Sequenziamento del DNA. Preparazione di librerie. Library di cdna e di DNA genomico. Analisi di librerie. Sequenziamento del DNA

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1 Sequenziamento del DNA Preparazione di librerie Library di cdna e di DNA genomico Analisi di librerie Sequenziamento del DNA 1) Metodo di Maxam&Gilbert (taglio chimico): il DNA viene marcato ad un estremità con 32 P, quindi viene tagliato con reagenti chimici (tagliano in maniera selettiva solo in corrispondenza di una determinata base). Si preparano 4 miscele di reazione diverse (una per ogni base); in ogni miscela si producono frammenti di lunghezza diversa che vengono separati su gel di poliacrilammide. Il passaggio successivo è l autoradiografia del gel. 1

2 2) Metodo di Sanger (interruzione della replicazione): Si usa un primer marcato con 35 S come innesco per la DNA polimerasi che si andrà ad appaiare in corrispondenza della zona che si intende sequenziare Si incorpora un dideossinucleotide in un filamento di DNA che si sta sintetizzando: la catena si arresta in quanto, mancando il gruppo OH al 3, non si può formare un legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo. Si effettuano 4 diverse reazioni (usando ddatp; ddgtp; ddttp; ddctp) e si ottiene, in ogni reazione, una popolazione di molecole di DNA radioattive che hanno in comune l estremità al 5 ma che differiscono in lunghezza in quanto la loro sintesi è stata bloccata in diverse posizioni al 3. Le miscele di frammenti ottenuti, marcati con 35 S, si denaturano e si separano su gel di poliacrilammide (6-20%) e urea 7M. Le bande di DNA marcato ottenute dopo la corsa vengono evidenziate mediante autoradiografia su lastre da raggi X. 2

3 3) Sequenziamento automatico: si utilizzano dei nucleotidi di terminazione che contengono un tracciante fluorescente diverso per ciascuno dei 4 dideossinucleotidi e dotato di proprietà spettrali differenti. I traccianti fluorescenti vengono incorporati dalla polimerasi nella molecola nascente del DNA: si termina la catena e si attacca il fluoroforo alla fine della molecola interrotta. Le bande, separate in capillari riempiti di polimero, vengono individuate grazie alla fluorescenza che emettono quando passano davanti ad un apposito rilevatore. Vantaggi: rispetto alle sequenze manuali c è maggiore affidabilità (si minimizza l errore dell operatore), maggiore rapidità. 3

4 Esempio di un tracciato ottenuto tramite sequenziamento automatico. Ciascun picco colorato rappresenta un nucleotide nel frammento di DNA sottoposto ad analisi. Nuovi metodi di sequenziamento Pirosequenziamento Si basa sulla rilevazione del pirofosfato rilasciato dall incorporazione di un nucleotide durante la sintesi del DNA (DNA)n+ dntp polymerase (DNA)n+1+ PPi PPi ATP sulfurylase+ ASP ATP luciferase ATP+ luciferin + O2 light+amp+ppi+oxyluciferin+co2 4

5 Il primer è ibridato allo stampo a singola elica, amplificato per PCR, e incubato con gli enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi e apirasi, adenosinfosfosolfato (ASP) e luciferina. Il primo dei quattro dntp viene aggiunto alla reazione. La DNA polimerasi catalizza l incorporazione del dntp al filamento di DNA, se è complementare alla base del filamento stampo. Ogni evento di incorporazione è accompagnato dal rilascio di piro-fosfato (PPi) in quantità equimolare a quella del nucleotide incorporato. In presenza di adenosinfosfosolfato (ASP), l ATP solforilasi converte quantitativamente il PPi ad ATP, che, a sua volta guida la conversione, catalizzata dalla luciferasi, di luciferina ad ossiluciferina con conseguente produzione di luce di intensità proporzionale alla quantità di ATP. La luce prodotta è rilevata da una camera fotosensibile (CCD) e visualizzata come picco in un pirogramma. ASP L apirasi, un enzima che degrada nucleotidi, degrada continuamente tutti i dntp non incorporati e l ATP in eccesso. Non appena la degradazione è completata viene aggiunto un altro dntp I dntp vengono aggiunti sequenzialmente, uno alla volta. Poiché il datp è un substrato naturale della luciferasi, al suo posto viene utilizzato la deossiadenosina-tio-trifosfato (datps) che viene utilizzata efficentemente dalla DNA polimerasi ma non viene riconosciuta dalla luciferasi. 5

6 Man mano che il processo continua, il filamento di DNA complementare è sintetizzato e la sequenza nucleotidica è determinata dai picchi del pirogramma. Il segnale sarà proporzionale all'atp prodotto e quindi al nucleotide inglobato; un picco di intensità doppia, ad esempio, rileva che nello stesso ciclo sono stati inglobati 2 dntp (ripetizione della stessa base sul templato). + DNA polimerasi, apyrase + ATP sulfurylase + luciferase Perchè sequenziare? Trovare mutazioni che causano patologie, identificare variazioni Paragonare geni tra cellule/stadi in cui sono espressi a cell/stadi in cui non sono espressi o sono differenzialmente espressi Andare alla ricerca di sequenze di regolazione e mutazioni che influenzano la regolazione/espressione Determinare la sequenza di una proteina corrispondente a una regione codificante Paragonare il gene in specie/genomi diversi Progetti genoma (sequenziare e annotare un genoma cioè predire quali sono i geni che contiene) 6

7 Isolamento di sequenze specifiche di acidi nucleici DNA complementare: Se lo scopo del lavoro è clonare un gene, è importante avere il maggior numero di informazioni possibili circa il prodotto genico. Se il prodotto è una proteina occorre isolare l RNA totale o l mrna della cellula (o tessuto) e ottenere il cdna (DNA complementare). Schema di lavoro: 1) si procede all isolamento dell RNA (totale o messaggero) come descritto in precedenza 2) tramite retrotrascrizione l mrna viene copiato in cdna 3) il cdna viene amplificato tramite PCR, addizionato di code contenenti siti di restrizione e clonato in un vettore 7

8 Come si effettua la retrotrascrizione? Per effettuare una retrotrascrizione sono necessari: mrna stampo, dntps, un primer che appai al 3 dell RNA, l enzima trascrittasi inversa. La trascrittasi inversa sintetizza una catena di DNA complementare allo stampo di mrna, utilizzando i dntps, a partire da un innesco (primer) che possa appaiare al 3 dello stampo. Come primer al 3 si può utilizzare una molecola di oligo(dt) che lega il poly(a) di tutti gli mrna, oppure, un oligonucleotide specifico per il gene di interesse da amplificare. Una volta sintetizzata la prima catena di cdna, tramite PCR, questa viene amplificata. Librerie geniche Una genoteca è una collezione di geni o di frammenti genici o genomici, ciascuno clonato in un vettore di clonaggio. In una library di DNA non è dato sapere a quale gene corrisponda un dato clone. Per avere questa informazione dovremo effettuare uno screening della genoteca con le tecniche descritte nella lezione seguente. 8

9 Un altro aspetto importante di una libreria genica è la sua rappresentatività: una libreria si dice rappresentativa quando contiene, in almeno una copia, tutte le possibili sequenze. Un altra caratteristica delle librerie è quella di essere ridondanti, e di contenere molte copie di alcune sequenze, complicando la ricerca e selezione (screening) della sequenza che vogliamo clonare. Esistono due tipi di librerie: quelle di cdna e quelle genomiche. Preparazione di librerie Per preparare una library genomica occorre: a) Isolare il DNA genomico b) Digerirlo parzialmente con gli enzimi di restrizione c) Ligare i frammenti di restrizione in un vettore adatto d)trasformare delle cellule ospiti con i prodotti di ligazione 9

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11 Costruzione di una library di DNA genomico. Una library genomica si conserva come un set di batteri, ciascuno portante differenti frammenti di DNA. Per semplicità, si mostra il clonaggio di alcuni frammenti rappresentativi (colorati). In realtà, tutti i frammenti di DNA vengono clonati. Perché una libreria di DNA genomico umano sia rappresentativa occorre che essa contenga almeno un clone per ogni frammento del genoma umano. Poiché il genoma umano ha dimensioni di circa 3x10 9 bp, con una dimensione media degli inserti di 20Kb, Il numero di frammenti casuali che assicura un alta probabilità (95-99%) che siano rappresentate tutte le sequenze è, per gli esseri umani, circa 10 6 cloni. 11

12 In realtà, matematicamente, basterebbero 1,5x10 5 cloni, derivanti da (3x10 9 )/(2x10 4 ), ma in pratica sono necessari più cloni poiché l inserzione è casuale. Per le librerie genomiche si usano di solito i vettori cosmidici o del fago λ. Poiché questi vettori possono contenere inserti maggiori dei plasmidi, si hanno maggiori probabilità di clonare la sequenza di un gene che contiene sia la sequenza codificante sia gli elementi regolatori in un singolo clone. La library di cdna si ottiene con una procedura simile. In questo caso, però, occorre: 1) Purificare l RNA dalle cellule 2) Retrotrascriverlo in cdna, possibilmente utilizzando un primer portante un sito di restrizione al 5 3) Ligare i cdnas ottenuti nel vettore adatto (cercando, se possibile di effettuare un clonaggio direzionale) 4) Trasformare delle cellule ospiti con i prodotti di ligazione. 12

13 Differenze tra cloni di cdna e di DNA genomico derivanti dalla stessa regione di DNA. Il gene A è trascritto raramente, mentre il gene B frequentemente, entrambi i geni contengono introni (verde). Nella library di DNA genomico, sia gli introni sia i DNA rari (rosa) sono presenti nei cloni,e tutti i cloni contengono, parte della regione codificante (rossa). Nei cloni di cdna le sequenze introniche (giallo) sono state rimosse dallo splicing durante la formazione dell mrna (blu), ogni clone contiene la regione codificante. Poiché il gene B è trascritto più abbondantemente del gene A è più rapppresentato di A nella library di cdna. A e B sono ugualmente presenti nella library di DNA genomico. Note: La scelta dell enzima da utilizzare nella digestione dipende da vari fattori; supponendo, ad esempio, una distribuzione casuale di ognuna delle quattro basi nucleotidiche, una sequenza bersaglio si trova in media ogni 4096bp. Questo significa che la digestione del DNA genomico con EcoRI, che riconosce la sequenza 5 -GAATTC-3, produce frammenti di circa 4kb. La digestione con enzimi che riconoscono, invece, sequenze di 8bp produce frammenti molto più lunghi. Nella preparazione di librerie genomiche di genomi grandi (come quello umano) si utilizzano, perciò, enzimi che producono frammenti più lunghi. Il minor numero di frammenti prodotti, infatti, semplifica le fasi successive di clonaggio ed analisi della libreria. I frammenti di DNA prodotti con enzimi di restrizione che generano estremità coesive possono essere uniti a frammenti derivanti da un altro DNA qualsiasi, trattato con lo stesso enzima di restrizione. 13

14 L appaiamento tra le basi consente la giunzione di frammenti derivanti da DNA diversi. Tali appaiamenti sono transitori a causa della debolezza dei legami idrogeno che si formano tra le basi complementari, ma possono essere stabilizzati con l uso della ligasi che forma legami covalenti tra il gruppo fosfato al 5 di un estremità ed il gruppo ossidrilico al 3 della catena adiacente. Per librerie direzionali si intendono quelle clonate utilizzando due enzimi di restrizione diversi: ad es. nella RT-PCR si è utilizzato un primer reverse portante il sito di un determinato enzima (es. NotI) e i prodotti ottenuti sono stati poi digeriti con un altro enzima (es. SalI). Gli stessi enzimi vengono poi impiegati per preparare il vettore per il clonaggio. Le librerie di cdna vengono preparate a partire da tessuti/cellule diverse a seconda del gene di interesse poichè taluni geni vengono espressi in maniera selettiva. Le librerie di DNA genomico per un dato organismo sono tutte uguali tra loro, qualunque sia il tessuto di partenza o lo stadio di sviluppo cellulare. 14

15 Per le librerie di cdna, invece, è importante ricordare che ciascuna di esse è rappresentativa della popolazione di RNA dalla quale è stata ottenuta. Una specifica libreria di cdna contiene molti cloni derivanti da mrna particolarmente abbondanti e solo pochi da messaggeri rari. Se un gene è soggetto a splicing alternativo, inoltre, la genoteca contiene una serie di cloni corrispondenti alle diverse varianti. Qualora si voglia amplificare un gene particolare da un tessuto/cellula che lo esprime in proporzione minore rispetto ad altri geni, occorre arricchire gli mrna voluti prima di costruire la libreria. Ciò può essere fatto, ad esempio, tramite ibridazione sottrattiva: posto che esistano due popolazioni di cellule strettamente affini, di cui una sola produca la proteina desiderata, si deve innanzi tutto sintetizzare del cdna usando l mrna proveniente dal tipo di cellula che produce la proteina. 15

16 Questi cdna si ibridano poi con un eccesso di molecole di mrna proveniente dal secondo tipo di cellule (non esprimenti il gene di interesse). Le rare sequenze di cdna che non riescono a trovare un partner mrna complementare (rappresentanti, quindi, di sequenze di mrna presenti solo nel primo tipo di cellule) vengono purificate dalle altre che hanno formato un ibrido cdna/mrna (ad es. su colonna di idrossiapatite). Costruzione di una library 1. Isolare il DNA che contiene il gene di interesse x gene di interesse x es. BamHI 2. Digerire la sorgente di DNA ed il vettore con lo stesso enzima di restrizione x sorgente di DNA 16

17 3. Ligare il DNA di interesse nel vettore. Frammenti di DNA + ori Vettore di clonaggio restriction site DNA Clonato (inserto) x + X 4. Introdurre il DNA in un ospite. DNA library X + E. coli X Piastrare su agar 5. Identificare il clone di interesse Piastrare su un medium selettivo per trovare le colonie con il DNA clonato E. coli con il DNA clonato Identificare le colonie con il gene di interesse 17

18 I vettori da utilizzare per il clonaggio vengono scelti in base ad una serie di criteri. Innanzi tutto si valuta la loro capacità di accogliere DNA esogeno di grandi dimensioni (capacità di inserzione) e la facilità di manipolazione richiesta per la preparazione al clonaggio. Il clonaggio di inserti più lunghi di 5-10kb aumenta a tal punto le dimensioni del plasmide da rendere poco efficiente la trasformazione di ospiti batterici. Per il clonaggio di inserti molto lunghi, perciò, sono stati adattati a vettori dei batteriofagi (o fagi) cioè dei virus batterici. Molto comune è l impiego di derivati del batteriofago λ: l efficienza di clonaggio con questi è 16 volte superiore rispetto ai vettori plasmidici. Inoltre si possono usare altri vettori ad alta capacità, come cromosomi artificiali di lievito (YAC), cromosomi artificiali batterici (BAC) e cromosomi artificiali derivati da P1 (PAC). Tutti questi hanno il vantaggio di poter contenere inserti di DNA di dimensioni notevolmente superiori ai batteriofago λ. Il batteriofago λ è un fago di circa 49kb in grado di infettare E.coli con alta efficienza, inserendogli il proprio DNA attraverso la membrana cellulare. Penetrato nella cellula, il DNA fagico si replica e si moltiplica attraverso dei cicli di lisi cellulare e infezione delle cellule circostanti. Fino a produrre placche di cellule lisate su uno sfondo (o tappeto) di cellule batteriche. Il DNA virale, che contiene quello estraneo, può essere recuperato dalle placche e analizzato mediante mappe di restrizione, ibridazione con sonda ed elettroforesi su gel d agarosio. 18

19 Si indicano come genoteche amplificate quelle conservate oltre un primo utilizzo. Le piastre contenenti le placche di lisi possono venir lavate per raccogliere tutti i fagi ricombinanti in esse contenuti, fagi che rappresentano appunto una genoteca amplificata e che possono venir conservati congelati per anni. L amplificazione si realizza ogni volta che si infettano batteri con la progenie di fagi che derivano da ogni singolo clone ricombinante della piastra originale. Bisogna porre attenzione all uso di genoteche amplificate in quanto non tutti i ricombinanti sono in grado di propagarsi con la stessa efficacia. Quando una genoteca viene amplificata, perciò, la frequenza relativa di alcuni cloni può aumentare mentre quella di altri può ridursi a zero. Analisi della libreria L identificazione di un clone specifico in una genoteca di DNA può essere effettuata sfruttandone la sequenza del DNA o la struttura/funzione del prodotto che esprime. Il primo approccio può essere impiegato con qualsiasi tipo di genoteca, sia genomica che di cdna, e può basarsi sull ibridazione tra acidi nucleici o sulla PCR. 19

20 La ricerca di un prodotto proteico, invece, può essere effettuata solo a partire da genoteche di espressione, nella quali, cioè, i frammenti di DNA possono essere tradotti in proteine. In questo caso l identificazione di un singolo clone può essere effettuata utilizzando un anticorpo o un ligando specifico oppure un appropriato test funzionale, qualora l attività biologica della proteina sia conservata. Analisi tramite ibridazione: La tecnica dell ibridizzazione su colonia è il metodo più comunemente utilizzato per l analisi di genoteche, in quanto rapido e applicabile a tutti i tipi di librerie. a) Su una serie di piastre si fanno crescere un gran numero di cloni e questi vengono replicati su membrane di nylon o nitrocellulosa. b) Le colonie replicate su filtro vengono lisate tramite trattamenti con alcali c) Il DNA estratto viene denaturato e legato alle membrane (la disposizione delle colonie sulle piastre corrisponde alla disposizione del DNA su filtro) mediante essiccazione a 80 C. d) I filtri sono poi incubati con DNA marcato: in adeguate condizioni di stringenza (tamponi adeguati, conc. sonda adeguata, T adeguata) la sonda di DNA lega solo i frammenti clonati contenenti almeno in parte il gene di interesse. e) Rilevazione del legame tramite autoradiografia e recupero del clone dalla piastra. 20

21 Come si prepara la sonda? Si può ottenere del DNA marcato con radioisotopi tramite PCR: alla miscela di reazione si aggiunge un desossiribonucleotide radioattivo il DNA amplificato sarà perciò radioattivo. Tramite marcatura casuale: Il DNA viene denaturato e poi messo a contatto, in condizioni di rinaturazione, con una miscela di esanucleotidi che legano in maniera random il DNA stampo. sonde di DNA e RNA: Sonda: DNA o RNA marcati che possono legare un determinato DNA complementare. 32 P (Le sonde possono essere brevi oligonucleotidi con un marcatore radioattivo o fluorescente attaccato) 21

22 Uso di sonde di DNA 1. Rilevazione del DNA con sequenza complementare ad una sequenza nota 2. Rilevazione di geni che codificano proteine di sequenza parzialmente nota. Le sonde sono acidi nucleici con sequenza uguale o simile a quella che si vuole rivelare. Le sonde, inoltre, devono essere rilevabili: a tal fine vengono marcate. La marcatura può essere effettuata con un radioisotopo oppure può essere non radioattiva. Storicamente le prime marcature sono state fatte con radioisotopi I radioisotopi sono isotopi instabili di un elemento stesso numero di protoni, diverso numero di neutroni. Durante il decadimento radioattivo il radioisotopo cambia il numero di neutroni per arrivare ad una combinazione più stabile. L energia viene emessa come particelle β o raggi gamma. In biologia molecolare si usa frequentemente la marcatura con lo zolfo 35 ( 35 S) o con fosforo 32 ( 32 P). 22

23 Come si rilevano i segnali emessi dai radioisotopi? 1) La tecnica dell autoradiografia sfrutta il fatto che gli isotopi radioattivi impressionano le lastre fotografiche (i granuli di argento sono quantitativamente proporzionali all isotopo legato) 2) Un contatore geiger misura gli ioni prodotti in un gas da particelle β o da raggi gamma emessi da un radioisotopo. 3) In un contatore a scintillazione, un campione radiomarcato è mescolato con un liquido che contiene un liquido fluorescente Questo emette luce quando assorbe l energia delle particelle β o dei raggi gamma durante il decadimento radioattivo. Marcatura NON radioattiva. Vantaggi: Evita l uso dei radioisotopi (esposizione operatore) I substrati sono stabili più a lungo. Esempio: biotina legata all acido nucleico, rilevazione con streptavidina coniugata ad un enzima; Digossigenina legata al DNA, rilevazione con anticorpi anti-digossigenina. Cellule trasformate su nitrocellulosa 1. lisi delle cellule 2. denaturazione del DNA 3. legame della sonda in corrispondenza del target contiene un clone con sequenze complementari alla sonda 23

24 Stringenza Condizioni di ibridazione piu stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): maggiore Temperatura minore [ ] salina presenza di denaturanti chimici Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): minore Temperatura maggiore [ ] salina assenza di denaturanti chimici Analisi mediante PCR: Per isolare un clone specifico si effettua una PCR con una coppia di primers specifici. Invece di piastrare la genoteca su terreni con agar, le miscele di cloni vengono mantenute in piastre multi well (da 96 pozzetti di solito) I pool di cloni nei singoli pozzetti vengono sottoposti apcr I cloni contenuti in un pool positivo sono separati e ridistribuiti in un secondo set di piastre La procedura di identificazione e separazione viene ripetuta fino ad ottenere pozzetti con singoli cloni positivi. 24

25 PCR su colonia 1) Si fanno crescere i batteri 2) Si dividono i batteri in una serie di provette 3) Si infetta ciascuna serie di batteri con l appropriata quantità di pfu 4) Dopo il tempo opportuno, si aggiunge PhOH/CHCl 3 e si recuperano gli acidi nucleici 5) Si analizza tramite PCR ciascuna sotto-library 6) Le sotto-library che hanno dato segnale positivo vengono recuperate ed usate per infettare di nuovo i batteri 7) Si ripete lo screening fino ad ottenere pozzetti con singoli cloni positivi Si mette su una reazione di PCR per ogni clone che si vuole analizzare, risospendendo nella mix di PCR una parte della mix ottenuta della colonia.si utilizza una coppia di primers specifica per l inserto clonato Colony PCR M Il clone 5 contiene l inserto. I cloni 1,2,3,4,6,7,8 contengono solo il vettore. M è il marker di DNA. Analisi immunologica: Si basa sull impiego di anticorpi che riconoscano determinanti antigenici presenti nel polipeptide sintetizzato dal DNA di interesse. Si applica a genoteche di espressione e qualora sia disponibile un anticorpo specifico per la proteina cercata. La genoteca è piastrata ad una densità abbastanza elevata di cloni. 25

26 Si aggiunge IPTG proteine per indurre l espressione delle I polipeptidi ricombinanti sono adsorbiti su membrane di nitrocellulosa deposte sulla superficie della piastra Analisi mediante anticorpi Recupero della placca corrispondente al segnale positivo dalla piastra Uso di anticorpi per identificare i cloni di interesse DNA Library trasformazione E. coli colonie trasformate 1. replica su nitrocellulosa Colonie replicate su nitrocellulosa 2. Lisi delle colonie 3. legame dell anticorpo 4. Rivelazione dell anticorpo contiene un clone di DNA che esprime la proteina di interesse 26

27 Note: per l analisi con l anticorpo non è necessario che la proteina espressa sia funzionale. La regione riconosciuta è in genere un epitopo, ovvero una breve sequenza di amminoacidi che si ripiega in una particolare conformazione tridimensionale sulla superficie della proteina. Molti epitopi si formano anche in condizioni denaturanti, quando il resto della molecola non è correttamente foldata. In genere si usano anticorpi primari non marcati, specifici per la proteina di interesse, che, a loro volta, sono riconosciuti da un anticorpo secondario al quale è legato un marcatore enzimatico. Tale sistema consente di eliminare la necessità di usare Radioattivo e di amplificare il segnale. Gli anticorpi secondari sono coniugati, di solito, alla perossidasi di Armoracia rusticana (horseradischh o rafano tedesco) o alla fosfatasi alcalina. Ognuno di questi due enzimi può essere identificato con una semplice reazione colorimetrica. 27

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