ANALISI SPETTROFOTOMETRICHE

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1 LICEO SCIENTIFICO. G.MARCONI FOGGIA PROGETTO DIOR Progetto pilota di didattica orientativa in ambito scientifico ANALISI SPETTROFOTOMETRICHE Determinazione qualitativa e quantitativa delle sostanze 18 giugno 2010 Alunni classe quarta G a.s ClaudiaDeSantis-Giovanni Forcelli-Fabio Graziani- Pompea Signorile- Isabella Vigiano - Alunni classe quarta G a.s Claudia De Santis Giovanni Forcelli Fabio Graziani Pompea Signorile Isabella Vigiano Docente Antonella Di Adila

2 LA SPETTROFOTOMETRIA E L INTERAZIONE TRA LA LUCE E LA MATERIA Laspettrofotometria t t è una tecnica analitica che permette la determinazione qualitativa e quantitativa di una sostanza, mediate lo studio della sua interazione i con una radiazione i elettromagnetica di opportuna frequenza.

3 Le grandezze fondamentali che caratterizzano una radiazione elettromagnetica sono: la lunghezza d onda λ misurata in nm la frequenza ν misurata in Hertz (sec -1 ) la velocità di propagazione c km/sec. nel vuoto La relazione che lega queste grandezze è : ν = c/λ. Ad ogni radiazione è inoltre associata un energia E che è legata alla lunghezza d onda dondamediante l equazione lequazione E = hν. h= costante di Planck Risulta, pertanto, che la radiazione con più alta energia è quella con più bassa lunghezza d onda.

4 LA RADIAZIONE LUMINOSA Per lunghezza d onda λ s intende la distanza lineare fra due punti equidistanti su onde successive ovvero la distanza reciproca tra due massimi o tra due minimi. Il periodo p della radiazione è il tempo, in secondi, richiesto per il passaggio di massimi o minimi successivi attraverso un punto fisso dello spazio. La frequenza ν è il numero di oscillazioni del campo per secondo Essa è determinata dalla sorgente e rimane costante indipendentemente dal mezzo attraversato dalla radiazione. L ampiezza A dell onda sinusoidale è definita come la lunghezza del vettore elettrico al massimo nell onda.

5 Le radiazioni elettromagnetiche possono essere classificate in base al valore di λ. L insieme delle onde elettromagnetiche costituisce lo spettro elettromagnetico ti La luce è un particolare tipo di onda elettromagnetica che si crea per rapidissima oscillazione di cariche elettriche.

6 L analisi spettrofotometrica I principi teorici che regolano l assorbimento della radiazione luminosa da parte di una sostanza trovano pratica applicazione nella spettrofotometria. E una tecnica analitica che permette di effettuare determinazioni: qualitative quantitative di una sostanza in forma di soluzione, mediante lo studio della sua interazione con una radiazione elettromagnetica.

7 Lo spettrofotometro Gli strumenti utilizzati sono gli spettrofotometri i cui componenti essenziali sono: 1. sorgente luminosa 2. dispositivo monocromatore 3. contenitore del campione 4. rivelatore 5. elaboratore di segnale SORGENTE MONOCROMATORE CAMPIONE RIVELATORE E SISTEMA DI ELABORAZONE E PRESENTAZIONE DATI

8 Il monocromatore E la parte dello strumento che consente di produrre radiazioni monocromatiche. La luce prodotta dalla lampada viene scomposta nelle singole radiazioni i i componenti. Si utilizzano monocromatori a reticolo e/o a prisma. Il prisma ottico rifrange le radiazioni i i in modo differente, in funzione della loro lunghezza d onda ed in funzione del materiale di cui è costituito il prisma (quarzo, NaCl, KCl). La larghezza di banda della radiazione trasmessa è funzione della larghezza della fenditura d uscita del raggio.

9 Il prisma e il reticolo Cambiando la posizione del prisma, cambierà la lunghezza d onda λ, che passerà attraverso la fenditura d uscita. Il reticolo è una superficie dura otticamente piana e levigata sulla quale sono stati realizzati un elevato numero di solchi paralleli e strettamente spaziati. Sono identificati in base al numero di righe o solchi/mm. In UV/ Vis si usano reticoli con solchi/mm. Più vicine sono le linee maggiore è la risoluzione

10 I contenitori dei campioni Sono chiamati cuvette o cellette. Devono offrire una trasparenza totale alle radiazioni monocromatiche. Per radiazioni U.V.: si usano cuvette di quarzo. Per la radiazione visibile: si adopera la plastica o il vetro comune o il polistirene. Nell I.R. si usano cristalli di KCl o NaCl.

11 LE CUVETTE Le cuvette sono a forma di parallelepipedo, con due facce completamente trasparenti, piane, parallele ed omogenee che sono quelle che dovranno essere attraversate dal raggio monocromatico, e le altre due zigrinate per facilitarne la presa e distinguerle dalle altre due. Hanno spessori compresi tra 0.2 ed 1 cm.

12 I rivelatori Il tipo più comune è un foto tubo. Esso consiste essenzialmente in un tubo in vetro o silice vuoto, contenente un catodo rivestito con metallo alcalino ed un anodo caricato positivamente. Quando la radiazione raggiunge il catodo, si verifica un rilascio di elettroni da parte del catodo per effetto fotoelettrico che genera una corrente d intensità proporzionale all intensità della radiazione in uscita dalla cuvetta. L energia della radiazione è E = hν.

13 Assorbimento della radiazione Le caratteristiche assorbenti di una specie, sono descritte mediante uno spettro ovvero un grafico in cui si esprime l attenuazione dell intensità della radiazione causata dal processo di assorbimento in funzione della lunghezza d onda della radiazione L assorbimento è quel processo in base al quale una determinata specie chimica, contenuta in un mezzo trasparente, attenua selettivamente l intensità di una radiazione di determinata lunghezza d onda,durante il suo passaggio attraverso essa.

14 Assorbimento della radiazione Due termini sono comunemente impiegati come misure quantitative dell attenuazione dell intensità della radiazione per effetto dell assorbimento: T trasmittanza - A assorbanza Alcuni concetti preliminari: trasmittanza del mezzo: frazione di radiazione incidente trasmessa dal mezzo. Se poniamo I = intensità del raggio trasmesso ed Io = intensità del raggio incidente è possibile definire la trasmittanza T in termini percentuali: T = I/Io x 100 assorbanza o densità ottica o Estinzione: frazione di radiazione assorbita A A = - log 10 T = - log 10 I/Io = log 10 Io/I

15 La misurazione spettrofotometrica Lo spettrofotometro dovrebbe consentire la determinazione della sola assorbanza generata dall analita d interesse,ad esempio un campione di clorofilla, in un campione di vino per la ricerca di antociani. La misurazione i spettrofotometrica t t Il solvente e la cuvetta dovrebbero offrire la trasparenza assoluta. T= 100%, A= 0. In realtà il solvente, la cuvetta e le impurezze presenti nella soluzione in cui è disperso l analita d interesse,generano un minimo di assorbimento. Le misure di assorbanza di una soluzione vengono, pertanto, effettuate contro bianco ovvero si sottrae all assorbanza assorbanza totale del campione l assorbanza residua generata dal solvente, dalle sostanze interferenti e dalle pareti della cuvetta.

16 assor rbanza 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Analisi qualitativa GRAFICO ASSORBANZA DEL PERMANGANATO DI POTASSIO lunghezze d'onda In spettrofotometria, l analisi qualitativa consiste nell effettuare rilevazioni dei valori dell assorbanza di un campione, in funzione della lunghezza d onda. Con tali valori si costruisce un grafico,lo spettro di assorbimento di una sostanza in soluzione. Ogni sostanza ha uno spettro caratteristico. Lo spettro è quindi un impronta digitale della sostanza in soluzione. Inoltre,èpossibile individuare il valore di lunghezza d onda in corrispondenza del quale si registra il massimo assorbimento.

17 L assorbanza e la Legge di Lambert e Beer Analisi i qualitativa i E necessario individuare il valore di λ per il quale si registra il massimo assorbimento perché in corrispondenza di esso si ha la sensibilità dell analita alla legge di Lambert & Beer, secondo cui piccole variazioni di concentrazione della sostanza determinano grandi variazioni i i di assorbanza. In breve e riepilogando: Lambert e Beer, due studiosi di spettrofotometria, hanno definito il concetto di densità ottica D,chiamata anche assorbanza A o estinzione E. 1 Essa corrisponde all espressione seguente: A=log T dove I 0 ed I sono l intensità della radiazione ione incidente e trasmessa, rispettivamente.

18 Legge di Lambert-Beer In particolare Legge di Lambert-Beer: A=log(I 0 /I) = log (1/T) = a b c = ε b M a è una costante di proporzionalità chiamata assorbanza specifica della sostanza; b corrisponde alla lunghezza del cammino ottico attraverso il mezzo; c rappresenta la concentrazione della soluzione attraversata dalla radiazione; ε assorbanza specifica molare; M: molarità

19 In laboratorio le esperienze realizzate Analisi qualitativa e quantitativa di una serie di soluzioni di KMnO 4 attraverso la costruzione della curva di calibrazione mediante il metodo dei minimi quadrati Determinazione qualitativa e quantitativa di clorofilla (estratto alcolico): adattamento didattico di una metodica ufficiale di analisi spettrofotometrica qualitativa e quantitativa Analisi spettrofotometrica degli antociani

20 Analisi qualitativa e quantitativa di una serie di soluzioni di KMnO 4 attraverso la costruzione della curva di calibrazione mediante il metodo dei minimi quadrati Si effettua l analisi spettrofotometrica di una soluzione acquosa di KMnO 4. Si tratta di una sale che ha una colorazione rosso - violacea. L esperienza, per comodità didattica è suddivida in 3 fasi: 1 fase: determinazione dello spettro di assorbimento di una soluzione di KMnO 4; 2 fase: analisi quantitativa mediante costruzione di una curva di taratura assorbanza vs concentrazione riferimenti teorici 3 fase: determinazione della concentrazione incognita di una soluzione di KMnO 4

21 Attività di laboratorio 10 dicembre 2009 Analisi qualitativa e quantitativa di una serie di soluzioni di KMnO 4 attraverso la costruzione della curva di calibrazione mediante il metodo dei minimi quadrati Lunghezza Assorbanz Lunghezza Assorbanza d onda a d onda ,023 0, , , ,021 0, ,236 picco massimo 540 0,23 0, ,02 0, , , , , , , , , , , , , ,031 ssorbanza a 0,15 0,1 0,05 0 GRAFICO ASSORBANZA DEL PERMANGANATO DI POTASSIO lunghezze d'onda

22 rilevazione assorbanza intorno al picco massimo λ= 530 nm assorbanza a 0,26 0,25 0,24 0,23 0,22 RISULTATI INTORNO AL PICCO MASSIMO DI ASSORBANZA DEL PERMANGATO DI POTASSIO 0, lunghezza d'onda assorbanz za valori registrati nell'intorno del picco massimo 0,260 0,255 0,250 0,245 0,240 0,235 0,230 0,225 0, lunghezza 530 d'onda S

23 Analisi quantitativa Una volta individuato il valore di λ in corrispondenza del quale si registra il massimo assorbimento, (nel nostro caso λ =530 nm), si determina l assorbanza di soluzioni a differente concentrazione di KMnO 4. Queste soluzioni sono state prodotte per diluizione di una soluzione madre. Le letture di assorbanza andranno effettuate sempre contro bianco. Per ciascuna soluzione si effettuano tre misurazioni ovvero tre repliche al fine di ridurre l effetto di errori accidentali sull entità del paramento misurato.

24 Retta di calibrazione I dati ottenuti servono a costruire la retta di calibrazione assorbanza vs concentrazione. Essa descrive la relazione lineare tra assorbanza e concentrazione della soluzione. La retta che meglio descrive tale relazione è la retta che vicino possibile tra i punti osservati. Tale retta si ottiene con il metodo dei minimi quadrati. passa il più Il metodo, elaborato da Gauss, è detto dei minimi quadrati perché la retta di interpolazione migliore rende minima la sommatoria dei quadrati degli scarti Σd 2 = Σ i (yi*-yi) 2 = minimo y* è il punto interpolato y è il punto osservato. Collegamento con la matematica

25 La costruzione della retta di taratura viene effettuata con il metodo dei minimi quadrati e permette il calcolo del coefficiente di estinzione. A tale scopo si effettua,successivamente,, la misura dell assorbanza di un campione incognito, e, tramite la curva di calibrazione, si può risalire alla sua concentrazione. Equazione dei minimi quadrati un esempio

26 Analisi quantitativa Si determina la concentrazione di una sostanza in soluzione derivandola dalla legge di Lamert & Beer, cioè ponendo la concentrazione come incognita dell espressione A = a b c da cui c = A/ab. L applicazione di tale formula richiede la conoscenza del coefficiente di estinzione molare specifico della sostanza (a o ε). E possibile rendersi indipendenti da ε ricorrendo a curve di taratura E possibile rendersi indipendenti da ε, ricorrendo a curve di taratura costruite con soluzioni standard della sostanza in esame a concentrazioni note (c1, c2, c3 etc), leggendo le rispettive assorbanze e riportando i valori su di un grafico

27 Nei laboratori di Chimica del Liceo Marconi e della Facoltà di Agraria-Unifg Realizzazione della curva di taratura assorbanza contro concentrazione e determinazione della concentrazione di KMnO 4 in una soluzione incognita λ Concentrazione Assorbanza 1 Assorbanza 2 Assorbanza 3 λ = 530 λ = 530 λ = 530 0,500 0,590 0,583 0,256 0,250 0,254 0,257 0,132 0,125 0,131 0,132 0,074 λ = 530 0,065 0,071 0,070 Queste soluzioni ivengono prodotte per diluizionei i da una soluzione madre. Le letture di assorbanza andranno effettuate sempre contro bianco (vedi sopra). Si impiegheranno soluzioni aventi le seguenti concentrazioni: 1.00 mm, 0.75 mm, 0.50 mm, mM e mm, oppure i valori riportati in tabella.

28 Costruzione della retta di calibrazione determinazione della concentrazione incognita di una soluzione di KMnO 4 0,700 Concentrazione Abs Abs Abs λ ,600 λ = 530 0,500 λ = 530 λ = 530 0,500 0,590 0,583 0, , , , ,132 0,400 0,300 0,200 Serie1 Serie2 Serie3 λ = 530 0,125 0,131 0,132 0,074 0,100 0,065 0,071 0,070 0,000 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600

29 Dati sperimentali fase 1: i nostri risultati GRAFICO ASSORBANZA DEL PERMANGANATO DI POTASSIO spettro di assorbimento assor 0,25 0,15 rbanza0,2 0,1 0,05 assorbanza a 0,300 0,250 0,200 0, , lunghezze d'onda 0,050 0, lunghezza d'onda

30 Dati sperimentali fase 2: i nostri risultati assorbanza a 0,26 0,25 0,24 0,23 0,22 RISULTATI INTORNO AL PICCO MASSIMO DI ASSORBANZA DEL PERMANGATO DI POTASSIO 0, lunghezza d'onda assorbanza a 0,260 0,255 0,250 0,245 0,240 0,235 0,230 valori registrati nell'intorno del picco massimo Se 0,225 0, lunghezza d'onda

31 Costruzione della retta di calibrazione determinazione della concentrazione incognita di una soluzione di KMnO 4 Dti Dati sperimentali lifase 3: i nostri risultati 0,700 0,600 0,500 0,400 Serie1 Serie2 0,300 Serie3 0,200 0,100 0,000 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600

32 Esperienze applicative Determinazione qualitativa e quantitativa di clorofilla (estratto alcolico): adattamento didattico di una metodica ufficiale di analisi spettrofotometrica qualitativa e quantitativa Analisi spettrofotometrica degli antociani

33 Cosa sono gli antociani Antociani (dal greco anthos = fiore, kyáneos = blu) o antocianine sono una classe di pigmenti idrosolubili appartenente alla famiglia dei flavonoidi. Le antocianine sono tra i più importanti gruppi di pigmenti presentineivegetali,esiritrovanonei fiori e frutti così come negli arbusti e nelle foglie autunnali. Il colore delle antocianine può variare dal rosso al blu e dipende dal ph del mezzo in cui si trovano e dalla formazione di sali con metalli pesanti presenti in quei tessuti. Nelle cellule gli antociani sono legati a molecole di zuccheri tramite i gruppi idrossili (-OH) in posizione 3 e 5. Queste strutture prendono il nome di antocianosidi. Il legame con gli zuccheri conferisce ai pigmenti maggiore stabilità e solubilità.

34 Analisi spettrofotometrica oto degli antociani a Gli antociani sono solubili in soluzioni acquose. Gli antociani assorbono nel visibile. Ciò permette di utilizzare la legge di Lambert-Beer per scopi quantitativi.. Gli antociani vengono estratti dalla matrice alimentare con una soluzione idroalcolica acidificata con acido cloridrico. Per semplicità si opera su un campione di vino tal quale. Gli antociani vengono quantificati per via spettrofotometrica ed espressi come malvina clorata (C 29 H 35 O 17 Cl). Il contenuto medio di antociani nei vini rossi è mediamente compresotrai150edi570mg/l 24-35

35 Parametri spettrofotometrici : intensità e tonalità di colore Le caratteristiche cromatiche di un vino sono definite da due parametri analitici: la tonalità l intensità elementi che subiscono variazioni con l evoluzione del vino e ne rivelano la qualità e lo stato di salute. Si determinano i valori di assorbanza a 420 nm corrispondenti all assorbimentoassorbimento del giallo 520 nm corrispondenti all assorbimento del rosso 620 nm corrispondenti all assorbimentoassorbimento del blu

36 Parametri spettrofotometrici : intensità e tonalità di colore Procedura: il campione di vino, introdotto nelle apposite cuvette, vengono effettuate tre letture a 420 nm, 520 nm e 620 nm. La tonalità di colore si calcola con la formula Abs 420 nm/abs 520 nm e corrisponde al livello di evoluzione del colore verso l arancio, che assume valori compresi tra: 0,5 e 0,7 nei vini giovani 1,2 e 1,3 nel corso dell invecchiamento I valori aumentano nel corso dell invecchiamento fino a raggiungere un limite massimo compreso tra 1,2 e 1,3.

37 Parametri spettrofotometrici : intensità e tonalità di colore L intensità colorante I.C. si calcola con secondo la formula Abs 420 nm + Abs 520 nm +Abs 620 nm. Varia largamente secondo i vini rossi e la varietà di origine. E compresa mediamente tra 0,3 e 1,8 -Contributo percentuale di ciascun colore: -Abs 420/ I.C. - Abs520/I.C.; -Abs620/I.C. Tali valori corrispondono al contributo di ciascuna componente colorata rispetto all intensità colorante complessiva (contributo del giallo, del rosso e del blu)

38 Analisi i spettrofotometrica t t degli antociani i 1,4 1,2 1 0,8 0,6 Serie1 0,4 0, Picco massimo di assorbimento a 520 nm

39 Lunghezza d onda assorbanza Lunghezza d onda assorbanza 400 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,161

40 Analisi qualitativa di estratto alcoolico di clorofilla Determinazione qualitativa e quantitativa di clorofilla (estratto alcolico): adattamento didattico di una metodica ufficiale di analisi spettrofotometrica qualitativa e quantitativa Verificare l assorbanza della clorofilla a 430 e 665 nm Diluire il campione Prima diluizione 5 ml di estratto di clorofilla + 5 ml di etanolo elaborazione dello spettro di Seconda diluizione 5ml di campione 1:2 + 5 ml di assorbimento e etanolo determinazione del massimo visibile in un intervallo compreso da 400 nm a 700 assorbimento link-metodica Fare le determinazioni spettrofotometriche nel visibile in unintervallo compreso da400 nm a 700 nm I dati sperimentali, anche se non relativi ad estratto purificato di clorofilla, rendono la metodica abbastanza attendibile a scopo didattico

41 Determinazione qualitativa e quantitativa di clorofilla (estratto alcolico) Estratto alcoolico di foglie lauro ceraso (diluizione 1:4) lunghezza d onda 680 nm 665 nm 500 nm 430nm link.metodica ABS 0,251 0,599 0,126 0,804 Link- grafico

42 Autori: Docente Antonella Di Adila Dipartimento di Scienze Alunni classe quarta G a.s Claudia De Santis Giovanni Forcelli Fabio Graziani Pompea Signorile Isabella Vigiano Contributi: Dott. Roberto Di Caterina Facoltà di Agraria Unifg Docenti del Dipartimento di Matematica e Fisica: Antonella Apicella Francesco Pallesca alunni delle classi terza H quarta e quinta sezioni G H per le determinazione spettrofotometriche, tabulazionedatisperimentali sperimentalielaborazione grafici