Percorsi di laboratorio di II livello: raccomandazioni, criticità e consulenza genetica in diagnosi prenatale

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1 VII Congresso Nazionale S.I.T.E. IL FUTURO DELLE EMOGLOBINOPATIE Brindisi (Mesagne), settembre 2012 Simposio Medicina di Laboratorio Percorsi di laboratorio di II livello: raccomandazioni, criticità e consulenza genetica in diagnosi prenatale A. Giambona UOC di Ematologia per le Malattie Rare del Sangue e degli Organi Ematopoietici Direttore Prof. Aurelio Maggio Si ringrazia per il sostegno alla Ricerca U. O. C. Ematologia II A. O.OR Villa Sofia Cervello Laboratorio di Riferimento Regionale per lo Screening e la Diagnosi Prenatale di Talassemia ed Emoglobinopatie Responsabile Dr. Antonino Giambona

2 Lo screening di I livello Lo screening, utilizzando dei semplici test biochimici, ha lo scopo di dare delle indicazioni I protocolli di primo livello hanno lo scopo di ottenere una diagnosi attendibile, che è essenzialmente presuntiva. β-talassemia: lo screening permette di definire lo stato di portatore sano nella maggior parte dei casi. α-talassemia: non vi è uno specifico test di screening per il portatore sano di α- talassemia che spesso rimane una diagnosi di esclusione. Varianti Hb: il risultato ottenuto presuntivo dallo studio di primo livello rimane, spesso, un dato Per una diagnosi di certezza, nella maggior parte dei casi, è richiesta l analisi del DNA o l analisi della proteina.

3 Quando e perché ricorrere al laboratorio di II livello? Nel caso in cui si renda necessario definire una diagnosi di esclusione e/o presuntiva in quanto cui lo studio di I livello non risulta esaustivo (fenotipi complessi). Nel caso in cui lo studio di I livello mostri la presenza di una banda anomala in HPLC (varianti Hb). Per la completezza del referto di I livello (es. fecondazione assistita) Per eseguire la Diagnosi Prenatale Sospetta malattia Indagine post-natale di coppia a rischio che non ha eseguito la D.P.

4 β-talassemia: Fondamentale identificare i portatori sani. α-talassemia: Fondamentale identificare i portatori sani di: α -talassemia (HbH o Idrope fetale). L α + -talassemia può modificare il fenotipo classico del portatore sano di β talassemia. δ-talassemia: Fondamentale identificare i portatori sani di δ talassemia in quanto modifica il fenotipo classico dei portatori sani di β talassemia

5 Quando e perché ricorrere al laboratorio di II livello? Nel caso in cui si renda necessario definire una diagnosi di esclusione e/o presuntiva in quanto lo studio di I livello non risulta esaustivo (fenotipi complessi). Nel caso in cui lo studio di I livello mostri la presenza di una banda anomala in HPLC (varianti Hb). Per la completezza del referto di I livello (es. fecondazione assistita) Per eseguire la Diagnosi Prenatale Sospetta malattia Indagine di malattia post-natale in caso di coppia a rischio che non ha fatto la D.P.

6 Fenotipi Talassemici Complessi HbA 2 borderline con normocitosi HbA 2 borderline con microcitosi MCV ed MCH normali (> 80 fl, e > 27 pg) HbA 2 borderline o poco superiore alla norma ( %) MCV ed MCH ridotti (<80 fl, e < 26 pg)) HbA 2 borderline o poco superiore alla norma ( %) Microcitosi con HbA 2 ed HbF normali Microcitosi con HbA 2 molto elevata Microcitosi con HbA 2 normale ed HbF aumentata MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 3.2%, HbF 2% MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 > % MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 < 3.0% HbF > 4.0%

7 Fenotipi Talassemici Complessi HbA 2 borderline con normocitosi HbA 2 borderline con microcitosi MCV ed MCH normali (> 80 fl, e > 27 pg) HbA 2 borderline o poco superiore alla norma ( %) MCV ed MCH ridotti (<80 fl, e < 26 pg)) HbA 2 borderline o poco superiore alla norma ( %) Microcitosi con HbA 2 ed HbF normali Microcitosi con HbA 2 molto elevata Microcitosi con HbA 2 normale ed HbF aumentata MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 3.2%, HbF 2% MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 > % MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 < 3.0% HbF > 4.0%

8 % HbA NEG/-101 NEG/-92 NEG/NEG Genotipo NEG/-alpha3.7 NEG/ααα anti NEG/ IVS I nt 6 β 0 +δcd CAP α 3.7 /αα αα ααα Hb Varianti CAP Distribuzione dei genotipi rispetto ai livelli di HbA2 border-line in campioni con MCV 80 fl

9 RBC Hb MCV MCH HbA 2 HbF C T ααα/αα RBC 4.52 Hb 12,5 MCV 81,1 MCH 28,4 Hb KOKOMO β Cd 53 GCT>ACT RBC 4,85 Hb 14,1 MCV 87,6 MCH 29.0 Hb ACHARNES β Cd 74 GGC>AGC RBC 4,78 Hb 14,0 MCV 87,0 MCH 29,4 Hb Yaounde Mataro β COD 134 GTG>GCG RDW 12,6 RDW 13,5 RDW 12,0 HbF 0,5 HbF 1,10 HbF 0,50 HbA HbA 2 3,40 HbA 2 3,50

10 % HbA CAP NEG/-101 NEG/-92 IVS I.6 β 0 +δcd27 Hb Var Neg. Genotipo ααα Distribuzione dei genotipi rispetto ai livelli di HbA2 border-line in campioni con MCV <80 fl

11 Fenotipi Talassemici Complessi HbA 2 borderline con normocitosi HbA 2 borderline con microcitosi MCV ed MCH normali (> 80 fl, e > 27 pg) HbA 2 borderline o poco superiore alla norma ( %) MCV ed MCH ridotti (<80 fl, e < 26 pg)) HbA 2 borderline o poco superiore alla norma ( %) Microcitosi con HbA 2 ed HbF normali Microcitosi con HbA 2 molto elevata Microcitosi con HbA 2 normale ed HbF aumentata MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 3.2%, HbF 2% MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 > 6.0% MCV ed MCH ridotti (< 80 fl, e < 26 pg) HbA 2 < 3.0% HbF > 4.0%

12 RBC 4,14 RBC 5,65 RBC 6,44 RBC 6,25 Hb 10,2 Hb 14,4 Hb 13,4 Hb 14,2 HCT 31.2 HCT 43,7 HCT 41,4 HCT 44,3 MCV 75,0 MCV 77,3 MCV 64,5 MCV 70,9 MCH 24,8 MCH 25,5 MCH 20,9 MCH 22,7 RDW 14,0 RDW 12,0 RDW 11,0 RDW 13,5 HbF 0,50 HbF 0,30 HbF 0,80 HbF 0,50 HbA 2 2,80 HbA 2 2,60 HbA 2 3,10 HbA 2 2,80 Ferritina 18,0 Ferritina 22,0 Ferritina 29,0 Ferritina 18,0 β/β α 3.7 /αα β/β α HphI /αα β IVSI nt110 /β +δ Cd142 /δ αα/αα β IVSI nt 6 /β + δ Cd27 /δ αα/αα RBC 4,73 RBC 4,23 RBC 4,66 RBC 4,28 Hb 12,3 Hb 11,7 Hb 11,3 Hb 11,5 HCT 37.1 HCT 33,1 HCT 38.5 HCT 33.8 MCV 79,0 MCV 78,3 MCV 76,7 MCV 79,0 MCH 26,2 MCH 27,7 MCH 25,8 MCH 27,1 RDW 14,6 RDW 13,4 RDW 15,1 RDW 14,4 HbF 0,30 HbF 0.2 HbF 0,20 HbF 0,50 HbA 2 2,90 HbA 2 2,90 HbA 2 2,90 HbA 2 2,80 Ferritina 40,0 Ferritina 13,5 Ferritina 6,0 Ferritina 5,0 β Cod 51 /β αα/αα β Hb-Valletta cd 87 /β αα/αα β/β αα/αα β/β αα/αα

14 Hb-E β Cd 26 Lys > Glu Hb 15.4 MCV 75.5 MCH 27.0 HbA2 30,6% Hb-Lepore δ Cd 87 / β IVS2. nt 116 Hb 13.0 MCV MCH 26.8 HbA % HbD Iran HbOsu Christiansborg HbG Coushatta HbG Copenhagen δ β

16 Delezione δ βsiciliana RBC 5.50 Hb 12.5 MCV 65.0 MCH 22.5 RDW 12.5 Hb A 2 2.8% Hb F 11.1% a. Del bp ; b. Del bp; c. Del 1393 bp; d. Del 290 bp; e. Del. 531 bp

17 Quando e perché ricorrere al laboratorio di II livello? Nel caso in cui si renda necessario definire una diagnosi di esclusione e/o presuntiva in quanto cui lo studio di I livello non risulta esaustivo (fenotipi complessi). Nel caso in cui lo studio di I livello mostri la presenza di una banda anomala in HPLC (varianti Hb). Per la completezza del referto di I livello (es. fecondazione assistita) Per eseguire la Diagnosi Prenatale Sospetta malattia Indagine di malattia post-natale in caso di coppia a rischio che non ha fatto la D.P.

18 HbS Hb G- San Josè HbS/-α 3.7 RBC 5,32 Hb 14,3 HCT 42.5 MCV 84,7 MCH 29,8 RDW 12,1 HbF 0,80 HbA Banda patologica in zona Sw=39,3% RBC 4,39 Hb 12,7 HCT 36 MCV 81,9 MCH 29 RDW 13,1 HbF 0,3 HbA 2 2,5 Banda patologica in zona Sw=35,9% RBC 5,05 Hb 13,7 HCT 39,1 MCV 77,5 MCH 27,2 RDW 12,4 HbF 0,2 HbA 2 4,3 Banda patologica in zona Sw=34,3%

19 Hb O-Arab Hb C RBC 5,04 Hb 14,5 HCT 42,0 MCV 83,3 MCH 28,7 RDW 13,5 HbF 1,30 HbA 2 2,30 Hb Anomale Cw=38,3% β Cd 121 (GH4): GAA>AAA glu>lys RBC 4,00 Hb 12,5 HCT 34,9 MCV 92,0 MCH 32,9 RDW 12,3 HbF 0,50 HbA 2 3,10 Hb Anomale Cw=40,2% β Cd 6 (A3): GAG>AAG glu>lys

20 Quando e perché ricorrere al laboratorio di II livello? Nel caso in cui si renda necessario definire una diagnosi di esclusione e/o presuntiva in quanto cui lo studio di I livello non risulta esaustivo (fenotipi complessi). Nel caso in cui lo studio di I livello mostri la presenza di una banda anomala in HPLC (varianti Hb). Per la completezza del referto di I livello (es. fecondazione assistita) Per eseguire la Diagnosi Prenatale Sospetta malattia Indagine post-natale in caso di coppia a rischio che non ha fatto la D.P.

21 Laboratori di I livello inseriti in laboratorio di patologia clinica in aziende sanitarie, università e strutture private convenzionate o non convenzionate studio dell Hb mediante esame emocromocitometrico ed HPLC molti eseguono anche tipizzazioni molecolari con kit commerciali Laboratori di I e II livello specializzati nel settore delle emoglobinopate (analisi molecolare dei geni globinici e diagnosi prenatale) Criticità: Le emoglobinopatie sono patologie genetiche ed oggi in molte strutture è ancora carente la corretta gestione di queste analisi viste come semplici test di laboratorio di patologia clinica. In molti casi l approccio diagnostico è insufficiente a causa della modesta esperienza del personale in questo settore altamente specialistico. Ridotta conoscenza delle problematiche delle emoglobinopatie, difficoltà nella consulenza genetica e nella gestione del paziente. Scarsi i rapporti tra strutture private e strutture pubbliche specializzate. Mancanza di linee guida per la gestione del laboratorio di I e/o II livello.

22 Metodologie, raccomandazioni e criticità del laboratorio di II livello: Metodologia di base: Polymerase Chain Reaction (PCR) Alleli associati a delezioni Gap-PCR (delezioni note) MLPA (delezioni note e nuove) Alleli associati a mutazioni puntiformi note Dot Blot o Reverse Dot Blot ARMS Digestione enzimatica con endonucleasi DGGE Diagnosi di mutazioni note e non note D-HPLC DNA sequencing

23 Metodo Gap-PCR MLPA Dot Blot Reverse Dot Blot Vantaggi semplice, rapido, poco costoso, multiplex detection Tecnica semplice, rapida e permette di studiare l intero cluster genico nessuno Metodo non radioattivo, poco costoso se home made, permette lo screening simultaneo di molte mutazioni Svantaggi delezioni note, necessita di controllo per validare il test, possibilità di ADO Costoso per l acquisto dello strumento, esperienza per la valutazione del dato ottenuto metodo radioattivo, utilizzato per analizzare una sola mutazione per volta, necessita di molto tempo per l analisi di una mutazioni (24 ore), costoso necessita di notevole esperienza e di campioni di controllo per validare il metodo home made, Kit commerciali con affidabilità variabile tra differenti lotti e relativamente costosi per campione ARMS Tecnica semplice, rapida, non costosa, permette lo screening simultaneo di molte mutazioni necessita di notevole esperienza e di campioni di controllo per validare il metodo home made. Esperienza per la valutazione dei test diagnostici: amplificazioni aspecifiche (falsi positivi); nessuna amplificazione del campione (falsi negativi) Digestione Enzimatica Tecnica semplice e rapida non permette l analisi di tutte le mutazioni, necessita esperienza per la valutazione del dato di laboratorio, analisi costosa per alcuni enzimi, parziale digestione DGGE Tecnica semplice, rapida necessita esperienza per la valutazione del dato di laboratorio, è un metodo di rilevamento indiretto per cui necessita la conferma del dato. D-HPLC Metodo molto sensibile, automatico e basso costo per singolo test. necessita esperienza per la valutazione del dato di laboratorio, è un metodo di rilevamento indiretto per cui necessita la conferma del dato. DNA Sequencing Tecnica semplice, rapida, permette di stabilire l esatta sequenza di basi che compongono un frammento di DNA comprese le mutazioni puntiformi note, nuove e rare ed i polimorfismi, analisi relativamente poco costosa Costoso l acquisto dello strumento, esperienza per evitare l errata interpretazione dei dati per problemi metodologici (PCR aspecifica, artefatto della corsa elettroforetica )

24 Metodologie, criticità e raccomandazioni del laboratorio di II livello esperienza gli operatori del laboratorio devono essere particolarmente esperti, competenti e confidenti con le metodologie da utilizzare. Tutte le metodologie descritte sono raccomandate Quale metodologia utilizzare? Le tecniche utilizzate devono essere adatte alla ricerca delle mutazioni presenti in una specifica popolazione e di eventuale popolazione extracomunitaria presente Possedere più metodologie per potere effettuare tutti i test molecolari necessari I protocolli dovrebbero essere rivisti ogni 2-3 anni

25 Metodologie, criticità e raccomandazioni del laboratorio di II livello E consigliabile utilizzare almeno due tecniche alternative per la ricerca delle mutazione: una metodologia di base (DNA sequencing) il gene globinico deve essere sequenziato completamente il gene globinico deve essere sequenziato con primer forward e reverse una metodologia di conferma (RDB, ARMS, DE)

26 Uomo di origine siciliana Partner carrier di β Cod 39 RBC 6.50 HB 11.0 HCT 37.2 MCV 59.0 MCH 18.0 MCHC 30.1 RDW 17.7 A 2 5.9% F 0.5% 5 UTR Esone 1 Esone 2 Esone 3 Cd 1 30 IVS I 130 IVS II Cd Cd UTR β IVS1 nt 110 β Cd 126 (Hb Neapolis)

27 Uomo di origine siciliana Analisi I livello: normocitosi, HbA 2 2.6%, DW 37,3%. Diagnosi: Sospetto HbD carrier Analisi di sequenza del gene β globinico per analisi di β cod. 121 (GAA CAA) 5 UTR Esone 1 Esone 2 Esone 3 Cd 1 30 IVS I 130 IVS II Cd Cd UTR Risultato: Cod 121 CAA in omozigosi?????? Il frammento di DNA normale presentava due sostituzioni nucleotidiche (polimorfismi) mai riscontrati, che non hanno permesso al primer di PCR di legarsi sul frammento normale (ADO). Se si fosse verificato sul frammento mutato non avremmo confermato la mutazione del codone 121. Se ciò fosse avvenuto su un frammento che porta una mutazione puntiforme beta talassemica non saremmo stati in grado d identificare il difetto anche in un soggetto con fenotipo da portatore sano. Raccomandazione: Avere a disposizione differenti set di primer per analizzare lo stesso frammento di DNA Munirsi di primer differenti (forward e reverse per lo stesso frammento da sequenziare)

28 Problematiche post sequenza Presenza di una emoglobina variante nuova o rara Nuova variante dell emoglobina: quali sono le caratteristiche di tale variante? asintomatica, stabile, instabile, con alterata affinità per l ossigeno, falcizzante). Informazioni spesso insufficienti per molte varianti rare con dati scarsi sulla predettività fenotipica nel caso d associazione con alleli β Thal o β S Problematiche legate alla formulazione del referto e ad un adeguata consulenza genetica in coppie a rischio. Studio Familiare Ricerca bibliografica Consultazione con altri centri Presenza di una mutazione nuova in un codone che determina un trait talassemico Studio familiare

29 Presenza di sostituzioni nucleotidiche rare o nuove Studio Familiare Ricerca bibliografica Consultazione con altri centri

30 1707 G C IVS II nt 478 C A

31 CAP G > C ( 3 Poly-A) Poly-A RBC Hb MCV MCH HbA HbF Cd 39 /β E un polimorfismo oppure è da classificare come mutazione β talassemica con fenotipo atipico?

32 Sostituzioni nucleotidiche identificate durante analisi di sequenza (Casi isolati) RBC Hb MCV MCH HbA HbF IVS2. nt 380 T>C IVS2. nt 444 A>C IVS2. nt 527 A>G

33 IVS2. nt 478 C>A RBC Hb MCV MCH HbA HbF β Mut Neg Neg Neg Neg -101 ααα Neg Neg Neg Neg -Neg Sempre associata all HbG Copenhagen

34 12 b.p. 5 PolyA (+1570 T>C) polya RBC HB HCT MCV MCH MCHC RDW A 2 F % 0.8% % 0.5% % 0% β CAP /β A

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37 Consulenza genetica Scopi ed obiettivi: Informazioni sulla malattia ed il suo trattamento Rischio genetico di trasmissione della malattia Invito a studiare gli altri componenti familiari Illustrare le procedure di laboratorio e le problematiche diagnostiche ad esse associate Illustrare le procedure di prelievo del materiale fetale e le possibili complicanze Il rischio di errore I casi complessi : Interazione tra mutazione del gene β-globinico e casi di triplo gene α (ααα/αα) Interazione tra mutazioni β-mild, tra β con β-silenti, etc.. Interazioni tra alleli β-talassemici e varianti del gene β-globinico Considerazioni: Data la eterogeneità della β-talassemia, i sanitari deputati a svolgere il ruolo di consulenza devono avere conoscenze approfondite sulla espressione fenotipica delle mutazioni del gene β-globinico implicato nelle talassemie. Ciò rende più semplice la trasmissione della informazione alla famiglia.

38 Indicazione alla diagnosi fetale per Talassemia e varianti emoglobiniche β THAl /β THAL Mut. Severa / Mut. Severa β THAl /β THAL Mut. Mild / Mut. Mild β S /β THAL β S /β S β THAL / Lepore β S / Lepore Lepore / Lepore α /α δβ/δβ β S /β C β S /β D β Thal /β VARIANTE α /α +

39 Diagnosi Prenatale: il laboratorio di II livello Analisi molecolare su villo coriale, liquido amniotico, sangue fetale Accuratezza diagnostica Sicurezza dello stato di salute del feto e della madre Certezza del risultato Buona pratica di laboratorio Analisi su due differenti campioni di villo coriale o dividere il campione di liquido in 2 aliquote Controllo del villo coriale con microscopio ottico e dissezione del tessuto Utilizzare DNA di controllo e i DNA dei genitori durante l analisi del DNA fetale Utilizzare due differenti metodi per confermare la diagnosi

40 Diagnosi Prenatale: il laboratorio di II livello Buona pratica di laboratorio DNA FETALE Analisi delle mutazioni del gene β gobinico Analisi di Sequenza ARMS o RDB Analisi del DNA fetale per valutare: Contaminazione materna Contaminazione ambientale mis-paternità MLPA Gap-PCR Analisi di VNTR Analisi di STR PCR e migrazione su gel QF-PCR

41 Filippo Leto Celocentesi Filippo Cassara Diagnosi Prenatale Monica Cannata Diagnosi Prenatale Pina Lo Gioco Studio di I Livello MargheritaVinciguerra Analisi II livello Cristina Passarello Analisi II livello Diagnosi Genetica di Pre-Impianto (PGD) per talassemia e/o emoglobinoipatie in coppie infertili; Ricerca di mutazioni nel gene G6PD; Analisi molecolare della sindrome di Gilbert; Ricerca di mutazioni nel gene RPS19 per la Diamond Blackfan Anemia; Ricerca di mutazioni nei geni ENG ed ACVRL1 per la Sindrome di Rendu Osler; Ricerca di mutazioni nel gene MEFV per la Febbre Mediterranea Familiare; Genotipizzazione dell Rh su tessuto fetale (villo coriale, liquido amniotico e sangue fetale); Analisi molecolare delle aneuploidie dei cromosomi 13, 18, 21, X ed Y mediante QF-PCR; Dosaggi metabolici: Sideruria, Cupruria, Ferro intraepatico (LIC), rame intraepatico con sistema ad assorbimento atomico; Screening nel I trimestre di gravidanza per sindrome di Down mediante determinazione biochimica dei valori Free-β, e Papp-A; Test biochimici per la diagnosi delle anemie emolitiche: Pink test, Resistenze Osmotiche,Test al Calore.