ISTITUTO DI EMATOLOGIA ED ONCOLOGIA MEDICA LORENZO E ARIOSTO SERÀGNOLI

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1 ISTITUTO DI EMATOLOGIA ED ONCOLOGIA MEDICA LORENZO E ARIOSTO SERÀGNOLI PROGETTO DI RICERCA ALTERAZIONI GENETICHE NELLE LEUCEMIE E LORO IMPATTO SU PROGNOSI E TERAPIA PROPONENTE MICHELE BACCARANI

2 Indice 1. BASI GENETICO-MOLECOLARI DELLE LEUCEMIE PER UNA STRATEGIA TERAPEUTICA INDIVIDUALIZZATA ALTERAZIONI COSTITUZIONALI NELLE EMOPATIE VARIABILITA INDIVIDUALE ED EPIGENETICA 2. IL PROGETTO BASI DI PARTENZA SCIENTIFICA DEL PROGETTO DI RICERCA 3. PRINCIPALI ALTERAZIONI GENETICO-MOLECOLARI COSTITUZIONALI NELLE EMOPATIE 4. LEUCEMIE ACUTE E CRONICHE PH+ la terapia - i farmaci 5. LE LEUCEMIE ACUTE NON PH+ la terapia - i farmaci 6. STRATEGIA ED OBIETTIVI strategia obiettivi generali obiettivi particolari 7. DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FASI DELLA RICERCA 8. RICADUTE 9. I LABORATORI 10. I RICERCATORI 11. LE RESPONSABILITÀ 12. LA SEDE DELLA RICERCA 13. I TEMPI 14. LE SPESE E LE RISORSE finanziamenti richiesti alla fondazione allegato: elenco delle apparecchiature richieste Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 1

3 BASI GENETICO-MOLECOLARI DELLE LEUCEMIE PER UNA STRATEGIA TERAPEUTICA INDIVIDUALIZZATA ALTERAZIONI COSTITUZIONALI NELLE EMOPATIE Lo sviluppo delle conoscenze delle basi molecolari della leucemie e dei tumori solidi hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi di insorgenza e progressione e hanno identificato un gran numero di potenziali bersagli per una terapia molecolarmente mirata. Il sequenziamento del genoma umano ha aperto nuove grandi prospettive diagnostiche e terapeutiche anche nelle leucemie. Le leucemie sono malattie del sistema emolinfopoietico che originano dalla espansione clonale di una cellula trasformata. Molte leucemie sono caratterizzate da alterazioni cromosomiche che contribuiscono in maniera fondamentale alla leucemogenesi. Le alterazioni cromosomiche possono essere numeriche con perdita o aggiunta di parti di un cromosoma o di tutto un cromosoma o strutturali; queste ultime possono determinare o la iperespressione di oncogeni causata dalla giustapposizione di un gene ad un promotore di un altro gene ubiquitariamente espresso o la rottura di un gene che codifica per una proteina, che spesso ha un ruolo centrale nella cellula, e la formazione di una nuova proteina di fusione. La conoscenza del meccanismo oncogenetico fondamentale e le alterazioni a livello molecolare che questo determina, con attivazione o repressione di altri geni, e con alterazione delle vie di trasduzione del segnale, è fondamentale per capire il meccanismo di insorgenza delle leucemie e quindi individuare il trattamento terapeutico mirato alla lesione genetica. Infatti la conoscenza di specifici riarrangiamenti cromosomici ha permesso di mettere a punto farmaci che hanno come target l alterazione molecolare responsabile dell insorgenza della malattia. Prototipi di questi farmaci sono l acido all-trans retinoico (ATRA) per la leucemia acuta a promielociti, caratterizzata dalla traslocazione t(15;17) che coinvolge i geni PML e RAR-α (recettore dell ac. Retinoico) e un altro farmaco intelligente, l STI571 o Glivec, che è un inibitore specifico della fosforilazione dell oncoproteina p210/p190, responsabile della leucemia mieloide cronica e del PDGFRalfa nelle leucemie ipereosinofili. La leucemia mieloide cronica (LMC) ha fornito uno dei principali modelli, in base al quale l identificazione di una tirosin-chinasi (TK) ibrida, specifica della leucemia (bcr/abl, P210, P190) ha condotto all identificazione e all applicazione terapeutica di un potente inibitore delle TK (Imatinib). Analogamente, le leucemie mieloidi acute (LMA) costituiscono invece un insieme di modelli più complessi, più eterogenei e meno conosciuti, Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 2

4 perché le basi molecolari sono certamente molteplici. Inoltre è noto che la via di trasduzione del segnale di Ras e la cascata delle MAP-kinasi, la via di Jak-Stat, la via della fosfoinositolo-3-kinasi e la via di Myc sono coinvolte nella trasformazione neoplastica della cellula, mediata da BCR-ABL. Queste vie di trasduzione del segnale sono le vie comuni utilizzate dalla cellula; farmaci che possono interferire con l attivazione o repressione di questi pathways o vie possono avere un ruolo nel trattamento delle leucemie acute e croniche. Ad esempio l attivazione del gene RAS richiede una modificazione post trasduzionale, una farnesilazione, che richiede l intervento di un enzima citosolico, la farnesiltransferasi. Nuovi farmaci anti-tumorali sono stati disegnati aventi come target questo enzima. Sono stati descritti numerosi inibitori della farnesiltransferasi (FTI), sia naturali che sintetici. Tutti gli FTI sono potenti inibitori della crescita di cellule tumorali sia in vitro che in vivo, e sono potenziali candidati per l uso come agenti terapeutici. Altri farmaci importanti, come gli inibitori dell istone deacetilasi, possono interferire con la trascrizione deregolata causata da alcune alterazioni cromosomiche leucemogeniche. L identificazione di queste alterazioni genetiche, in ogni fase della malattia e ad ogni età dell individuo permettono una terapia individualizzata e target molecolare specifica. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 3

5 VARIABILITA INDIVIDUALE ED EPIGENETICA Un gruppo di leucemie non presentano alla diagnosi nessuna alterazione cromosomica evidenziabile dal punto di vista citogenetico; l analisi molecolare risulta così difficoltosa. L introduzione dell innovativa tecnica dei microarray permette di identificare e di ampliare la conoscenza dei geni coinvolti nella trasformazione neoplastica: con un solo array si può analizzare l espressione di geni, con la possibilità di effettuare raggruppamenti e comparazioni di geni attraverso software di analisi statistiche. Questa tecnica ha diverse applicazioni: analisi di espressione genica, individuazione di mutazioni, analisi di polimorfismi, mappatura, etc. Per ciascun paziente è pertanto ipotizzabile la costruzione di un personale profilo di espressione, quasi un codice a barra, dei geni contenuti nel suo genoma, della sua leucemia, primo passo per una terapia specifica personalizzata. Inoltre, diverse modificazioni epigenetiche, (ossia non direttamente ereditate) lavorano insieme nella regolazione dell espressione genica. Tra queste, le modificazioni post-sintetiche del DNA e delle proteine cromatiniche sono di importanza estrema in quanto, interferendo con la struttura cromatinica, ne determinano il rimodellamento che è necessario all accessibilità dell informazione presente sul DNA. Le modificazioni genetiche del DNA sia costituzionale (varibilità individuale), sia acquisite (epigenetiche e somatiche) sono responsabili della maggior parte delle malattie tumorali e della loro risposta alla terapia. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 4

6 IL PROGETTO I ricercatori proponenti hanno sviluppato da tempo un forte interesse nel campo delle leucemie, ed hanno quindi elaborato un progetto di ricerca che trae origine dal modello della oncoematologia per estenderlo ad altre neoplasie. Il filo conduttore del progetto e' l'ideazione, la progettazione, l'identificazione ed infine la validazione applicativa di nuove strategie diagnostiche e di piattaforme biotecnologiche per la diagnosi delle alterazioni genetiche nei tumori e nelle emopatie-leucemie. Intendiamo validare "assay" diagnostici che identifichino precocemente e sensibilmente le alterazioni geniche neoplastiche e particolarmente quelle leucemogenetiche ed indirizzino il clinico a trattamento specifico. Proponiamo inoltre, test genetici molecolari basati sull'assetto polimorfico individuale al fine di comprendere e finalizzare l'interazione farmaco-individuo. Il progetto ha infine l obiettivo di ideare, promuovere, e valicare programmi e protocolli di terapia innovativi nel campo dell oncoematologia, estendendo la terapia molecolarmente mirata con inibitori di TK e con farmaci a profilo tossico moderato a fasce di malati sempre piu vaste, di persone anche anziane, ed in maniera individualizzata. Leucemie Per questa ragione il motivo conduttore della ricerca è identificato nello studio del coinvolgimento di tirosin-chinasi (TK) nelle leucemie e nelle sindromi mielo e linfo-proliferative croniche (BCR/ABL nella LMC). Si vuole, inoltre, analizzare le vie di trasduzione dei segnali attivate da una tirosino kinasi chiamata BCR/ABL, identificare nuovi target terapeutici a valle di BCR/ABL, riconoscere i meccanismi di resistenza all Imatinib (il suo principale inibitore), identificare mutazioni puntiformi del gene ABL responsabili della resistenza agli inibitori delle TK. Si vuole inoltre, proporre e testare altri inibitori di BCR/ABL nonchè altri agenti molecolarmente mirati. L azione degli inibitori delle TK verra anche indagato nella cura delle leucemie non solo croniche ma anche acute (c-kit, Flt3, PDGF-R, FGF-R, VEGF-R). Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 5

7 I ricercatori, svilupperanno i test e gli assay e applicheranno e valideranno i test su casistiche selezionate di pazienti e materiale biologico adeguato, in parte già raccolto. Sarà pure indagato lo studio del profilo di espressione genica prima e durante la terapia al fine di caratterizzare patterns di sensibilita e risposta terapeutica e di resistenza. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 6

8 BASI DI PARTENZA SCIENTIFICA DEL PROGETTO DI RICERCA I tumori e le leucemie in particolare hanno origine dalla interazione tra tre distinti fenomeni: 1) la predisposizione genetica ad accumulare danni del DNA e traslocazioni cromosomiche e 2) l efficacia dei meccanismi di difesa dell ospite (meccanismi di riparo del DNA, immunità, detossificazione) e 3) fattori ambientali. L Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L. e A. Seragnoli ha sviluppato un forte interesse nell area dei tumori ed in particolare delle leucemie, ed ha individuato un programma di ricerca che utilizza lo studio dei tumori e della leucemogenesi come modelli di patologie derivati da cause genetiche. Le nuove conoscenze, scaturite dal Progetto Genoma Umano, offrono vastissime potenzialità alla ricerca biomedica. Lo sviluppo recente della genomica è frutto dello sviluppo tecnologico degli apparati automatici per il sequenziamento del DNA dell'intero genoma umano. Gli studi di genomica funzionale permettono nuove strategie diagnostiche e terapeutiche per le migliaia di malattie a base genetica. Questa transizione tra il genoma e il postgenoma si prepara a trasformare le tendenze e gli orientamenti della biomedicina. Ciò sposta l'attenzione verso nuovi paradigmi: dall'eziologia, alla patogenesi delle malattie; dallo studio dell'azione, alla regolazione del gene; dalle malattie semplici, a quelle complesse; dall'analisi di un singolo gene, a più geni, famiglie geniche, vie metaboliche e sistemi; dallo studio di un singolo gene-malattia, alla suscettibilità alle malattie complesse; dall'analisi genomica (il patrimonio ereditario di una persona), all'assetto degli RNA cellulari (trascrittoma) e delle proteine (proteoma), alla distribuzione qualitativa e quantitativa degli intermedi metabolici (metaboloma). Un settore strategico di immediata applicazione per la post-genomica è lo sviluppo di nuovi farmaci e di terapie individuali, la cosiddetta farmaco-genomica personalizzata. E ormai dimostrato che i farmaci non hanno un attività terapeutica identica su tutti i pazienti. Questo è dovuto al fatto che molti geni sono polimorfici o subiscono modificazioni strutturali epigenetiche (metilazione, acetilazione, etc). L'approccio genomico permetterà non solo di catalogare e mappare le varianti geniche presenti nella popolazione, ma anche di prevedere, su basi genetiche, le reazioni dei pazienti a un determinato farmaco prima dell effettiva somministrazione della terapia. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 7

9 PRINCIPALI ALTERAZIONI GENETICO-MOLECOLARI COSTITUZIONALI NELLE EMOPATIE Le leucemie Philadelphia positive (Ph+) sono un problema clinico molto grave perché ancora oggi sono in gran parte inguaribili. Però esse costituiscono anche un modello biologico peculiare e importante, dal momento che ne conosciamo le basi molecolari e cominciamo ad avere la possibilità di affrontare terapie molecolari mirate, specifiche nei confronti della leucemia. Queste conoscenze debbono essere sviluppate molto rapidamente, in tempo reale, sia perché il loro sviluppo può portare a una svolta radicale della terapia delle leucemie Ph+, sia perché sono un modello di straordinaria importanza per la moderna oncologia e per tutta la medicina molecolare. Allo scopo di sviluppare queste conoscenze in tempo reale e in modo coordinato, si è costituito questo Gruppo di ricerca, formato da ricercatori che hanno un background scientifico e clinico solido e specifico nell'area delle leucemie Ph+. Il termine di cromosoma Philadelphia, nato dalle osservazioni morfologiche di Nowell nel 1960, copre un complesso di translocazioni reciproche fra il cromosoma 9 e il cromosoma 22, che portano alla costituzione, quasi sempre sul cromosoma 22, più raramente altrove, di un nuovo gene, che non esiste nelle cellule normali, risultante dalla fusione del gene c-abl (cromosoma 9) con il gene bcr che si trova sul 22. Il gene c-abl, che è l'omologo cellulare del gene della leucemia murina di Abelson, sodifica per una Tirosin-Kinasi (TK) fisiologicamente coinvolta nel controllo della proliferazione e dell'apoptosi. Il nuovo gene ibrido, BCR/ABL, produce anch'esso una TK, localizzata nel citoplasma, la cui autofosforilazione attiva un complesso di molecole adattatrici e di segnali che con meccanismi multipli, e solo in parte conosciuti, determinano la trasformazione della cellula staminale emolinfopoietica. In sintesi, l'attività TK delle proteine BCR/ABL conduce all'attivazione, impropria e persistente, del sistema Ras e attraverso Ras del sistema delle protein- kinasi attivate dai mutageni (MAPK); del sistema della fosfatidil-inositolo 3-kinasi (PI3K) che conduce fra l'altro all'induzione di myc e di bcl2; del sistema di segnali legato alle proteine CRKL che sono capaci di interagire con altri sistemi di segnale quali i fattori di scambio dei nucleotidi guaninici, le proteine Cbl e le proteine Cas; della via Jak-Stat, che è la via attivata da molti recettori per le linfochine e per i fattori di crescita. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 8

10 L'attivazione di questi sistemi determina la trasformazione delle cellule staminali emolinfopoietiche: controllo difettivo dei processi di proliferazione e differenziazione, protezione dall'apoptosi e difetti di adesione e ancoraggio al microambiente emopoietico. Gli effetti biologici dei geni BCR/ABL, le loro conseguenze cliniche (tipo di leucemia, progressione della leucemia) e le loro conseguenze terapeutiche (sensibilità agli agenti molecolarmente mirati, ecc.) dipendono sia dalle proteine BCR/ABL che dal grado e tipo di attivazione delle vie attivate da esse. Le rotture e le fusioni possono verificarsi in diversi punti del gene abl e soprattutto in diversi punti del gene bcr, con la formazione di geni diversi, trascritti diversi e proteine di diverse lunghezze e caratteristiche funzionali. La formazione di proteine diverse può anche essere la conseguenza di meccanismi di splicing alternativi dell'rna messaggero. Inoltre è noto che la quantità dei trascritti e delle proteine può variare considerevolmente. D'altra parte la molteplicità delle vie aperte da BCR/ABL suggerisce che il messaggio che da esso parte possa essere raccolto e sviluppato diversamente, in rapporto alle caratteristiche fenotipiche e genotipiche delle cellule, e soprattutto che l'impiego in combinazione di farmaci che hanno bersagli molecolari diversi, a valle di BCR/ABL, possa essere più vantaggioso e ridurre le resistenze. La LMC è una malattia neoplastica delle cellule staminali emolinfopoietiche, caratterizzata in una prima fase da un'eccessiva produzione di leucociti, talora di piastrine, e da splenomegalia mieloide. Nei paesi occidentali la frequenza della LMC è stimata in circa 15 casi per milione di persone di ogni età per anno, il che corrisponde a casi/anno per l'italia e a 3500/4000 casi/anno per l'europa. Poiché la LMC è molto rara nei bambini e diventa più frequente con il crescere dell'età, il numero di casi attesi nei prossimi anni è superiore a quello osservato negli anni scorsi. Nel corso del XX secolo la LMC è stata curata con radiazioni ionizzanti, fino agli ultimi anni 50, e poi con antiblastici (prevalentemente Busulfano e Idrossiurea) fino alla fine degli anni 80, e in parte ancora oggi. La terapia antiblastica non è in grado di impedire la progressione della leucemia dalla fase di esordio, cronica, compatibile con la vita, alla fase terminale, accelerata o blastica, molto simile a una leucemia acuta secondaria e incompatibile con la vita. Con la chemioterapia convenzionale quindi la sopravvivenza mediana era di circa 4 anni e il numero di pazienti che viveva più di 10 anni era inferiore al 10%. Nella seconda metà degli anni 70 cominciò ad essere applicato alla terapia della LMC il trapianto di midollo osseo allogenico, che divenne rapidamente l'opzione terapeutica prima e principale. Tuttavia, benchè il trapianto possa certamente guarire la LMC, esso è una procedura ad alto costo, ad alta morbilità e mortalità (circa 1/3 dei trapiantati muore per complicazioni legate al trapianto) e non del tutto sicura (circa il 20% dei trapiantati ha una ricaduta della leucemia). Dai primi anni 80 è stato introdotto nella terapia della LMC l'alfa-interferone (α-ifn). I primi studi di fase II-III hanno dimostrato che l'ifn da solo induce remissioni ematologiche complete in molti pazienti (più del 50%) e, anche remissioni citogenetiche stabili, complete o parziali. Studi clinici prospettici controllati hanno dimostrato che la terapia con IFN è superiore alla chemioterapia convenzionale in termini di risposte citogenetiche e di sopravvivenza. La terapia con IFN ha segnato una svolta nella terapia della LMC, proponendosi come la prima forma di Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 9

11 terapia "intelligente" della LMC. Tuttavia l'introduzione e l'applicazione dell'ifn sono ancora recenti, e molto resta da capire e da fare per migliorare il rendimento terapeutico. LEUCEMIE ACUTE E CRONICHE PH+ La maggior parte delle LA Ph+ sono linfatiche (LAL). Esse sono rare nei bambini e aumentano di frequenza con l'aumentare dell'età, fino a raggiungere quasi il 50% di tutte le LAL dell'anziano. Le LAL Ph+ hanno una prognosi pessima, in tutte le età della vita: la percentuale di remissioni complete è bassa e le RC durano poco; più della metà dei casi ricade entro un anno e quasi tutti i casi ricadono entro due anni. E ciò benchè ai casi di LAL Ph+ siano applicati programmi di terapia intensiva che si completano ogni volta che è possibile con un trapianto di midollo allogenico e talora anche con l'ifn. Ma a differenza della LMC, né il trapianto né l'ifn hanno modificato in modo sostanziale la prognosi. Le LAL Ph+ restano un grandissimo problema terapeutico e sono le candidate più urgenti a nuove terapie molecole orientate. LA TERAPIA - I FARMACI La storia e lo stato attuale dell'arte della terapia delle leucemie Ph+ sono stati sintetizzati nelle sezioni precedenti. I risultati sono ancora poco soddisfacenti, ma vi sono numerose prospettive di sviluppo sia nel campo della terapia cellulare (trapianti allogenici e autologhi, impiego di linfociti allogenici) e dell'immunoterapia (vaccini proteici, cellule dendritiche pulsate), che in quello dell'ifn e della terapia molecolare mirata. Ciascuna di queste aree merita progetti di ricerca specifici. Questo progetto è dedicato alla terapia molecolare, compreso l'ifn. a) Interferone (IFN) - L' IFN costituisce attualmente l'agente terapeutico più efficace per curare la LMC e può talora essere utile anche nella terapia delle LAL Ph+. Nella LMC alcuni dati e fatti importanti sono ben noti, ma necessitano ancora di spiegazioni: 1) la LMC in fase cronica avanzata e in fase accelerata o blastica non è sensibile all'ifn, 2) in fase cronica precoce meno della metà dei casi rispondono all'ifn con una risposta significativa e duratura, 3) la maggior parte dei casi che hanno un beneficio sostanziale dall'ifn, hanno una malattia a basso rischio, sia secondo la classificazione di Sokal che secondo la nuova classificazione europea. Questi fatti clinici suggeriscono fortemente che esistano o si sviluppino meccanismi molto efficienti di resistenza all'ifn, che sono verosimilmente legati all'acquisizione di altre anomalie geniche, all'amplificazione o all'iperespressione del gene BCR/ABL, al silenziamento delle vie che transducono i segnali accesi dall'ifn o all'attivazione di vie che bypassano l'azione dell'ifn. Sul piano biologico gli effetti specifici dell'ifn sulle cellule Ph+ sono conosciuti poco e parzialmente. E' stato dimostrato che l'ifn modifica (normalizza) l'espressione di diverse molecole che regolano la mobilità e l'adesione allo stroma delle cellule Ph+ e quindi regolano la loro capacità di Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 10

12 rispondere agli stimoli proliferativi e differenziativi. Ed è stato osservato che l'ifn può ridurre significativamente il livello di trascrizione dell'oncogene BCR/ABL. Ma gli effetti biologici dell'ifn sono potenzialmente molto numerosi, pleiomorfi, e dipendono da numerosi sistemi molecolari che le cellule leucemiche possono aprire, chiudere e modulare, in particolare i recettori per l'ifn, le TK della famiglia Janus, che sono il primo sistema attivato dal legame dell'ifn con il suo recettore, le proteine del sistema STAT, il sistema dei substrati dei recettori dell'insulina (IRS) e della fosfatidil-inositolo-3'- kinasi (PI-3'-K), le proteine CBL (p 120abl) e CrK, ed altre ancora. L'interesse per il ruolo e l'utilizzo dell'ifn nelle leucemie Ph+ non è quindi "spento" perchè è necessario conoscere meglio i meccanismi molecolari di sensibilità e resistenza e capire come associare l'ifn ad altri agenti, in particolare agli altri agenti molecolarmente mirati che sono oggetto di questo programma di studio. Molti ricercatori afferenti a questo progetto hanno una lunga esperienza specifica nello studio delle leucemie Ph+ e dell'ifn, sia a livello biologico che a livello clinico. b) Gli inibitori delle tirosino-kinasi (TKI) e gli inibitori della trasduzione del segnale neoplastico - Siccome le proteine oncogeniche codificate da BCR/ABL sono delle TK, l'inibizione dell'attività TK può spegnere la trasformazione leucemica e essere clinicamente utile per curare la leucemia. Vi sono diversi interessanti TKI. fra i quali sembrano particolarmente promettenti i derivati pirimidinici. Questo progetto si concentra in particolare su un derivato della 2-phenilaminopirimidina, prodotto dalla ricerca Ciba Geigy nel 1995 con la sigla CGP e sviluppato in seguito da Novartis con la sigla STI571 (Glivec). Questo farmaco inibisce l'autofosforilazione di ABL, di BCR/ABL, di ckit e del platelet derived growth factor (PDGF), ma non quella delle altre TK. STI571 inibisce in modo selettivo la crescita in vitro delle cellule Ph+ e inibisce la crescita in vivo di cellule leucemiche Ph+ trapiantate in topi nudi. STI 571 è entrato in sperimentazione clinica nell'estate del La sperimentazione è stata condotta da Schering Plough prima negli Stati Uniti (Portland, Los Angeles e Houston) e poi su scala internazionale, compresa l'italia. I risultati preliminari di questa sperimentazione, aggiornati all'ultimo Meeting dell'american Society of Hematology (S. Francisco, dicembre 2000) sono i seguenti: nei pazienti in fase cronica, resistenti all'ifn o intolleranti all'ifn, le risposte ematologiche all'sti571 si avvicinano al 100% e le risposte citogenetiche complete e parziali si avvicinano al 50%, fra il 6 e il 12 mese di terapia. Nei pazienti in fase accelerata le risposte ematologiche superano il 50% e si osservano risposte citogenetiche in circa il 20% dei casi. Nei pazienti in fase blastica e in quelli con LAL Ph+ in ricaduta le risposte ematologiche sono inferiori al 50% e sono di breve durata e le risposte citogenetiche sono rare. In tutti i pazienti la tossicità della terapia è minima; in particolare non vi sono eventi avversi o effetti collaterali del tipo di quelli che si registrano con la chemioterapia antiblastica convenzionale. Successivamente, nell'estate del 2000, la sperimentazione del farmaco in Italia si è allargata a tutti Centri del Gruppo Cooperatore Italiano per lo Studio della LMC, cui afferiscono tutte le unità proponenti questa ricerca, con segreteria centrale presso le unità Baccarani/Bologna e con laboratori di riferimento presso Baccarani/Bologna. STI571 costituisce oggi il riferimento terapeutico più promettente per la Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 11

13 LMC, perché è un farmaco "intelligente", specifico e non tossico. Tuttavia non si conoscono ancora gli effetti a medio-lungo termine, né quelli terapeutici né gli eventuali effetti tossici. Inoltre è già evidente che esistono resistenze all'sti571. Le resistenze sono state osservate in vitro e soprattutto in vivo, poiché i pazienti in fase accelerata e ancora di più quelli in fase blastica o con LAL Ph+ rispondono poco e temporaneamente all'sti571. Esiste quindi un ampio spazio, biologico e clinico, che deve esser colmato di conoscenze, rapidamente, in tempo reale. c) Gli inibitori del sistema Ras - Il sistema Ras (H-Ras, N-Ras e K-Ras) è costituito da proteine con attività GTPasica (guanosin-trifosfato idrolasi) che passando ciclicamente tra due conformazioni (Ras- GDP e Ras-GTP) attivano molti altri segnali, mediati dai cosiddetti effettori di Ras : Ral-GEF, Raf, PI-3K e MEKK. Diversi recettori attivano Ras, facendola passare dalla sua conformazione legata al GDP a quella legata al GTP, e tali recettori sono a loro volta attivati dal legame di linfochine o fattori di crescita. Anche il percorso di trasduzione del segnale innescato dalle proteine BCR/ABL confluisce su Ras. La disattivazione di RAS e/o dei suoi effettori può quindi avere un ruolo terapeutico importante nelle leucemie Ph+. Esistono differenti inibitori di Ras, con differenti meccanismi d'azione. Due categorie importanti sono costituite dagli inibitori della farnesil transferasi (FTIs) e dagli inibitori della geranilgeranil transferasi I (GGTI), due enzimi che sono necessari per modificare chimicamente Ras, ancorandolo alla membrana della cellula e rendendolo disponibile all'attivazione. Studi recenti hanno sollevato particolare interesse su due FTIs. Uno è il composto Schering-Plough (SCH 66336), che è già stato testato in vitro su cellule Ph+, con effetti biologici molto promettenti. Un altro è il composto Janssen-Cilag R Questi ed altri FTIs e GGTIs meritano di essere testati in vitro e clinicamente, da soli ed in associazione con altri agenti, nella terapia delle leucemie Ph+. LE LEUCEMIE ACUTE NON PH+ Le basi genetiche e molecolari delle leucemie acute Le leucemie acute presentano il massimo picco di incidenza oltre i 60 anni. Tuttavia colpiscono anche i giovani. La maggiore frequenza della patologia nell'anziano si associa peraltro alla diminuita compliance fisica, con il risultato di ridurre in maniera importante la possibilità di curare questi pazienti. Due terzi delle leucemie acute alla diagnosi presentano alterazioni cromosomiche valutabili mediante citogenetica classica. Sono ormai noti numerose traslocazioni cromosomiche e geni di fusione ad essi associate che caratterizzano sottotipi di leucemie mieloblastiche e linfoblastiche acute: solo per citarne alcune, l inversione pericentrica del cromosoma 16, che determina la formazione del gene di fusione CBFβ- MYH11; la traslocazione t(15;17), che provoca la formazione del gene ibrido PML-RARα la traslocazione t(8;21), anch essa responsabile della creazione di un gene aberrante derivante dalla giustapposizione dei geni AML-1 ed ETO. Molte di queste alterazioni citogenetiche sono clonali, ricorrenti e contribuiscono in maniera fondamentale alla leucemogenesi. Sono stati individuati 2 meccanismi oncogenetici: 1) overespressione di oncogeni dovuta alla giustapposizione del gene ad un Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 12

14 promotore cellula-specifico; 2) riarrangiamenti cromosomici che determinano la rottura di proteine, spesso con un ruolo centrale nelle funzioni cellulari, e la formazione di nuove proteine di fusione. La presenza di specifici riarrangiamenti cromosomici sembra avere un valore prognostico e implicazioni terapeutiche. In particolare, alterazioni cromosomiche che coinvolgono la banda 11q23 generalmente sono associate a cattiva prognosi, mentre pazienti affetti da leucemia acuta con alterazioni cromosomiche quali inv(16), t(8;21) o t(15;17) hanno una prognosi favorevole. Nel caso della t(15;17), questo è dovuto principalmente alla maturazione dei blasti leucemici in risposta al trattamento con acido all-trans retinoico. La combinazione terapeutica ATRA con chemioterapia ha permesso di ottenere remissioni durature e sopravvivenza -prolungata. Come descritto precedentemente, gli inibitori delle tirosin kinasi (STI571), attivi in leucemie con t(9;22), dove l attività tirosin-kinasica di Abl è costitutivamente attivata sono ora utilizzati in trials clinici. Altri farmaci importanti, che hanno lo scopo di interferire con la trascrizione deregolata causata da alcune alterazioni cromosomiche leucemogeniche, sono gli inibitori dell istone deacetilasi (TricostatinaA, Depsipeptide, SAHA, etc.) Mediante RT-PCR è possibile, conoscendo le alterazioni molecolari alla base della malattia, valutare la presenza di queste alterazioni, e la malattia minima residua e in alcuni casi predire un imminente relapse con la possibilità ulteriore di intervenire terapeuticamente in anticipo. Alterazioni cromosomiche che coinvolgono la banda 3q definiscono un subset di pazienti con leucemia acuta mieloide. In particolare, le bande 3q21 e 3q26 sono contemporaneamente coinvolti nella inv(3) e nella omologa t(3;3). Queste aberrazioni sono osservate nel 1-5% dei pazienti con leucemia acuta mieloide (LMA), in sindrome mielodisplastica o leucemia mieloide cronica (LMC) in crisi blastica. Le caratteristiche cliniche associate con inv(3) e t(3;3) sono: malattia molto aggressiva, scarsa risposta alla chemioterapia convenzionale, ricaduta precoce e breve sopravvivenza. I pazienti con alterazioni 3q hanno frequentemente un numero normale o elevato di piastrine e un pool espanso di megacariociti displastici con maturazione nucleare e citoplasmatica alterata. Due geni, localizzati a livello della banda 3q26, sono stati implicati nello sviluppo e progressione delle leucemie mieloidi: Evi1 e Mds1. Evi1 codifica per una proteina nucleare legante il DNA; è stato inizialmente clonato attraverso esperimenti disegnati per identificare geni capaci di determinare l insorgenza di leucemia in modelli murini. E stato anche mostrato che Evi1 interferisce con la differenziazione eritroide e granulocitaria in alcuni modelli sperimentali. Tutto questo conduce a identificare una chiara correlazione fra espressione inappropriata di Evi1 e alterazioni nella magacariocitopoiesi Il nostro laboratorio aderisce al progetto Europeo di standardizzazione della quantificazione dei trascritti associati a leucemie (http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/mrd_leukemia). Non essendo noti i meccanismi molecolari di molte leucemie, né i pathways di trasduzione del segnale di molte leucemie, (quali quelle coinvolgenti la banda 3q26) e possibile ipotizzare l uso di attrezzature e metodiche, quali i microarray, per lo studio di espressione aberrante dei trascritti neoplastici. Qualora sia possibile identificare con microarray nuovi trascritti di fusione, questi possono essere ulteriormente ricercati e studiati con metodiche di Southern blot e clonati successivamente mediante RACE-PCR. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 13

15 Dallo studio di espressione genica associata alle leucemie, possono derivare importanti informazioni utili per indirizzare a terapie intelligenti e specifiche contro il meccanismo leucemogenetico, terapie meno tossiche per l organismo e l emopoiesi non neoplastica. LA TERAPIA - I FARMACI Il tentativo effettuato in questi anni di modellare i classici schemi di terapia antiblastica usati nel bambino e nell'adulto, sostanzialmente operando una riduzione o una ottimizzazione delle dosi e' in linea generale fallito. Infatti, si e' ottenuto un numero discreto/soddisfacente di remissioni complete, seguite però in tempi brevi dalla ripresa della malattia con successiva fase di resistenza. Quando invece si e' deciso di applicare protocolli intensivi,simili a quelli dell' adulto, il limite e' risultato il netto incremento della tossicità. Considerati quindi i limiti posti alla terapia convenzionale e la maggiore frequenza di resistenze farmacologiche si rende necessario studiare nuovi approcci che possano consentire un trattamento soddisfacente di queste patologie all'età indicata. In particolare sono in via di sviluppo tecnologie che sfruttano la coniugazione di anticorpi monoclonali con farmaci citotossici. Questo tipo di combinazioni presenta un esempio di particolare successo nel Rituximab attualmente impiegato nelle malattie linfoproliferative resistenti. Combinazioni simili sono già state preparate e sono in corso di applicazione anche per quanto riguarda le leucemie acute. L ottimizzazione dell uso di questi prodotti è però ancora in corso; in particolare, non è al momento nota la collocazione ideale nella storia terapeutica delle leucemie acute, nè le eventuali combinazioni con altri prodotti terapeutici. Un altra via alternativa è costituita dall impiego in vivo di farmaci in grado di controllare la proliferazione delle cellule leucemiche e di favorirne la differenziazione. In questo settore numerosi sono stati i tentativi in vitro portati a termine con successo, almeno su qualche stipite cellulare leucemico; non si può dire lo stesso invece per i trattamenti in vivo, caratterizzati per ora da risposte adeguate solo nel caso della leucemia acuta promielocitica. E possibile però che combinazioni di differenzianti possano essere efficaci anche in sottotipi diversi dalla promielocitica. Infine, la capacità angiogenetica, fenomeno documentato per la maggior parte dei tumori solidi, presenta molto probabilmente importanza anche nel caso delle leucemie acute. Gli studi pubblicati sono però ancora su casistiche di piccole dimensioni e con correlazioni cliniche incomplete; in particolare, mancano riferimenti relativi alle forme dell anziano. Si ritiene quindi che ci sia ampio spazio per caratterizzare il reale ruolo dei fenomeni angiogenetici nel condizionare la risposta alla terapia e il decorso delle leucemie acute nell anziano. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 14

16 STRATEGIA ED OBIETTIVI STRATEGIA La strategia globale del progetto punta a creare una sinergia tra i laboratori dell Istituto Seragnoli in particolare quello di biologia cellulare e quello di biologia molecolare che si occupano di ricerca di base e pre-clinica e che sviluppano piattaforme diagnostico-terapeutiche e le strutture assistenziali cliniche dello stesso Istituto che provvedono alla validazione ed applicabilità delle stesse su campioni biologici dei pazienti affetti da neoplasie ematologiche all'interno di protocolli clinici nazionali ed internazionali. Verranno garantiti l aggiornamento dei database con le informazioni cliniche dei pazienti che rappresentano un importante prerequisito per la valutazione dell impatto clinico-applicativo dei dati ottenuti e quindi per il possibile trasferimento alla realtà produttiva dei dati ottenuti. Le strategie di sviluppo del "laboratorio", anche in considerazione della piattaforma tecnologica che è alla base del progetto, mirano a potenziare la posizione del laboratorio nel mercato della ricerca e dell innovazione tecnologica nel campo della Biologia e della Medicina Molecolare, nella realtà territoriale di BOLOGNA, nella Regione Emilia Romagna e sul territorio nazionale. Strategia del progetto e quella di identificare alcune piattaforme tecnologiche basate sullo studio del polimorfismo genico e di espressione per caratterizzare le leucemie: identificare traslocazioni e geni di fusione ad essi associate e meccanismi molecolari con particolare riguardo alle leucemie PH+.. OBIETTIVI GENERALI Le strategie di cui al punto sopra mirano ad alcuni specifici obiettivi, quali: - collocazione dell Istituto inteso come Istituto di Eccellenza nell'ambito della comunità scientifica bolognese, regionale, nazionale ed internazionale, attraverso i risultati della ricerca svolta; - costituzione di un patrimonio di metodologie, know-how e servizi, all'interno dei quali inquadrare i processi di formazione e della cura delle emopatie; - interazione con soggetti privati per la condivisione di tecnologie (e la eventuale creazione di spin off); Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 15

17 - addestramento di personale qualificato secondo adeguati standard internazionali. OBIETTIVI PARTICOLARI Gli obiettivi delle attività di ricerca saranno i seguenti: LEUCEMIE 1) Il lavoro in questa fase verrà svolto ed indirizzato allo studio delle leucemie linfoblastiche acute (LLA). Si cercherà di sviluppare un assay (Gene chip) di tipizzazione molecolare delle alterazioni geniche ed una classificazione su base genetica con valenza prognostica per la stratificazione del rischio di recidiva. 2) Verranno analizzati mediante reazione di RT-PCR l analisi dell espressione di trascritti ibridi in particolare del trascritto BCR-ABL, in cellule leucemiche e relative correlazioni clinico-prognostiche. 3) Verrà standardizzata una tipizzazione molecolare e ed eseguita una correlazione dei dati molecolari con i dati di risposta alla terapia dei pazienti espressi come sopravvivenza totale, sopravvivenza libera da malattia, e percentuale di remissione. 4) Lo studio sara svolto sui campioni biologici di tutti i pazienti arruolati nei protocolli sperimentali di terapia con un inibitore delle tirosin kinasi di classe III proposto dal gruppo cooperatore italiano per lo studio della leucemia mieloide cronica (ICSG on CML) e network LeukemiaNet (Framework IV). Contemporaneamente saranno attivati e promossi tre protocolli clinici sperimentali con dosi differenti di Imatinib al fine di incrementare la percentuale di pazienti che ottengono una risposta citogenetica completa duratura. 5) Sarà ideato e costruito un protocollo di identificazione di mutazioni puntiformi sul gene ABL durante terapia con imatinib mediante DHPLC (Transgenomic) e applicato ai trias clinici attualmente attivi del ICSG-CML e dell Istituto Seragnoli. L identificazione di meccanismi di farmacoresistenza all imatinib permettera l arruolamento a tre protocolli clinici sperimentali attivabili nel di associazione dell imatinib con 1) FTI (R o Zarnestra); 2) con Zoledronato; 3) con PS341 (Bortezomib). 6) Vi sarà la messa a punto di un test genomico per la diagnosi citogenetica e molecolare delle alterazioni genetiche note che coinvolgono delle tirosino-chinasi nelle malattie mieloproliferative BCR- ABL negative. Contemporaneamente sara esteso ed applicato il trial clinico di terapia delle CML ph- PDGFRbeta + e PDGFRalpha * con imatinib (HESAT08) dell Istituto. 7) Verrà messo a punto un assay ed un accurato screening dei difetti molecolari citati. 8) Verranno identificati marcatori che potranno identificare i pazienti affetti da AML candidati ad una terapia molecolare mirata anti CD33 (Mylotarg) e altri. 9) Identificazione di un test in vitro in grado di predire la risposta clinica a differenti agenti diretti verso bersagli molecolari specifici. 10) ) Identificazione di nuove lesioni molecolari implicate nella patogenesi di malattie simili LMC BCR- Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 16

18 ABL negativa come nuovi bersagli per la terapia molecolare, con particolare riferimento a PDGFRalpha. 11) Un altro approccio efficace che verrà sfruttato in parallelo, si baserà su una specifica PCR quantitativa Real Time che permetterà una valutazione simultanea dei livelli di espressione di geni. 12) La sregolata attività TK verrà identificata mediante un approccio di proteomica. 13) Nelle HES il nostro obiettivo è di eseguire un analisi molecolare e consisterà in uno screening delle chinasi sensibili all Imatinib. 14) Per l identificazione di vie anomale probabilmente attivate nelle cellule di pazienti affetti da HES si utilizzerà un approccio basato su microarrays e di proteomica, 15) L RNA interference (RNAi), è un efficace strategia per sopprimere l espressione di specifici geni rendendo possibile lo studio della funzione genica tanto in cellule in coltura quanto nell intero organismo. L RNAi sarà usato per indurre il silenziamento di enzimi coinvolti nell epigenetica. 16) Determinazione del livello di metilazione del DNA 17) Nella CML e nelle altre patologie ematologiche verrà inoltre studiato ed applicato dai laboratori di Udine e Bologna la determinazione del polimorfismo G(-248)A sul promotore BAX in BCLL. 18) Dal momento che il rischio di ricaduta sia nelle ALL che nelle CML/AML e associato a singoli polimorfismi nucleotidici (SNPs) di enzimi che metabolizzano farmaci antiblastici quali quelli associate al citocromo P450 ci proponiamo di ideare un gene chip per studiare questo polimorfismo con particolare interesse per le associazioni con il SNPs CYP3A4*1B, CYP3A5*3 and CYP3A5*6.. Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 17

19 DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FASI DELLA RICERCA 1) Il lavoro in una prima fase verrà svolto ed indirizzato allo studio delle leucemie linfoblastiche acute (LLA) che nonostante una sostanziale omogeneità morfologica e del quadro clinico-ematologico iniziale, mostrano una notevole eterogeneità nella risposta alle terapie attualmente utilizzate. Si cercherà di sviluppare un assay (Gene chip) di tipizzazione molecolare delle alterazioni geniche ed una classificazione su base genetica con valenza prognostica per la stratificazione del rischio di recidiva. I risultati ottenuti consentiranno una migliore definizione delle classi di rischio di recidiva nei pazienti affetti da LLA e di programmare quindi terapie personalizzate per le differenti classi di pazienti affetti da questo tipo di patologia. Metteremo a punto un genomic microarray analisys per diversi geni coinvolti nella difesa dell organismo (HLA) e nella farmacodinamica delle ALL: P450 (CYP) Thiopurine methyltransferase; Glutathione S-transferases (GSTs) GSTM1, GSTT1, Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR); NAD(P)H: quinone oxidoreductase (NQO1) thymidylate synthase, ATP-binding cassette (ABC) family of membrane transporters; P-glycoprotein (PGP) e i geni MRPs. 2) L analisi dell espressione di trascritti ibridi in cellule leucemiche e relative correlazioni clinicoprognostiche verranno analizzati mediante reazione di RT-PCR: la tecnica sviluppata è basata sulla "Real time" PCR ed è stata applicata alla quantizzazione dei vari tipi di mrna trascritti dal gene di fusione BCR/ABL, e ad altri trascritti presenti nelle cellule Ph+. L espressione del gene neoplastico sarà confrontata con l espressione di geni housekeeping. Il lavoro sperimentale consentirà di identificare differenti geni (beta-2 Microglobulina (B2M), Beta Glucoronidasi (GUS), e Abelson) il cui livello di espressione si mostra costante in differenti tessuti, compreso il midollo osseo ed il sangue. 3) Verrà standardizzata una tipizzazione molecolare mediante tecniche di amplificazione RT-PCR degli mrna specifici trascritti dai geni ibridi di fusione BCR/ABL P210 e P190, E2A/PBX1 e MLL/AF4 ed eseguita una correlazione dei dati molecolari con i dati di risposta alla terapia dei pazienti espressi come sopravvivenza totale, sopravvivenza libera da malattia, e percentuale di remissione. 4) Analoghi studi verranno eseguiti sui malati affetti da leucemia mieloide cronica. Lo studio sarà svolto sui campioni biologici di tutti i pazienti arruolati nei protocolli sperimentali di terapia con un inibitore delle tirosin kinasi di classe III, proposto dal gruppo cooperatore italiano per lo studio della leucemia Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 18

20 mieloide cronica (ICSG on CML) e network Leukemia Net (Framework IV). Lo studio è reso fattibile dalla ampia genoteca, celluloteca ed RNA teca di tutti i campioni biologici ( circa) prelevati dai pazienti centralizzati in tre laboratori italiani (UR Bologna, Napoli/Pane e Torino/Saglio) partecipanti al progetto. Per l identificazione di vie anomale probabilmente attivate nelle cellule di pazienti affetti da CML si utilizzerà un approccio basato su microarrays e di proteomica.. L analisi in microarrays sara condotta su 5 microgrammi di RNA totale (o 100 nanogrammi, usando il protocollo small sample ) retrotrascritti a cdna con Affymetrix One-Cycle or Two-Cycle cdna Synthesis. Il crna con GeneChip Expression 3'-Amplification Reagents for IVT Labeling. Il crna marcato verra purificato mediante GeneChip Sample Cleanup Module Per tutti i campioni verra frammentata una quota di crna pari a 15 microgrammi, che sara controllata mediante corsa elettroforetica su microchip (Agilent RNA 6000 Nano LabChip kit) usando l Agilent 2100 bioanalyzer. I campioni verranno ibridizzati su arrays Affymetrix per 16 ore. Lo scanner Affymetrix GeneChip Scanner 3000e' in dotazione all'u.r di Bologna-Modena.Softwares Affymetrix GCOS; Analisi dei dati, piattaforme Affymetrix Micro D; Affymetrix Data Mining Tool (DMT) 3.0. Collegamenti ipertestuali con dabases genomici in Internet (e.g., GenBank, Swiss Prot, OMIM, and GeneCards). I dati generati da GCOS (anche i files nativi di immagine) potranno essere caricati su altri software di analisi come:dchip; R(Bioconductor); SAM;PAM; GeneSpring (Silicon Genetics); L'UR di Bologna-Modena (www.xlab.unimo.it) inoltre è in grado di fornire una piattaforma web (www.xlab.unimo.it/xdb) di database (SQL), attraverso la quale è possibile gestire progetti sperimentali, condividere dati sperimentali gestire annotazioni funzionali del genoma sia di tipo personale (derivanti da esperimenti), sia provenienti da tutti i databases pubblici. Il recente upgrade della piattaforma Affymetrix consente attualmente al nostro laboratori di effettuare studi di espressione genica anche sui nuovi GeneChip di espressione da circa 50,000 geni nonché di eseguire studi genomici sul DNA tra i quali SNPs (100,000 SNPs per esperimento su un unico Chip), custom resequencing (60 KB su un unico chip). 5) Sarà ideato e costruito un protocollo di identificazione di mutazioni puntiformi sul gene ABL durante terapia con imatinib mediante DHPLC transgenomic. Parte del protocollo è già stata standardizzata e la stiamo applicando ai campioni leucemici per la validazione. È stata anche preparata una seconda fase automatizzata e robotizzata. 6) Messa a punto di un test genomico per la diagnosi citogenetica e molecolare delle alterazioni genetiche note, che coinvolgono delle tirosino-chinasi nelle malattie mieloproliferative BCR-ABL negative. 7) Recentemente differenti chinasi sono state identificate per il loro coinvolgimento nella patogenesi delle CMPD. Queste tirosino-chinasi sono costitutivamente attivate attraverso traslocazioni o mutazioni puntiformi e la loro identificazione fornisce al paziente il razionale per una terapia mirata e inoltre fornisce ulteriori informazioni sulla patogenesi di un particolare difetto. L obiettivo specifico di questa task è pertanto la messa a punto di un assay ed un accurato screening dei difetti molecolari citati. I Istituto di Ematologia ed Oncologia Medica L.e A. Seràgnoli, University of Bologna 19

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