Laurea Magistrale in Biologia

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1 Laurea Magistrale in Biologia Laboratorio del corso di Chimica Fisica Biologica Anno accademico 2009/10 SCOPO Determinazione dei parametri termodinamici associati alla denaturazione termica di una piccola proteina globulare. TECNICHE: 1. spettrofotometria UV/Vis 2. dicroismo circolare (CD) 3. spettrofluorimetria Materiale a disposizione: Soluzione tampone 20 mm sodio acetato, ph 5.0 (A) Soluzione tampone 20 mm sodio fosfato ph 7.0 (B) Soluzione tampone 20 mm sodio acetato e 50mM KCl, ph 5.0 (C) Una soluzione di lisozima ~ 1 mg/ml nel tampone (A) Una soluzione di ribonucleasi ~ 3mg/mL nel tampone (B) Una soluzione di DNA di 14 coppie di basi M nella soluzione tampone (C) Falcon da 50 ml e da 15 ml, Eppendorf da 1.5 ml e 2.0 ml, pipette Gilson P200 e P1000, phmetro 1

2 Parte preliminare* Preparare una soluzione tampone di sodio acetato 20 mm, ph 5.0. Prelevare 1 ml della soluzione di proteina in dotazione e trasferirla in un tubo da dialisi. Porre il tubo contenente la proteina in un beaker contenente la soluzione tampone. Portare il camera fredda e lasciare sotto agitazione per circa due ore. Preparazione della soluzione di DNA mediante annealing. * Nota : questa prima parte non verrà svolta per dare più spazio alla parte strumentale ma verrà fornita agli studenti direttamente la soluzione dializzata come descritto. ESERCITAZIONE n 1: n SPETTROFOTOMETRIA UV/Vis Registrazione dello spettro di assorbimento della soluzione di DNA a 25 C e determinazione della sua concentrazione. Registrazione dello spettro di assorbimento della soluzione di proteina a 25 C e determinazione della sua concentrazione. 2

3 Protocollo esercitazione 1. : spettrofotometria UV/Vis Vis (soluzione di DNA) Prelevare 100 µl della soluzione di DNA in dotazione e trasferirli in una celletta di quarzo da 0.1 cm di cammino ottico a volume ridotto. Registrare uno spettro di assorbimento a 25 C nell intervallo di nm. Determinare la concentrazione del DNA dall assorbanza della soluzione a 260 nm usando il coefficiente di estinzione molare di ε 260nm = M -1 cm -1. Protocollo esercitazione 1. : spettrofotometria UV/Vis Vis (soluzione di proteina) Trasferire la soluzione in dotazione in una celletta di quarzo di 0.5 cm di cammino ottico a volume ridotto. Registrare uno spettro di assorbimento a 25 C nell intervallo di nm. Determinare la concentrazione della proteina dall assorbanza della soluzione a 280 nm usando i seguenti valori del coefficiente di estinzione molare: Proteina lisozima ribonucleasi ε 280nm (M -1 cm -1 )

4 ESERCITAZIONE n 2: n DICROISMO CIRCOLARE Registrazione dello spettro di dicroismo circolare della soluzione di proteina a 25 C. Registrazione di una curva di denaturazione della proteina ottenuta seguendo la variazione del segnale di dicroismo circolare a 222 nm nell intervallo di temperatura scelto. Registrazione dello spettro di dicroismo circolare della soluzione di proteina a 95 C. Determinazione della variazione dell'entalpia e della temperatura di denaturazione della proteina. Protocollo esercitazione 2: dicroismo circolare a) Prelevare 100 µl di soluzione madre di lisozima portarla a 500 µl con il tampone (A) in una eppendorf da 1.5 ml. b) Prelevare 50 µl di soluzione madre di ribonucleasi e portarla a 700 µl con il tampone (B) in una eppendorf da 1.5 ml. c) Trasferire la proteina in una celletta di quarzo di cammino ottico di l = 0.1 cm. d) Registrare uno spettro di dicroismo circolare a 25 C nell intervallo di nm, utilizzando i seguenti parametri strumentali: larghezza di banda 2 nm, tempo di risposta 4 sec, velocità di scansione 20 nm/min. e) Registrare la curva di denaturazione termica seguendo la variazione del segnale a 222 nm riscaldando la soluzione di proteina da C (per il lisozima) e C (per la RNasi) ad una velocità di 1 C/min. f) Registrare uno spettro di dicroismo circolare alla massima temperatura nelle stesse condizioni descritte in c). 4

5 ESERCITAZIONE n 3: n SPETTROFLUORIMETRIA 1. Registrare lo spettro di fluorescenza di una soluzione di proteina nel tampone (A) a temperatura ambiente. 2. Registrare lo spettro di fluorescenza di una soluzione di proteina nel tampone (A) contenente guanidinio cloruro alla concentrazione di 7M, a temperatura ambiente. 3. Confrontare gli spettri ottenuti. Protocollo esercitazione 3. : spettrofluorimetria Prelevare 100 µl di proteina soluzione madre e portarla a 500 µl con il tampone (A) oppure (B) in una eppendorf da 1.5 ml e calcolare la concentrazione finale della proteina. Prelevare la stessa quantità di soluzione di proteina e portala a 500 µl con una soluzione 8M di GuHCl in una eppendorf da 1.5 ml e calcolare la concentrazione di GuHCl nella soluzione. Trasferire 500µL della soluzione in una celletta di quarzo per fluorimetria da 1 cm di cammino ottico e a volume ridotto. Registrare uno spettro di emissione di fluorescenza a temperatura ambiente, nell intervallo nm dopo eccitazione a 290nm, per il lisozima e a 280 nm per la ribonucleasi. Confrontare gli spettri ottenuti. 5

6 Il DNA Il DNA che verrà utilizzato per l esperimento di laboratorio è oligonucleotide di 14 coppie di basi. Il filamento di sequenza 5 -CCAGTCAAGTGTTC-3 e il complementare 3 -GGTCAGTTCACAAG-5 vengono mescolati in quantità equimolare, riscaldati a 95 C per 10 minuti e lasciati raffreddare a temperatura ambiente. Questo procedimento, detto di annealing, permette alla macromolecola di organizzarsi nella struttura di una doppia elica. La proteina Disegno della struttura 3D (codice PDB 2lyz) 1. Lisozima da bianco d uovo d di gallina Il lisozima è una piccola proteina enzimatica che si trova nel bianco d uovo di gallina, il cui substrato è una sequenza specifica della parete cellulare del batterio Micrococcus. È formata da 129 amminoacidi con 4 ponti disolfurici intracatena tra i gruppi sulfidrilici. È composta da una parte a prevalenza di α-eliche (dominio α) e una parte a prevalenza di foglietti β (dominio β). Per questo motivo si presta bene ad essere studiata mediante dicroismo circolare (CD). Diamond R. et al. (1974) Real-space refinement of the structure of hen egg-white lysozyme. J.Mol.Biol. 82:

7 Il lisozima ha 6 residui di triptofano, e 3 residui di tirosina e per questo motivo si presta bene anche ad essere studiata attraverso la fluorescenza. Il peso molecolare è Da e il coefficiente di estinzione molare a 280nm è M -1 cm -1. Sequenza amminoacidica KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESN FNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSR NLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVA WRNRCKGTDVQAWIRGCRL La proteina 2. Ribonuclerasi pancreatica bovina RNasi A L RNAsi A è una proteina piccola monomerica di 124 residui. E organizzata in tre α-eliche e in tre β-hairpins. Strutturalmente è caratterizzata dalla presenza di quattro legami disolfuro, due dei quali sono essenziali per il folding proteico, permettondo la formazione un piccolo nucleo idrofobico.l RNasi A è secreta in grandi quantità dal panreas bovino, presumibilmente per digerire l ampia quantità di RNA prodotta dagli esseri microbici presenti nel rumine. Tale proteina catalizza la scissione del legame P-O 5 del terzo sito del nucleoside pirimidinico dell RNA. Il taglio enzimatico è effettuato da due istidine catalitiche (His 12 e His 119). 7

8 sequenza: KETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPV NTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTMSITDCRE TGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASV Parametri termodinamici ottenuti per diverse proteine piccole e globulari, tra cui il lisozima 8