Lezioni sui linfomi. A cura di Stefano Aldo Pileri. Dedicate ai miei Maestri Professori Antonio Maria Mancini ed Alessandro Piccaluga

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1 Lezioni sui linfomi A cura di Stefano Aldo Pileri Dedicate ai miei Maestri Professori Antonio Maria Mancini ed Alessandro Piccaluga

2 Prof. Dr. Dr. h.c. Karl Lennert

3 LINFOMI: NEOPLASIE LINFOIDI I linfomi sono al terzo posto in ordine di incidenza fra le neoplasie al Mondo. Si distinguono in non-hodgkiniani e di Hodgkin. I primi hanno riconosciuto nel corso degli ultimi 20 anni un aumento esponenziale della loro incidenza; tale tendenza è destinata a mantenersi o, più probabilmente, a subire un ulteriore progressione nel prossimo mezzo secolo. I secondi, invece, sono rimasti stabili, con un tipico andamento stagionale. Al momento, il rapporto fra le forme non-hodgkiniane ed Hodgkiniane è pari ad 10/1.

4 MO B T LN Timo T Organi periferici Milza

5 Classificazione dei linfomi

6 Early 90s: no communication between Europe and USA with detriment for patients and science

7 Realizzata per consenso a due meeting organizzati a: Berlino, Aprile 1993, Boston, Maggio Pubblicata su: Blood 1994, 84:

8

9 La diagnosi di un linfoma è un processo integrato Campione tessuto cellule Informazioni cliniche Controparte normale Quadri morfologici Architettura Citologia Fenotipo Citogenetica Biologia molecolare DIAGNOSI Specifica entità Prognosi Bersagli terapeutici CD19 TC-> CD43 PE ->

10 2001

11 2008

12

13 10/ copie 01/ copie 09/ copie 09/ copie

14 Updated web-based version in 2015 Dear Steve: We are pleased to inform you that Dr Wild agreed to your proposals. We are now preparing documents for the Agreement for Performance of Work (APW) with Dr Vardiman, which will be sent to him shortly. Materials including text, figures, tables and references will be also ready by September 15. With best regards, Hiroko

15 (. ). 26/139

16 La REAL/WHO Classification non prevede alcuna indicazione circa il grado di malignità. Infatti, i criteri istologici (quali le dimensioni cellulari), utilizzati dalle usuali classificazioni anatomo-patologiche, non costituiscono dei reali indicatori prognostici.

17 Linfomi a basso grado! 1,0 0,8 * Probabilty 0,6 0,4 0,2 * * CLL MALT Follicular MCL DLBCL Burkitt 0, Years

18 Linfomi indolenti Corrispondono a quelle neoplasie linfoidi la cui sopravvivenza è valutabile in anni, indipendentemente dal fatto che siano o meno trattate. Longo DL. The REAL Classification of lymphoid neoplasms: one clinician s view. In Rosenberg S (ed): PPO Updates. Philadelphia: Lippincott 1995; 9:1-12.

19 Linfomi/leucemie disseminate leucemia linfatica cronica B/linfoma a piccoli linfociti B immunocitoma leucemia a tricoleucociti linfoma splenico della zona marginale plasmocitoma/mieloma multiplo leucemia a linfociti ampi e granulati (T) Linfomi extranodali linfoma della zona marginale di tipo MALT Linfomi nodali linfoma follicolare linfoma della zona marginale

20 Un aspetto comune a molti tipi di linfoma indolente è la tendenza a subire una trasformazione blastica, con accelerazione del quadro clinico.

21 Linfoma aggressivo Termine utilizzato per indicare quei tumori linfoidi che esordiscono con una sintomatologia importante e che - non trattati - riconoscono una rapida progressione. Longo DL. The REAL Classification of lymphoid neoplasms: one clinician s view. In Rosenberg S (ed): PPO Updates. Philadelphia: Lippincott 1995; 9:1-12.

22 NEOPLASIE DEI LINFOCITI B Dei precursori: Delle cellule mature/periferiche: NEOPLASIE DEI LINFOCITI T/NK Dei precursori: Delle cellule mature/periferiche: leucemia/linfoma linfoblastico linfoma mantellare linfoma follicolare di III grado linfoma a grandi cellule B, diffuso linfoma/leucemia di Burkitt leucemia/linfoma linfoblastico leucemia prolinfocitica T leucemia a cellule NK, aggressiva leucemia/linfoma T dell adulto (HTLV-1 + ) linfoma T/NK di tipo nasale linfoma T enteropatico linfoma T epatosplenico linfoma T simil-panniculitico linfoma T, NAS linfoma T angioimmunoblastico linfoma a grandi cellule anaplastiche

23 ZINZANI (Blood, 1999) LNH-AG ANZIANO VNCOP-B: OS ( ) 100 % Mesi Istituto Seràgnoli - Bologna

24 Principi di patobiologia

25 Imprints Wright, cytochemistry, immunocytochemistry Fresh No FNA Electron microscopy Cell cultures Cryopreservation Routine techniques Vaccine Cell suspensions Immunohistochemistry, molecular biology, genomics, proteomics Morphologic analysis, immunohistochemistry, molecular biology FACS analysis, cyto-genetics, molecular biology

26

27 Mantle cell Lymphoma VERGIN B- CELLS BCL-1 MALT lymphoma API2/MALT MARGINAL ZONE GERMINAL CENTRE Lympho-plasmacytic lymphoma PAX-5 HHV-8 Primary effusion PLASMACELL MANTLE MEMORY B- CELL Follicular Lymphoma BCL-2 BCL-6 Diffuse large B-cell lymphoma p53? c-myc p53 Burkitt s Lymphoma

28 Linfoma follicolare

29 CD10 Barcus ME et al. Appl Immunohistochem Molecul Morphol 4:263-6, 2000.

30 Bcl-6 Flenghi L et al. Am J Pathol 148: , Raible MD et al. Am J Clin Pathol 112:101-7, 1999.

31 CD20 Drug CD20 C Rituximab

32 Genetica dei Tumori Perchè una cellula normale diviene tumorale? Perchè diverse cause (spesso sconosciute) inducono un danno al patrimonio genetico della cellula. Danno al DNA Virus, Tossici, Radiazioni Cellula Neoplastica Cellula normale Incapacità di riparare il danno

33 Meccanismi di linfomagenesi EZIOLOGIA PATOGENESI FENOTIPO? (~75 %) patogeni (15-20%) immunodeficit od autoimmunità (~5 %) pesticidi (0.5-1 %) Attivazione di proto-oncogeni Inattivazione di geni oncosoppressori proliferazione apoptosi differenziazione

34 Linfomi maligni e patogeni Helicobacter pylori MZL (MALT) dello stomaco Campylobacter jujeni IPSID Clamydia psittaci MZL (MALT) oculare Borrelia burgdorferi MZL (MALT) cutaneo HCV MLDUS, MZL nodale e splenico, HBV DLBCL HHV8 PEL, malattia di Castleman, EBV BL, CHL, DLBCL-E, LYG, CIAL, TLPD- C, N/K-TCL NT, PTLD, IDLD HTLV1 ATLL HIV

35 Modello di linfomagenesi infezione-correlato HTLV1 HCV EBV HHV-8 HP BB CP CJ R C traslocatione Espansione linfoide poli/oligoclonale Linfoma G L G L G L G L

36 Malattie auto-immuni e linfomagenesi Sindrome di Sjögren Tiroidite di Hashimoto Enteropatia da ipersensibilità al glutine Lupus erythematosus Artrite reumatoide

37 Linfomi maligni e farmaci

38 Linfomi maligni ed età Paediatric type FL Paediatric type NMZL Systemic EBV+ T-cell LPD of childhood Hydroa vaccineforme-like lymphoma EBV+ DLBCL of the elderly

39 Linfomi maligni e sede anatomica Splenic diffuse red pulp small BCL FL of the jejunum FL of the testis FL of the skin (EORTC) Primary cutaneous DLBCL, leg-type (EORTC) Primary cutaneous aggressive epidermotropic CD8+ cytotoxic PTCL (EORTC) Primary cutaneous gamma-delta PTCL (EORTC) Primary cutaneous small/medium CD4 positive PTCL (EORTC)

40 Meccanismi di linfomagenesi EZIOLOGIA PATOGENESI FENOTIPO? (~75 %) patogeni (15-20%) immunodeficit od autoimmunità (~5 %) pesticidi (0.5-1 %) Attivazione di proto-oncogeni Inattivazione di geni oncosoppressori proliferazione apoptosi differenziazione

41 Fattori genetici intrinseci congeniti

42 Fattori genetici intrinseci acquisiti

43

44 Traslocazione di un proto-oncogene R C R C proto-oncogene gene Ig Traslocazione cromosomiale R C Deregolazione trascrizionale del proto-oncogene

45 MBR breakpoint Chr. 18 Chr. 14 EX.1 EX2 EX.3 J H S m C m 5 3 Sense primer Anti-sense primer mcr breakpoint Chr. 18 Chr. 14 EX.1 EX2 EX.3 J H S m C m 5 3 Sense primer Anti-sense primer

46 BCL-2 & LF

47 t(11;14) > riarrangiamento del gene BCL1 > sovraespressione della Ciclina D1 nel linfoma mantellare Centro germinativo residuo

48 Produzione di un gene di fusione R C R C Traslocazione cromosomiale R C C Sintesi di una proteina ibrida

49 Translocations and fusion proteins involving the ALK gene Translocation FrequencyLocalization t(2;5)( p23 ;q35 ) 70-80% Cytoplasmic/Nuclear nucleolar t(1;2)( q25 ;p23 ) 10-20% Cytoplasmic t(2;3)( p23 ;q21 ) 2-5% Cytoplasmic inv(2)( p23 ;q35 ) 2-5% Cytoplasmic t(2;17)( p23 ;q23 ) 2-5% Cytoplasmic t(2;19)( p23 ;q13,1 ) - Cytoplasmic t(2;2)( p23 ;q11-13 )? - Nuclear or inv(2)( p23 ;q11-13 )? - membrane t(x;2)( q11-12 ;p23 ) - Membranous

50 Mutazioni di geni regolatori BCL6 gene point mutation +1144

51

52 Sovra-espressione di p53 da mutazioni puntiformi del gene corrispondente

53 Eventi epigenetici Metilazione Modificazione degli istoni

54

55 , 2007 Drosha and Dicer: RNaseIII-type nucleases; DGCR8 and TRBP/PACT: co-factors; mirisc: microrna-induced silencing complex.

56 Plasticità e dinamica delle popolazioni linfoidi Sono i linfomi entità stabili? Trans-differenziazione di elementi linfoidi T-LBL Langerhans Cell Hystiocytosis (Feldman et al, Lancet Oncol 2005; 6: 435) (Xie H et al Cell 2004)

57 The Human Genome Project A Global Perspective in Medicine

58 Micro-array Le tecniche basate sul principio dei microarray costituiscono il fronte avanzato della ricerca bio-medica, specie in campo oncologico. Array: allineamento, disposizione a schiera. Tipo di organizzazione del materiale biologico da analizzare.

59 Tecnologie basate sui microarray DNA microarray Valutazione qualitativa e quantitativa dell espressione dello mrna Valutazione dell intero genoma su di una singola chip Oligonucleotide microarray DNA microarray SNP array GCH array

60 Profilo di espressione genica

61 Unsupervised analysis (ordinamento gerarchico) Classificazione dei campioni sulla base delle similitudini del profilo di espressione genica. BL GC cells FL DLCL N/M cells CLL MCL HCL

62 Supervised analysis Confronto fra categorie predefinite. Germinal center Naive Memory Supervised Analysis 334 genes

63 LIMITAZIONE La quasi totalità degli studi di profilo di espressione genica sono stati condotti usando tessuti criopreservati

64 Gene expression analysis DASL Assay Pool probe These probes span about 50 bases, making it possible to profile partially degraded RNA.

65

66 Profilo di espressione mirna

67

68

69 Sequenziamento massivo del genoma

70 13 anni 3 miliardi di dollari 7 giorni 2800 Euro

71 Platforms Instrument Company Year Feature generation Sequencing by synthesis Read lenght Mappable Accuracy data /run 454 Roche 2004 Emulsion PCR Polymerase (pyrosequencing) 450 bp 0.5Gb >99.5% HiSeq Illumina 2010 Bridge PCR Polymerase (reversibile terminators) 100 bp Gb 99.9% SOLiD Applied Biosystems 2007 Emulsion PCR Ligase (octamers) 50 bp Gb 99.9%

72 Applications Category Complete genome resequencing Targeted genomic resequencing Paired-end sequencing RNAseq (transcriptome seq) De novo assembly Small RNA sequencing Metagenomics ChIP seq Epigenomics Application Mutation, SNP. discovery in individual genomes. Detection of human genomic variation Targeted mutation and SNP discovery. Population genetics. Discovery of inherited and acquired structural variations Quantification of gene expression and alternative splicing. Discovery of SNP and somatic mutations. Discovery of structural variants. Sequencing and assembly of unknown genomes mirna profiling Discovery and characterization of complex enviromental or human microbial communities. Genome-wide mapping of protein-dna interactions Pattern of methylation in genomic DNA

73

74 Bioinformatic workflow Next Generation Sequencing Image Analysis, Sequences Extraction and Quality Control (CASAVA, FastQC) Sequence Alignment (Bowtie, BWA, Maq) Whole Exome Sequencing RNA Sequencing Genotype and SNP calling (GATK, Samtools) Alternative Splicing Isoforms and Fusion Detection (Tophat, FusionSeq, Defuse) Structural Variants (CNV) Detection (RDXplorer) Gene Expression Profile (Cufflinks, Cuffdiff)

75 RNA-Seq Applications GENE EXPRESSION SNPs- InDels CHIMERIC TRANSCRIPTS NOVEL ISOFORMS ALTERNATIVE SPLICING NOVEL TRANSCRIPTS

76 Fusion detection results, According to bio-informatic analysis

77 The coding genome of splenic marginal zone lymphoma: activation of NOTCH2 and other pathways regulating marginal zone development. Rossi D, Trifonov V, Fangazio M, Bruscaggin A, Rasi S, Spina V, Monti S, Vaisitti T, Arruga F, Famà R, Ciardullo C, Greco M, Cresta S, Piranda D, Holmes A, Fabbri G, Messina M, Rinaldi A, Wang J, Agostinelli C, Piccaluga PP, Lucioni M, Tabbò F, Serra R, Franceschetti S, Deambrogi C, Daniele G, Gattei V, Marasca R, Facchetti F, Arcaini L, Inghirami G, Bertoni F, Pileri SA, Deaglio S, Foà R, Dalla-Favera R, Pasqualucci L, Rabadan R, and Gaidano G. J Exp. Med., E-pub ahead of print, 2012.

78 ALK - ALCL 8 different genetic lesions detected by RNAseq

79 Profilo di espressione proteica

80 Tecnologie basate sui microarray Micro-array tissutale ( tissue chip ) Fino a 1000 campioni diversi sullo stessa vetrino Analisi in situ ad altissima resa Kononen et al. Nat Med. 1998; 4:844-7

81

82 Dai protocolli rigidi applicati a tutti i Pazienti alla.

83 Tailored therapy

84

85

86 PTCL: overall survival Control Dauno 5mM Imatinib 1 mm

87 Genes differentially expressed in PTCL/NOS and normal T- cells (training set + test set) Training set Test set CD4-CD8-DR+ PDGFRa TK inhibitors Supervised analysis 155 genes: 91 down-regulated and 64 up-regulated

88 TCL subtype cases included in TMA PDGFRa p-pdgfra PDGF-A PDGF-B PTCL/NOS / /110 74/86 85/92 AITL 45 36/36 21/22 20/23 23/24 ALCL ALK /16 10/12 13/13 9/12 ALCL ALK /10 8/10 6/6 7/9 MF 28 28/28 28/28 5/5 7/8 EATL 5 5/5 ne 3/3 2/2 SPTCL 1 1/1 ne ne 0/1 TCL subtype PDGFRβ PTCL/NOS 4*/38 AITL 0/15 ALCL ALK + 9/9 ALCL ALK - 15/20

89

90 Imatinib reduces cell viability, by inducing cell cycle arrest and apoptosis in PTCL/NOS primary cells Control Sugen 0,3 mm Sugen 1 mm Medium Medium + Imatinib 1 mm Annexin V: t48h Control Imatinib G1 S G2-M BrdUrd proliferation assay; 48 h

91

92 Conditional deletion of JunB and cjun in transgenic mice in which the human NPM/ALK was put under the control of the murine CD4 promoter Lymphoma development

93 Patient suffering from NPM-ALK+, JunB+, cjun+, PDGFRA+, PDGFRB+, c-kit- ALCL refractory to conventional first line chemotherapy and relapsed after autologous stem cell transplantation. Complete clinical remission with reduced tumor markers and normalized PDGFB levels within days of imatinib therapy. Patient free of ALCL since 20 months after initiation of imatinib.

94 La diagnosi di linfoma Quale approccio? Profonda conoscenza delle singole entità Tecnologia multi-disciplinare Integrazione di tutti i dati da parte del patologo Keep an Open Mind

95 Truth is rarely pure and never simple. Oscar Wilde, The importance of being Earnest

96 Salvador Dalì, 1975 A. Lincoln

97

98 PP Piccaluga, E Sabattini, C Agostinelli, F Bacci, F Fuligni, C Sagramoso, M Rossi, S Righi, A Gazzola, T Sista, M Piccioli, MR Sapienza, A Laginestra, C Mannu, F Sandri, P Artioli, G De Biase, G Da Pozzo, C Tigrini, M Monari and D Bignami

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