminoacidica G1691A Fattore V Esone 10 G-1691 A Arg-506 Glu G20210A Fattore II 3' UTR G A 3' Splice Mut. C677T MTHFR Esone 4 C-677 T Ala Val A1298C MTHFR Esone 8 A-1298 C Glu Ala Tabella 1. Mutazioni identificate dal kit Il kit è basato su una amplificazione in PCR Multiplex, purificazione dell amplificato mediante reazione enzimatica con EXOSAP, e successiva reazione SnapShot/minisequencing single base extension mediante Kit SnapShot Multiplex Ready Reaction Mix. La chimica è basata sull estensione di una singola base dideossi di uno o più oligonucleotidi primers non marcati. Ciascun primer si lega al templato complementare in presenza di un ddntp fluorescinato e Taq. La polimerasi estende il primer di un oligonucleotide aggiungendo un singolo ddntp nella posizione 3. L interpretazione dei dati avviene mediante elettroforesi capillare su un sequenziatore automatico, che consente di evidenziare e separare i prodotti di PCR come in Figura 1. Figura 1. Profilo elettroforetico di una corsa ottenuta con ThromboFil Kit. I picchi elettroforetici relativi agli alleli wild type e mutati di ciascuna delle 4 mutazioni indagate vengono separate per peso molecolare e visualizzate con colori differenti per una chiara e rapida interpretazione dei dati. 3 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

4 Materiale contenuto all interno di ogni kit Il kit da 50 determinazioni è costituito da: N 4 vials contenenti 1X Mix: 4 X 290 µl N 1 vial contenente 5U/µl Hot Rescue DNA Polymerase: 1 X 10 µl Dilution buffer: 1 x 1000 µl N 4 vials contenenti SNAP Primer: 4 X 2.4 µl Materiale necessario ma non fornito Kit di estrazione di DNA umano (es. QiAmp DNA mini kit Qiagen); Exo-Sap USB ABI Prism SNaPshot Multiplex Kit Matrix Standard Set DS-02 Sequenziatore, polimero, Formammide, size standard GeneSccan-120 LIZ; Reagenti di base per sequenziatore automatico; Microcentrifuga da banco ( g. p. m.); Termostato per le provette tipo eppendorf con range di temperatura da 25 a 100 c (solo per alcuni kit di estrazione); Cappa biologica; Puntali dotati di filtro (prevenzione aerosol); Micropipette da 0,5-10 μl; 5-50 μl; μl; μl; Guanti lattice, camice; Provette in polipropilene con tappo da 0,2 ml e da 1,5 ml o 2 ml; Portaprovette; Termociclatore; H 2 0 sterile; Vortex; Conservazione Conservare al riparo dalla luce a -20 C. Ripetuti congelamenti e scongelamenti possono ridurre la sensibilità e devono essere evitati. È consigliato aliquotare i reagenti per usi intermittenti. Avvertenze e precauzioni Tutti i materiali biologici impiegati per l estrazione del DNA devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici Si raccomanda l utilizzo di un DNA non degradato, con rapporto 260/280 maggiore o uguale a 1,8. Inoltre si raccomanda di: 4 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

5 1. Indossare guanti monouso durante l uso dei reagenti e dei campioni, lavarsi accuratamente le mani al termine della seduta lavorativa. 2. Utilizzare puntali con filtro e guanti sterili DNA free 3. Non pipettare con la bocca. 4. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici e non maneggiare lenti a contatto nelle aree di lavoro del laboratorio. 5. Non usare il kit dopo la data di scadenza. 6. Non usare le stesse pipette di precisione per l allestimento delle reazioni e il DNA. 7. Scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente prima di iniziare un saggio, mixare i componenti e centrifugare brevemente. 8. Eliminare tutti i campioni ed i materiali utilizzati per il test come se potenzialmente in grado di trasmettere infezioni. La loro eliminazione deve avvenire seguendo le normative di legge vigenti. 9. Manipolare all interno di una cappa biologica (in accordo con quanto descritto nella pubblicazione Biosafety Level 2, o linee guida equivalenti) tutti i materiali contenenti o sospettati contenere agenti infettivi. 10. Pulire e disinfettare tutte le superfici di lavoro utilizzando un disinfettante come ad es. l ipoclorito di sodio allo 0,5%, o un altro disinfettante idoneo. 11. Evitare ogni contatto della pelle e delle mucose con i campioni e reagenti del kit. In caso di contatto, lavare abbondantemente con acqua le parti esposte e consultare un medico. 12. Organizzare in modo unidirezionale le fasi operative per l allestimento della reazione e l utilizzo del kit, al fine di prevenire l eventuale contaminazione dei reagenti con prodotti amplificati. È buona norma mantenere separate le aree e le dotazioni dedicate, rispettivamente, alla fase di estrazione dei campioni e di allestimento ed esecuzione delle procedure di amplificazione. Strumentazioni e polimeri da utilizzare Il kit è stato testato utilizzando la seguente strumentazione: Termociclatori Verity Applied Biosystems 2720 Applied Biosystems Personal Biometra Sequenziatori e relativi polimeri: Applied Biosystems ABI 310 POP 4 Applied Biosystems ABI 3130 POP4 Applied Biosystems ABI 3500 POP7 5 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

6 L utilizzo del kit con altre strumentazioni ed altri polimeri deve essere accuratamente validato dal laboratorio che esegue il test. Materiale di partenza L utilizzo del kit è stato testato su DNA estratto da sangue periferico. Per ogni analisi, si raccomanda di utilizzare DNA con un rapporto 260 nm vs 280 nm compreso tra 1.8 e 2. Il Procedimento 1. Isolamento DNA Per l isolamento del DNA sono consigliati kit commerciali che consentono di ottenere un DNA di buona qualità e privo di inibitori (es. Blood mini kit QIAGEN). 2. Set up PCR e protocollo termico Preparazione della MasterMix di PCR: - Prima di ogni uso scongelare perferttamente la mix; vortexare per 10 sec. e centrifugare. - Volume finale per reazione: 25 µl. - Allestire la Master Mix in eppendorf separate da 1,5mL e miscelare secondo quanto riportato. 1X Multiplex Mix 5U/ul Hot Rescue DNA polymerase DNA Volume Totale 1 Reazione 22,8 ul 0,2 ul 2uL* 25 ul *È consigliato l utilizzo di 25ng DNA/reazione - Impostare il protocollo termico di PCR sul thermal cycler: Profilo termico PCR 95 C per 10 min 95 C per 1 min 35 cicli 55 C per 1 min 72 C per 1 min e 30 sec 72 C per 15 min 4 C 6 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

7 3. Purificazione dei prodotti di PCR mediante trattamento EXOSAP Vortexare brevemente i campioni sottoposti allo ste di amplificazione, prelevare 5 µl e trasferire in una nuova eppendorf da 0.2 ml. Aggiunger 1 µl di EXOSAP e vortexare per 3 sec. Incubare a 37 C per 45 min e a 80 C per 15 min. Conservare il prodotto a -20 C oppure procedere con lo step 4. N.B.: Mantenere l EXOSAP in ghiaccio durante tutte le operazioni e vortexare qualche secondo prima di prelevare! Ripetuti scongelamenti di questo reagente possono influire sulle performances del prodotto. Per maggiori informazioni su questo reagente SI CONSIGLIA di consultare il product information fornito dalla casa produttrice. 4. SNaPshot Multiplex Ready reaction kit Scongelare e vortexare brevemente la SNAP Mix fornita all interno del ABI PRISM SNaPshot Multiplex kit (Life-Technologies: Cod ). Nel frattempo scongelare anche il reagente SNAP Primer con il relativo buffer fornito nel kit ThromboFil. Una volta scongelata la provetta contenente SNAP Primer aggiungere 57.6 µl di dilution buffer e miscelare per 10 sec. Vortexare brevemente i campioni sottoposti allo step di trattamento con EXOSAP e diluire come segue: 1 µl di campione + 3 µl di PCR distilled grade water e miscelare nuovamente. Allestire la miscela per lo sanpshot come di seguito riportato: 1 Reazione Snap Mix 2,0 ul SNAP Primer ** 1.0 ul Campione *** 1,5uL Deionized water 0.5 ul Volume Totale 5 ul ** reagente preparato come sopra descritto *** campione diluito (1 µl + 3 µl) N.B. Mantenere SNAP Mix e SNAP primers in ghiaccio ed al riparo dalla luce durante tutte le operazioni. Si consiglia l utilizzo di blocchi refrigerati per lo svolgimento delle operazioni. Una volta allestita la miscela si raccommanda di aggiungere tempestivamente il campione e dare inizio alla reazione! Ripetuti scongelamenti della SNAP Mix potrebbero comportare delle variazioni nel funzionamento. Una volta diluito il reagente SNAP PRIMER come sopra indicato utilizzare entro 3 mesi 7 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

8 - Impostare protocollo termico per la reazione SnapShot sul thermal cycler come indicato dalla casa produttrice: Profilo termico SNaPshot 25 cicli 96 C per 10 sec 50 C per 5 sec 60 C per 30 sec 5. Caricamento e corsa con iniezione standard NOTA: E possibile apportare modifiche alle condizioni di elettroforesi in base allo strumento utilizzato Anche i volumi degli amplificati possono essere variabili in base alle caratteristiche dello strumento utilizzato per l analisi. Vortexare e centrifugare i campioni sottoposti a SnapShot-minisequencing e procedere al caricamento per la corsa elettroforetica su sequenziatore come indicato: Per ogni campione processato: Sequenziatore ABI310 ABI3100 ABI 3500 Formammide 16 ul 16 ul 10 ul 120 LIZ Size Standard 0.5 ul 0.5 ul 0.2 ul Amplificato 0.5 ul 0.5 ul 0.5 ul VF 17 ul 17 ul 10,5 ul Settare i parametri per la corsa elettroforetica Run Module GeneScan E5 Matrix DS-02. A seconda del sequenziatore utilizzato e del relativo polimero, sono riportati i parametri raccomandati per eseguire le corse elettroforetiche. ABI 310 Parametri Injection time Electrophoresis Voltage Collection time EP voltage POP4 3 sec. 10kV 14 min. 15 kv Heat plate temperature 60 C Syringe pump time Preinjection EP 150 sec. 120 sec. 8 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

9 ABI 3130 Parametri POP4 Capillary length (Centimetri) 36 Oven_Temparature (Gradi) 60 Injection_Time (Secondi) 10 PreRun_Voltage (KVolts) 15 Injection_Voltage (KV) 1.2 Pre_Run_Time (Secondi) 180 Poly_Fill_Vol (STEP) 6500 Current_Stability (AMP) 5 Voltage_Number_Of_Steps 40 Voltage_Step_Interval 15 Data_Delay_Time 1 Run_Voltage (KVolts) 15 Run_Time (Secondi) 3 ABI 3500 Parametri POP7 Capillary length 50 Oven_Temparature (Gradi) 60 Run_Voltage (KVolts) 10 PreRun_Voltage (KVolts) 15 Injection Voltage (KVolts) 1,6 Run_Time (Secondi) 560 PreRun_Time (Secondi) 180 Injection Time (Secondi) 3 Data Delay (Secondi) 1 9 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

10 INTERPRETAZIONE DEI DATI Per una corretta interpretazione elettroforetica dei dati, si raccomanda sempre di correre un campione a genotipo noto Altezza dei picchi elettroforetici E preferibile che i picchi non superino il valore di , onde evitare il formarsi di picchi aspecifici in corrispondenza di segnali di intensità eccessiva. Si consiglia pertanto di valutare la combinazione più appropriata di iniezione per il tipo di strumento utilizzato Separazione elettroforetica Nella tabella a seguire vengono mostrate le grandezza in termini di paia di basi (bp) per ognuno degli 8 alleli. Le grandezze elettroforetiche assumono valori differenti considerando diversi polimeri (POP7, POP4) e diversi sequenziatori capillari (ABI 3500,3130,310). Si raccomanda di considerare una intervariabilità di +/- 1 bp per ogni frammento. Allele ABI 3500 POP7 ABI 3130 POP4 ABI 310 POP4 MTHFR 1298 Allele C (Blu), Mutato Allele A (Red), WT Fattore II Allele G (Black), WT 44, ,5 Allele A (Red), Mutato 46 40,5 41,5 MTHFR 677 Allele C (Blu), WT 48, ,5 Allele T (Green), Mutato 49, Fattore V Allele G (Black), WT 51,5 47,5 49 Allele A (Red), Mutato 53 48,5 50 Separazione eletteroforetica attesa in paia di basi (bp) considerando diversi polimeri (POP7, POP4) e diversi sequenziatori capillari (ABI 3500,3130,310). Rapporto tra i picchi elettroforetici Per una corretta interpretazione dei picchi elettroforetici, e per discriminare un picco aspecifico da un picco reale, si raccomanda di considerare che, in caso di presenza di eterozigote, la ratio tra i due picchi non deve essere mai inferiore a 35%. In casi borderline, si consiglia di ripetere l esperimento con campioni a genotipo noto. 10 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

11 Troubleshooting Se il kit ThromboFil sembra non funzionare correttamente in laboratorio, cercare di seguire i consigli ed i suggerimenti nelle tabelle sottostanti. Se il DNA sembra non amplificarsi correttamente, il processo di risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sulla la PCR e/o sulle condizioni elettroforetiche. 1. Assenza di picchi di fluorescenza in elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA insufficiente o degradato Estrarre nuovamente il campione P C R Errato protocollo di PCR; Errato programma Ricontrollare il protocollo suggerito, seguendo passo per passo la del termociclatore metodica. Eventualmente ripetere il test 2. Picchi di fluorescenza troppo deboli Possibile causa D N A - DNA di scarsa qualità - Presenza di inibitori di PC - Scarsa quantità di templato di DNA Azione suggerita Ricontrollare la metodica di preparazione del campione delle soluzioni, e della loro conservazione Preparare nuovamente il DNA utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Estrarre nuovamente il campione P C R Protocollo di PCR non corretto -Concentrazione di primers annealed bassa bassa efficienza di annealing ed estensione Injection time non appropriato Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Aumentare la concentrazione dei primers a 1pmol per reazione. Si consiglia di non utilizzare concentrazioni di primers combinati maggiore di 4 pmol in quanto potrebbero causare la incorporazione errata dei ddntp Aumentare injection time 3. Picchi di fluorescenza troppo intensi durante l elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire il DNA ed effettuare l amplificazione P C R Utilizzato un programma non corretto Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Diminuire la quantità di ExoI Eccessiva quantità di PCR caricata sul sequenziatore Rimozione incompleta di primers PCR Nota: i primers non rimossi possono partecipare all estensione Diluire la PCR ed effettuare nuovamente la corsa elettroforetica Utilizzare ExoSap fresco o metodo di rimozione primers alternativo 4. Picchi di fluorescenza aspecifici Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire la quantità di DNA utilizzata per la PCR P C R Eccessiva quantità di PCR caricata sul Diluire la quantità di PCR da caricare nel sequenziatore sequenziatore EXOSAP Trattamento con Exosap non sufficiente Aumentare la quantità di Exosap Allungare il tempo di incubazione da 45 min. a 60 min. a 37 C dopo trattamento con exosap 11 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

12 Codice prodotto Numero di lotto Data d iscadenza Numero di reazioni Precauzioni Versione Fabbricante Temperatura di conservazione Fabbricante Orga Bio Human S.r.l. Sede Legale Via Helsinki Roma Tel , Fax Sede Operativa Via Amsterdam Roma Tel , Fax Web 12 ThromboFil Kit Data Sheet- Orga Bio Human

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 SEDE LEGALE: Via Helsinki 21, 00144 Roma Tel. 06 97998273; Fax 06 52246148 e-mail: orgabiohuman@fastwebnet.it

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